Đây là nguồn luận văn được tác giả sư tầm tư nhiều nguồn thư viện đáng tin cậy. Luận văn chứa đầy đủ thông tin về lý thuyết cũng như số liệu đều chuẩn xác với tên đề tài nghiên cứu. Bố cục Luận văn được áp dụng theo chuẩn về hình thức lẫn nội dung.
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ QUỲNH ANH NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA PROSTAGLANDIN ĐẾN CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ, SINH HÓA MÁU VÀ KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO HẠT Ở TẦNG TRƯỚC TẾ BÀO TRỨNG GÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ QUỲNH ANH NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA PROSTAGLANDIN ĐẾN CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ, SINH HÓA MÁU VÀ KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO HẠT Ở TẦNG TRƯỚC TẾ BÀO TRỨNG GÀ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS TỪ QUANG TÂN THÁI NGUYÊN - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, công trình nghiên cứu Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố, sử dụng để bảo vệ học vị Các thông tin, tài liệu trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, ngày 15 tháng năm 2014 Tác giả Nguyễn Thị Quỳnh Anh i LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận văn này, nỗ lực thân, nhận giúp đỡ quý báu, bảo tận tình thầy hướng dẫn TS Từ Quang Tân suốt trình thực luận văn Nhân dịp hoàn thành luận văn xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc thầy hướng dẫn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành quan tâm giúp đỡ thầy PGS.TS Lê Ngọc Công toàn thể thầy cô giáo, cán bộ, nhân viên khoa Sinh - KTNN, khoa sau đại học - Đại học sư phạm Thái Nguyên giúp đỡ trình thực đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo cán viên chức đơn vị:Phòng phân tích sinh hóa - Phòng khám Đa khoa Trung tâm Thái Nguyên, Phòng thí nghiệm Sinh lý người động vật, Khoa SinhKTNN - Trường Đại học Sư phạm - Đai học Thái Nguyên, Phòng thí nghiệm công nghệ gen động vật - Đại học Chiết Giang Trung Quốc tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ nhiệt tình cho trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp, người thân tạo điều kiện, động viên trình thực đề tài hoàn thành luận văn Trong trình thực luận văndo hạn chế thời gian, kinh phí trình độ chuyên môn nên không tránh khỏi sai sót Rất mong nhận ý kiến đóng góp quý báu thầy cô giáo, nhà khoa học bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 15 tháng năm 2014 Tác giả Nguyễn Thị Quỳnh Anh ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CS : Cộng EGF : Epidermal growth factor Hb : Hemoglobin LIF : Leukemia inhibitory factor LWF : Tế bào trứng màu trắng lớn LYF : Tế bào trứng màu vàng lớn PG : Protaglandin SCF : Stem cell factor SWF : Tế bào trứng màu trắng nhỏ SYF : Tế bào trứng màu vàng nhỏ iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện nay, kỹ thuật chọn nhân giống vật nuôi ngày quan tâm đầu tư nghiên cứu nhằm góp phần nâng cao suất, chất lượng sản phẩm như: kỹ thuật chuyển gen, sử sụng phép lai kinh tế, hay cải tiến thức ăn dinh dưỡng… Một biện pháp kỹ thuật áp dụng nhằm kéo dài thời gian cho sữa Trâu, Bò hay thời gian sinh sản gia cầm sử dụng hocmon nội tiết Để kéo dài thời gian sinh sản hay rút ngắn thời gian nghỉ đẻ chu kỳ gia cầm đòi hỏi phải hiểu, nắm rõ đặc điểm sinh lý sinh sản sinh lý nội tiết chúng Hệ thống nội tiết động vật nói chung gia cầm nói riêng hệ thống phức tạp, có chức sản xuất loại hocmon nhằm điều tiết trình sinh trưởng, sinh sản… Các quan nội tiết cung cấp lượng hocmon đong đếm kỹ lưỡng trước đưa vào hệ thống tuần hoàn, theo máu đến phận khác thể nhằm kiểm soát điều tiết chức Một số hocmon số quan chức (không phải tuyến) tiết như: quan sinh sản (ở đực cái), quan tiết sữa…, chúng hoạt động quan tiết Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu sử dụng loại hocmon điều khiển khả sinh gia cầm, đặc biệt gà mái Một loại hocmon có ảnh hưởng rõ rệt đến khả sinh sản gia cầm phải kể đến hocmon prostaglandin (PG) PG acid béo không bão hòa mô, sinh tổng hợp màng tế bào từ phospholipid, PG tổng hợp để dùng mô, nồng độ thấp khoảng vài nanogam/gam mô Chúng có mặt khắp nơi thể, phạm vi tác dụng sinh lý rộng lớn: có vai trò chất trung gian hóa học trình viêm cảm nhận đau, có tác dụng sinh lý rộng lớn mô riêng biệt nên chúng gọi hocmon tổ chức Xuất phát từ lý trên, chọn đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng PG đến tiêu sinh lý, sinh hóa máu khả sinh trưởng tế bào hạt tầng trước tế bào trứng gà” Mục tiêu nghiên cứu - Xác định mức độ ảnh hưởng PG đến tiêu sinh lý, sinh hóa máu; khả sinh trưởng tế bào hạt tầng trước chu kỳ phát triển tế bào trứng gà Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng PG đến tiêu sinh lý, sinh hoá máu: + Số lượng hồng cầu (triệu/mm3) + Số lượng bạch cầu (nghìn/mm3) + Hàm lượng huyết sắc tố (g%) + Protein toàn phần: Albumin huyết (g%) Globulin huyết (g%) Hệ số A/G huyết - Nghiên cứu ảnh hưởng PG đến khả sinh trưởng tế bào hạt tầng trước tế bào trứng gà 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp tách chiết lấy máu Trứng gà mang vào ấp nhiệt độ 38oC, độ ẩm 60% sau ngày ấp tiến hành tra dung dịch PG với nồng độ 10 ng/ml, tiếp tục ấp đến 18 ngày tiến hành lấy máu phân tích số sinh lý, sinh hóa máu 2.4.2 Phương pháp phân tich tiêu sinh lý, sinh hóa máu - Xác định lượng hồng cầu buồng đếm Newbauer [4] - Định lượng huyết sắc tố huyết sắc kế Shali [4] - Xác định protein tổng số huyết phản ứng Grornall [5] - Xác định tiểu phần protein huyết phương pháp điện di thạch aga 1% [12] 2.4.3 Phương pháp xử lý nuôi cấy nguyên tế bào trứng • Giống gà Hyline giai đoạn sinh sản đươc lựa chọn, sau giết mổ tiến hành mổ chọn tế bào trứng có đường kính: SWF 1-3 mm, LWF 3-5 mm, SYF 5-6 mm, LYF 6-9 mm [25] Loại bỏ dịch treo rửa dung nước muối sinh lý 0,9% diệt trùng, tiến hành nuôi cấy nuôi cấy 24 lỗ, lỗ nuôi cấy tế bào trứng tra 1ml dịch nuôi cấy M199 (Hyclone, Utah) bổ sung 10 μg/ml insulin, μg/ml transferrin and 3×10-8 M selenite (Sigma, St Louis, MO, USA) • Nhóm thí nghiệm bổ sung 10 ng/ml PG (Sigma, St Louis, MO, USA) • Sau 24 nuôi cấy, tế bào trứng se cố định dung dịch 4% formaldehyde, cố định tế bào trứng sau 24h tiến hành bước nghiên cứu cấu tạo tổ chức học 2.4.4 Phương pháp xử lý nuôi cấy tế bào hạt • Tế bào trứng màu vàng (SYF 5-6 mm) rửa loại bỏ dịch treo dung dịch M199 lạnh (Hyclone, Utah) Sau tiến hành bóc tách tế bào hạt khỏi màng tế bào trứng lòng đỏ trứng, lớp tế bào hạt se xử 27 lý phân tách thành tế bào đơn nồng độ 12.5 ug/ml collagenase Sau phân tách thành tế bào đơn tế bào hạt se nuôi cấy nuôi cấy 96 (Nunc, Denmark) với mật độ 5×104/lỗ, tra 200 μl M199 bổ sung 0,5% FCS (FCS, GIBCO BRL) • Tế bào nuôi cấy điều kiện 95% atmosphere, 5% CO nhiệt độ 39oC Sau 16h nuôi cấy, tế bào sinh sản bám chặt vào đáy nuôi cấy tiếp tục tiến hành đổi 0,5% FCS dung dịch ITS (nhóm đối chứng) bổ sung 10 μg/ml insulin, μg/ml transferrin and 3×10-8 M selenite (Sigma, St Louis, MO, USA) Nhóm thí nghiệm dùng PG (hãng Sigma) với nồng độ 0.1- 10 ng/ml (phương thức nuôi cấy độc lập) 2.4.5 Phương pháp hóa miễn dịch PCNA Các tế bào sau 24 nuôi cấy cố định 4% formaldehyte 30 phút để nhiệt độ phòng, sau xử lý 3% H2O2 làm kiệt chất nội sinh peroxidase Hóa miễn dịch học PCNA sử dụng theo phương pháp Jin cs (2010) [18] Sử dụng kháng thể đa dòng mouse anti-PCNA (Boster Co., Wuhan, China) Nhân tế bào dương tính se bắt mầu nâu nhạt Chỉ số PCNA- LI tính dựa tế bào có nhân màu nâu nhạt chia cho tổng số tế bào đếm ảnh chụp 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu Mỗi nhóm thí nghiệm lặp lại lần, nhóm nghiệm tra lỗ, lỗ tiến hành chụp ảnh Số liệu thu xử lý phần mền SAS phiên 6.12, với P 0,05) Sự tăng, giảm hàm lượng Hb không theo quy luật Cụ thể: nồng độ PG: 0.1-10-1,00 ng/ml hàm lượng Hb tương ứng là: 9,24 - 9,15 - 9,27 Theo Lê Văn Liễn cs, 2003 nghiên cứu đối tượng gà Ri, gà H’Mông, gà Tè, gà Tam Hoàng gà Kabir 15 tuần tuổi có số lượng hồng cầu tương ứng là: 2,35 - 2,78 - 1,86, 2,36 - 2,11 triệu/ mm3, số lượng bạch cầu tương ứng 24,05 - 28,30, 21,74 - 24,07 - 22,30 nghìn/mm3 [8] Số lượng hồng cầu phụ thuộc vào giống, tuổi, tính biệt, chế độ dinh dưỡng nhiệt độ môi trường Số lượng bạch cầu phụ thuộc vào thuộc vào tình hình bệnh tật, điều 29 kiện ngoại cảnh, nuôi dưỡng gương phản ánh tình hình sức khỏe gia cầm [8] Kết luận: PG không làm tăng số lượng hồng cầu, bạch cầu hàm lượng Hemoglobin máu Còn tăng giảm hàm lượng Hb không theo quy luật, tác động khác, không hoàn toàn chịu ảnh hưởng PG 3.1.2 Ảnh hưởng PG đến tiêu sinh hóa máu Albumin thành phần chủ yếu cấu tạo nên protein huyết Chính mà trình sinh trưởng phát triển động vật, hàm lượng tương đối hay ty lệ phần trăm albumin thường biến động đồng thời với hàm lượng protein huyết Để đánh giá ảnh hưởng PG đến tiêu sinh hóa máu, tiến hành phân tích tiêu hàm lượng protein tiểu phần protein huyết Kết thu được trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Ảnh hưởng PG đến hàm lượng protein tiểu phần protein huyết (gam/lít) Nồng độ (ng/ml) Chỉ tiêu Protein toàn phần Albumin αglobulin βglobulin γglobulin A/G 10 100 X ± mx Cv% X ± mx Cv% X ± mx Cv% X ± mx Cv% 50,44±1,48 8,75 51,50±3,25 7,45 52,40±1,60 7,10 51,20±1,32 7,70 20,20±1,30 11,31 21,33±1,50 11,20 21,35±1,30 11,17 21,27±2,34 12,26 5,850±2,20 14,00 5,92±0,37 13,05 5,96±0,32 14,28 5,80±0,35 12,90 6,60±0,32 13,25 7,08±0,25 13,50 7,28±0,31 14,30 7,20±0,20 13,65 8,15±0,50 12,20 8,45±0,35 12,70 8,40±0,50 14,25 8,25±0,45 13,25 0,980 0,992 0,993 1,000 Từ bảng kết cho thấy: hàm lượng protein toàn phần, hàm lượng albumin tiểu phần globulin nhóm đối chứng nhóm thí nghiệm sai khác rõ rệt (P>0,05) Theo Kalior Lê Khắc Thận (trích dẫn Trần Thanh Vân cs, 1997) protein huyết phụ thuộc vào hướng sản xuất giống, cường 30 độ đẻ Giống vịt hướng trứng có hàm lượng protein huyết cao vịt kiêm dụng vịt chuyên thịt [13] Nguyễn Thị Minh cs, 2001 γ-globulin giữ vai trò quan trọng, có chứa kháng thể huyết thanh, protein miễn kháng khả kháng bệnh gia cầm γ-globulin dùng tiêu chí để đánh giá khả kháng bệnh, thích nghi với điều kiện môi trường [9] Hệ số A/G chênh lệch đáng kể (P > 0,05), kết luận rằng: PG ảnh hưởng đến tiêu sinh hóa máu nói chung 3.1.3 Ảnh hưởng PG đến khả sinh sản tế bào hạt Tiến hành nuôi cấy tế bào hạt, sau nuôi cấy 16 giờ, quan sát thấy tế bào bám chặt vào đáy nuôi cấy, hình thành đường gân nhỏ, hình thái tròn nhỏ Tiếp tục tra PG nuôi cấy 24 giờ, quan sát thấy tế bào hạt bám chặt dàn khắp đáy nuôi cấy, xuất hình thái lập phương rõ, hình thành tầng đơn duỗi thẳng đan xen lẫn nhau, hình thái tế bào hạt rõ ràng, cảm quan hình khối tăng, số lượng tế bào hạt tăng mạnh (Hình 3.1) Bảng 3.3 Ảnh hưởng PG đến khả sinh sản tế bào hạt Chỉ tiêu đánh giá Số lượng tế bào/mm Hệ số PCNA (%) Nồng độ PG (ng/ml) 10 1214,54 1431,50 69,04 74,15 935,25 61,45 100 1285,45 70,41 Ảnh hưởng PG đến khả sinh sản tế bào hạt thể Biểu đồ 3.1 Hình 3.1 Tra PG nồng độ từ 0.1-100ng /ml thấy số lượng tế bào hạt lô thí nghiệm tăng so với lô đối chứng (p[...]... bớt bởi EGF [14] 23 A P McElroy và cs (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của FSH và LH đến sinh trưởng tế bào hạt ở tế bào trứng gia cầm [15] Yanmei Jin và cs nghiên cứu ảnh hưởng của PG đến sự phát triển tế bào trứng ở gà Cụ thể PG đã tham gia vào sự phát triển của tế bào hạt và màng tế bào (theca cell) đã tham gia vào quá trình lựa chọn nang trước khi rụng trứng [19] Ở Việt Nam, nghiên cứu ảnh hưởng của PG. .. PG trong điều khiển khả năng sinh sản ở gia cầm, đặc biệt là gà chưa được nghiên cứu Chính vì vậy, triển khi đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của PG đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gà là một hướng nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn cao 24 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Trứng gà Hyline sau khi được... đẩy sinh sản của tế bào hạt PGE1 thụ quan tồn tại trong SYF, FSH có thể hợp thành với PGE1 thúc đẩy khả năng sinh sản của tế bào trứng mầu vàng PGE1 thông qua hệ trung gian FSH của tế bào trong hệ thống truyền tín hiệu PKA thúc đẩy tế bào hạt biểu hiện khả năng phiên mã 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam Trên thế giới, các nghiên cứu về ảnh hưởng của hocmon đến khả năng sinh. .. phần của một mạng lưới phức tạp của các yếu tố tăng trưởng và thụ thể cùng nhau giúp đỡ để điều chỉnh sự phát triển của các tế bào EGF tạo ra từ các tế bào và sau đó được chọn lọc bởi chính các tế bào đó nhằm kích thích tăng trưởng riêng của tế bào, hoặc bởi các tế bào lân cận nhằm kích thích khả năng phân chia 17 Trong buồng trứng gà, chỉ có một nang nhỏ màu vàng (SYF) được chọn mỗi ngày từ các nang... thứ 4 (F4); tế bào trứng thứ 3 (F3); tế bào trứng thứ 2 (F2) và tế bào trứng thứ nhất (F1) 15 Hàng ngàn nang trứng có mặt trong buồng trứng gà lúc mới nở Tuy nhiên, chỉ có một vài trăm tế bào trứng se được lựa chọn cho sự rụng trứng của cơ thể gà trưởng thành Các cơ chế chính xác của việc lựa chọn một nang cụ thể cho sự rụng trứng chưa được nghiên cứu đến Buồng trứng gà chứa hàng ngàn nang trứng nhỏ... rụng trứng, ở gà mái quá trình rụng trứng diễn ra từ 2h đến 14h 1.2.4 Tác dụng của tế bào hạt trong quá trình phát dục của tế bào trứng Tế bào hạt (Granulosa cell) là một tế bào soma của dây sinh dục, có liên kết chặt che với sự phát triển của các giao tử cái (gọi là tế bào trứng hoặc trứng) trong buồng trứng của động vật 16 Hình 1.1 Tế bào hạt (Granulosa Cell) Tế bào hạt có trong nang buồng trứng. .. hay rụng trứng ở động vật có vú hay ở gia cầm… đều do tế bào hạt điều khiển và truyền đạt thông tin đến cơ quan đích [14, 21] 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát dục của tế bào trứng 1.2.5.1 Ảnh hưởng của Epidermal growth factor (EGF) Yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) là một yếu tố tăng trưởng kích thích tăng trưởng tế bào, tăng sinh và sự biệt hóa bằng cách gắn vào thụ thể (EGFR)... thủy, và sau đó trong quá trình phát triển của nang thì tế bào hạt tăng trưởng thành nhóm tế bào nhiều lớp xung quanh tế bào trứng trong nang trứng trước khi trứng rụng [20] Tế bào hạt có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát thông tin từ màng tế bào (theca cell) đến noãn bào (oocyte) và ngược lại mọi thông tin từ noãn bào (oocyte) đến màng tế bào (theca cell) Quá trình thoái hóa trứng, hay rụng trứng. .. gọi là noãn bào cấp I Thời kỳ sinh trưởng được chia thành thời kỳ sinh trưởng nhỏ và thời kỳ sinh trưởng lớn Thời kỳ sinh trưởng nhỏ kéo dài từ khi gà nở đến khi thành thục sinh dục Đầu tiên là sự phát trển chậm của noãn bào cấp I Ở gia cầm một ngày tuổi, đường kính noãn bào chỉ là 0,01 - 0,02mm, tới 45 ngày tuổi nó đạt 1mm Thời gian này, nhân vẫn nằm ở trung tâm tế bào trứng, sau đó tương bào được chuyển... nang nhỏ đến lớn bởi trình tự rụng trứng Quá trình phát triển được chia ra làm hai tầng: Tầng trước (Proliferation follicles) gồm: Tế bào trứng màu trắng nhỏ (SWF): 1-3 mm; tế bào trứng màu trắng lớn (LWF): 3-5 mm; tế bào trứng màu vàng nhỏ (SYF): 5-6 mm; tế bào trứng màu vàng lớn (LYF): 6-9 mm Tầng sau (Preovulatory follicles) gồm: Tế bào trứng thứ 6 (F6); tế bào trứng thứ 5 (F5); tế bào trứng thứ ... cứu ảnh hưởng PG đến tiêu sinh lý, sinh hóa máu khả sinh trưởng tế bào hạt tầng trước tế bào trứng gà Mục tiêu nghiên cứu - Xác định mức độ ảnh hưởng PG đến tiêu sinh lý, sinh hóa máu; khả sinh. .. (2004) nghiên cứu ảnh hưởng FSH LH đến sinh trưởng tế bào hạt tế bào trứng gia cầm [15] Yanmei Jin cs nghiên cứu ảnh hưởng PG đến phát triển tế bào trứng gà Cụ thể PG tham gia vào phát triển tế bào. .. Nghiên cứu ảnh hưởng PG đến tiêu sinh lý, sinh hóa máu khả sinh trưởng tế bào hạt tầng trước tế bào trứng gà hướng nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn cao 24 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN