ĐẶC ĐIỂM CỦA HỆ ENZYM PECTINASE

ĐẶC ĐIỂM CỦA HỆ ENZYM PECTINASE

LỜI GIỚI THIỆU

PHẦN I ĐẶC ĐIỂM CỦA HỆ ENZYM PECTINASE

I.Cơ chất pectin :[ I ]

Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid galacturonic qua các liên kết α–-1,4 glucoside Tùy thuộc nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử 800000-200000 Pectin hoà tan trong nước, ammoniac, dung dịch kiềm, carbonate natri và trong glycerine nóng Độ hoà tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hoá trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm

Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất khác nhau, trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu Các pectin tự nhiên định vị trong thành phần của tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polyssacharide và protein để tạo thành các protopectim không tan Có thể phân hủy để làm pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid Vì thế, các pectin tan thu nhận được là kết quả của sự phân hủy phân tử pectin không tan và chúng không đồng dạng với nhau

Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: pectin hoà tan, pectin acid và protopectin

Pectin hoà tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hoá bằng methanol Pectin được ester hoá cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đường có nồng độ 65% Enzyme pectinase tác động lên các hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không đồng dạng Cấu trúc hoá học cơ bản của pectin là α–– D-galacturonan hay α––D-galacturonoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ các đơn vị D-galactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu α -1,4) Mặt khác, mức độ oxy hoá trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất định các nhóm carboxyl bị ester hoá bởi các nhóm methoxyl Trong một số trường hợp, chẳng hạn trong pectin củ cải đường, có sự ester hoá giữa các nhóm carboxyl và các nhóm acetyl

Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hoá bằng methanol Pectinase là muối của pectinic acid Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi một đơn vị galacturonic acid Pectate là muối của pectic acid

Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hoá học phức tạp Trong pectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca2+ , Mg2+ , các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng pectin hoà tan

II Pectinase:[I]

Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín Những enzyme này vì vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả Việc kiểm soát các enzyme này trong cà chua chuyển gen là một ví dụ điển hình trong việc ứng dụng RNA đối mã để thao tác sự biểu hiện gen Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong quá trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả Việc kiểm soát hoạt động của enzyme pectinase cũng có thể kiểm soát được độ nhớt của sản phẩm Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng

• Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau Nếu thu từ nguồn VSV thì PH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5 Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30-40oC và bị vô hoạt ở 55-62oC Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Møg2+

• Polygalacturonase còn có tên gọi là poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết α–1,4-glycosid Các exo-PG (exo-poly 1,4-α-D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và endo-PG (endo-poly1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc và vi khuẩn Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ chất, enzym polygalacturonase được chia làm bốn loại:

Polymethylgalacturonase hay còn gọi là methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalactorunic acid đã được methoxyl hoá (tức là pectin) Enzyme này lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối mạch trong phân tử pectin, đó là endo-glucosidáe-polymethyl galacturonase kiểu I và exo-glucosidase-polymethylgalaturonase kiểu III

α-1,4-galacturonite-
Polygalacturonase, enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic, cũng được chia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II và exo-glucosidase-polygalacturonase kiểu

IV Enzyme endo-glucosidase-Polymethyl-galacturonase kiểu I là enzyme polymethylgalacturonase dịch hoá pectin có mức độ methyl hoá càng cao thì bị thủy phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả Trong dung dịch, khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này thường bị giảm Enzyme này rất phổ biến trong các VSV, đặc biệt là nấm mốc A niger, A, awamori

• Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester hoá Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4-α-D-galacturonide) lyase) và endo-PEL (endo-poly(1,4-α-D-galacturonic) lyase) đều tồn tại Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối

đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật

Ngoài ra còn có:

• Pectin-transeliminase hay còn được gọi là poly α–-1,4-galaturonite –methylesteglucanoliase, là enyme tác dụng trên pectin và pectinic acid

• Polygalactorunate-transeliminase còn được gọi là poly α -1,4D-galaturonite –glucanoliase, là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid

• Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester hoá Tất cả các PNL đều là endo-enzyme

III Đặc điểm của các pectinase từ các nguồn khác nhau:[ I ]

1 Pectinesterase:

Bên cạnh pectineaterase (PE) VSV, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enyme PE Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng

pH hơi kiềm Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme

a.Đặc điểm của pectineaterase thực vật: Cà chua chứa ít nhất hai loại PE Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình chín Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống, nhưng PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái chín PE2 có khối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7,6 Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67oC Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M, theo thứ tự

PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu tại pH gần 8 Polygalacturonic acid, sản phẩm hình thành do quá trình để methyl hoá, là một chất ức chế cạnh tranh

Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE Cả hai có cùng khối lượng phân tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3 Các enzyme này hoạt động ở pH tối đa là 7,5 Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dịch về 6,0 Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose, maltose và galactose

PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối lượng phân tử 36,kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và $11,0, theo thứ tự pH tối ưu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0

Thịt quả cũng chứa hai isoenzymem, một trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi bị tác động của protease Độ ổn định của enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các phân tử enzyme Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có khối lượng là 51kD và 36kD, theo thứ tự

Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme Các isoenzyme của kiwi có cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3 Tuy nhiên, chúng khác nhau về mức độ bền nhiệt

b.Đặc điểm của pectineaterase vi sinh vật:Một điểm đáng lưu ý là tất cả enzyme VSV đều không phải là protein kiềm PE của Trichoderma reerei có điểm đẳng điện nằm trong khoảng 8,3-9,5 và pH tối ưu là 7,6 Tuy nhiên, PE của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu trong khoảng acid Hoạt động của enzyme PE sinh ra bởi A niger đạt tối đa ở pH 4,5 ở 40oC Các PE acid và kiềm có thể đề methyl hoá cơ chất pectin theo cùng một kiểu PE kiềm làm hình thành các pectin được đề ester hoá và pectin này có thể tạo gel yếu với ion calcium; PE acid tạo ra pectin bị đề ester hoá có khả năng tạo gel mạnh với ion calcium

c.Trình tự amino acid: Cấu trúc bậc một của PE cà chua chứa 305 amino acid với khối lượng phân tử 33 239 Enzyme này có chứa hai cầu nối disulfide (Cys98-Cys125 và Cys166-Cys200) Cys 166 có mặt trong tất cả các enzyme pectinesterase Trình tự amino acid suy luận trên cơ sở các nucleotide cDNA cho thấy sự không nhất quán, 18 trong 27 vị trí khác nhau, có thể làm thay đổi điện tích của protein Mặt khác, chỉ có khoảng 94% trình tự amino acid trong một phần chuỗi amino acid có tính đồng dạng với toàn bộ trình tự của cDNA Sự không nhất quán này có thể phản ánh sự tồn tại của các isoenzyme, mặc dù chỉ có hai isoenzyme trong cà chua được biết đến Một số gen mã hoá cho các enzyme PE đã được tách dòng và nghiên cứu đặc điểm Gen tách dòng từ Pseudomonas mã hoá cho PE có chứa 396 amino acid với khối lượng phân tử là 41 004

d.Cơ chế để methyl hoá: PE loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân tử pectin bằng tương tác ái nhân của enzyme lên ester, làm hình thành hợp chất trung gian acyl-enzyme và phóng thích methanol Tiếp theo sau là phản ứng deayl hoá, là phản ứng thủy phân của hợp chất trung gian acyl-enzyme, để giải phóng enzyme và carboxylic acid(H.6.7)

E-N

Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu làm hình thành các khối pectin chứa các nhóm carboxylate dọc theo mạch pectin Enzyme của Trichoderma reesei là một protein cơ bản cho kiểu phản ứng tương tự Enzyme của các loài Asperillus với pH tối đa trong vùng acid, xúc tác phản ứng từ bên trong

Aûnh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme pectinesterase có thể có liên quan đến tương tác của nó với cơ chất Polygalacturonic acid là một chất ức chế cạnh tranh trong phản ứng thủy phân nhờ sự xúc tác của PE Pectin chứa các nhóm cacboxylate được sắp xếp như hình khối có thể tác dụng theo cách tương tự Sự liên kết của các ion kim loại vào các nhóm carboxylate trong trường hợp này có khuynh hướng trung hoà ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên enzyme Tuy nhiên Lượng dư các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion kim loại bị vây quanh bởi các nhóm carboxylate nằm kế cận với các liên kết ester cần thiết cho phản ứng thủy phân xảy ra

2 Polygalacturonase

Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV PG thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các loài Ascomycete, Phizopus arrchizus, và Fusarium osyporum Tuy nhiên, trong thực tế, PG của thực vật bậc cao được nghiên cứu rất nhiều ở cà chua chín

a.Các enzyme trong cà chua chín: Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều là endo-enzyme PG1 có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở nhiệt độ 78oC PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở 57oC PG1 có độ ổn định tối đa ở

pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở pH 5,6 Sự phân tích sử dụng SDS-PAGE cho rằng PG1 là một dimer của PG2, tuy nhiên các nghiên cứu khác lại cho rằng PG1 hình thành là do sự kết hợp của PG2 với một $–subunit Các chuỗi polypeptide của PG đều bị glycosyl hoá PG2 chứa 4,6 đường trung tính (D-mannose, L-gucose, D-xylose) liên kết với nhau thông qua cầu nối N-acetylglucosaminylasparaginyl Có sự khác nhau chút ít về khối lượng phân tử, chẳng hạn các isoenzyme của PG2, PG2A va PG2B có khối lượng phân tử tương ứng là 43 và 46kD Sự khác nhau này có thể là do quá trình sửa sai hoặc quá trình glycosyl hoá sau dịch mã Trong thực tế, các nghiên cứu sau đó cũng đã chứng minh được rằng PG2A và PG2B là các dạng glycosyl hoá khác nhau của cùng các polypeptide

b Trình tự amino acid: Các trình tự amino acid được suy luận trên cơ sở các nucleotic của cDNA phân lập không những từ trái cà chua mà còn từ phấn của các loài Pseudomonas solanacearum, Oenothera organesis, phấn hoa bắp, và từ trái bơ Gen của PG2 phân lập từ trái cà chua mã hoá cho protein hoàn chỉnh có 373 amino acid, với khối lượng phân tử là 40 279 Enzyme này được tổng hợp từ một tiền chất, sau đó đi qua quá trình sửa chửa sau dịch mã, gồm cả các quá trình loại bỏ các peptide tín hiệu, bị glycosyl hoá tại bốn điểm có khả năng glycosyl, và sửa chữa ở đầu C cuối Các gen PG đơn mã hoá cho các loại isoenzyme khác nhau, dẫn đến kết luận rằng PG1 và PG2 đều xuất phát từ cùng một chuỗi polypeptide, và rằng PG1 được tạo thành nhờ sự kết hợp của PG2 với β-subunit

β-subunit Sự chuyển đổi PG2 và PG1 trong quá trình chín của cà chua là một vấn đề gây được nhiều chú ý β-subunit, một yếu tố bền nhiệt, đầu tiên

được phân lập từ cà chua xanh, có khả năng chuyển đổi PG2 thành PG1 trong ống nghiệm Yếu tố này sau đó được xác minh là một glycoprotein rất đặc trưng với polypeptide PG về mặt miễn dịch Phân tử PG1 được tạo thành từ một phân tử PG2 và một phân tử β-subunit; tuy nhiên, chỉ có polypeptide PG có hoạt tính enzyme

cDNA mã hoá cho –subunit có trong cà chua là một tiền chất có kích thước phân tử lớn (69kD, 630 amino acid) Trong phân tử này, thêm vào phân tử protein hoàn chỉnh là một trình tự tín hiệu kị nước (30 amino acid), một polypeptide chứa đầu cuối N-(78 amino acid), và một tiền peptide chứa đầu cuối C-(233 amino acid) Protein hoàn chỉnh chứa glycosyl hoá là chứa 289 amino acid nặng 31,5 kD, điểm đẳng điện 4,9 Protein này chứa lượng lớn amino acid gly, tyr, phe, và một motif lặp có cấu trúc liên ứng FTNYGxxGNGGxxx, trong đó “x” phần lớn là các amino acid phân cực Chức năng của motif này trong protein vẫn chưa được biết rõ

c.Vai trò của PG trong quá trình làm chín trái cây Hoạt độ của enzyme trong giai đoạn đầu của quá trình làm chín chủ yếu là nhờ PG1 PG1 tiếp tục tăng trong quá trình chín, và có mặt trong tất cả các giai đoạn của quá trình chín PG2 có khối lượng phân tử thấp hơn và ít bền nhiệt, PG2 xuất hiện trong giai đoạn cuối của quá trình, và chiếm lượng lớn trong giai đoạn chín Sự xuất hiện kế tiếp nhau của hai enzyme này là kết quả của hoạt động điều hoà của –subunit, yếu tố này được tìm thấy với lượng ít trong cà chua xanh, sau đó tăng lên trong giai đoạn chín

PG2 được coi như một endo-enzyme trong cà chua chín, PG1 được hình thành trong suốt quá trình chín khi β–subunit được sinh ra để phản ứng với PG2 Bằng cách điều chỉnh những thay đổi trong các phân tử PG trong các dịch chiết khác nhau có các nồng độ khác nhau của NaCl và pH đệm khác nhau Trên thực tế gen mã hoá cho polypeptide PG trong một số nghiên cứu trước đây đã chứng minh điều này Gần đây, các nghiên cứu về các kiểu biểu hiện gen của β–subunit và các phân tử PG cho thấy mRNA của β–subunit xuất hiện sớm trong quá trình phát triển của trái cây(10 ngày sau khi thụ phấn) và tăng đến mức tối đa trong 30 ngày, cũng là lúc trái cây chín Sau đó, lượng mRNA của β-subunit giảm nhanh chóng, trong khi lượng mRNA của PG tăng một cách đáng kể

Vì tất cả các kết quả nghiên cứu đạt được ở trên, ta có thể cho rằng endo-enzyme PG2 được hình thành trong các giai đoạn sớm của quá trình chín phải được chuyển về PG1 do sự có mặt của β–subunit Sự tích lũy của PG2 trong các giai đoạn sau của quá trình chín là do β–subunit bị cạn kiệt Vai trò của quá trình chuyển đổi này là nhằm điều hoà hoạt động của PG trong các giai đoạn của quá trình chín β–subunit phản ứng và neo phân tử PG2 vào thành tế bào, tạo ra phân tử PG1 dưới dạng hoạt động để phân hủy pectin Một số nghiên cứu khác cũng chứng minh được rằng PG1, chứ không phải PG2 có chức năng trong việc làm phân huỷ và ổn định polyuronide, có nghĩa là sự phân hủy của polyuronide dưới tác động của enzyme PG là nguyên nhân dẫn đến quá trình mềm của cà chua.Tuy nhiên, khi nghiên cứu về sự xen đoạn và biểu hiện

của gen PG trong cà chua chuyển gen thì kết quả cho thấy polyuronide bị phân hủy nhưng không làm cho trái cà chua mềm đi

d.Cơ chế và kiểu tác dụng: Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ra galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm

ưu thế(H.6.8) Sự thủy phân polymer này bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất Mức độ thuỷ phân tăng tỉ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối với các exo-PG ở cà rốt và đào Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh sự tạo thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ chất Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chín không gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme

PG là có liên quan

Các endo-PG phân hủy pectic acid từ bên trong mạch, làm giảm nhanh độ nhớt của dung dịch cơ chất Tính đặc hiệu và kiểu tác dụng của endo-enzyme được xác định bởi trạng thái của điểm hoạt động Mức độ thủy phân của endo-PG ở nấm men giảm cùng với sự giảm độ dài mạch cơ chất Vị trí liên kết của endo-PG ở Aspergillus niger được cấu thành từ 4 điểm và sự phân cắt xảy ra giữa các điểm 1 và 2(H.6.9) Một cơ chất tetramer chịu sự phân cắt(3+1) thành trigalacturonic acid galacturonic Một cơ chất pentamer cho ra hai sản phẩm phức tạp hơn, cả hai đều đáp ứng sự chiếm giữ hoàn toàn của 4 điểm liên kết, tạo sự phân cắt (4+1) và (3+2) Cũng tương tự, đối với cơ chất là hexagalacturonic acid, sản phẩm sẽ tạo thành lối phân cắt (5+1), (4+2) và (3+3) Trigalacturonic acid bám vào điểm hoạt động để tạo thành các phức hợp hữu ích hoặc không hữu ích Liên kết hữu ích trong trường hợp này làm sinh ra sự phân cắt (2+1) Liên kết không hữu ích được tạo thành khi ba đơn vị đơn lẽ bám vào ba điểm 2, 3 và 4 là không hề tương tác với các nhóm xúc tác định vị bên trong điểm 1 và 2 Cơ chất trong trường hợp này đóng vai trò là một chất ức chế cạnh tranh (K = 0,67mM)

Ca++ để làm tăng độ hoạt động và có pH tối ưu 8-10 Các nghiên cứu trên chủng EC16 cho thấy rằng tất cả 4 isoenzyme trên đều là endo-enzyme (PELA(pI 4,2), PELA (pI 8,8), PELC (pI 9,0), và PELD (pI 10,0)) Các PEL kiềm rất đặc hiệu trong việc gây ra sự giầm nước của các mô thực vật, tiếp theo là các isoenzyme trung hoà, trái lại các PEL acid không gây ảnh hưởng gì

Ở các chủng Erwinia carotovara, có ít nhất ba PEL được tiết ra, tất cả đều có điểm đẳng điện ở pH kiềm: PELI (pI 9,7), PELII (pI 10,2), và PELIII (pI 10,35) Cả ba isoenzyme này đều có pH tối ưu là 9,0 Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PELII và PELIII là 50 và 60oC, theo thứ tự PELI có độ bền nhiệt thấp Ở chủng GIR726, có bốn loại endo-PEL isoenzyme với các điểm đẳng điện ở các pH rất kiềm (10,0, 10,6, 10,3 và 10,9) và khối lượng phân tử nằm trong khoảng từ 28-33 kD pH tối ưu cho hoạt động là 9,3 cho PELII 9,5 cho PELIV và 9,7 cho PEL I và III Cũng như với các PEL từ các nguồn khác, những isoenzyme này được kích hoạt bởi Ca++ Hoạt độ enzyme tăng 50-70% khi có mặt của Ca++ ồng độ 0,5mM Isoenzyme với pI>10 chứa 2,5-4.8% đường trung tính Các PEL từ một số loài Bacillus cũng có khả năng gây ra sự giảm nước ở mô thực vật

IV Các đặc tính kỹ thuật quan trọng của enzyme

1 Pectinesterase:

Các PE ở thực vật tấn công vào hoặc đầu không khử hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, tạo ra các khối galacturonic acid không bị ester hoá rất mẫn cảm với calcium Các cấu trúc khác nhau của chuỗi galacturonan, chẳng hạn như các monomer acetyl hoá, các nhóm ester bị chuyển đổi thành amide hay bị khử đến rượu bậc một, hay sự tồn tại của các vùng có nhiều mạch nhánh, ức chế hoạt động của PE PE có tính đặc hiệu cao đối với nhóm methylester của polygalacturonic acid Các ester khác chỉ bị tấn công rất chậm, còn các nhóm methylester của polymanuronic acid thì không hề bị tấn công Tốc độ đề ester hoá trên mạch pectin phụ thuộc vào độ dài của mạch; trimethyl trigalacturonate không bị tấn công Các PE của nấm khác với PE của thực vật theo cơ chế đa mạch, các nhóm mehtoxyl bị lấy đi một cách ngẫu nhiên

2 Polygalacturonase:

Việc xác định hoạt tính của enzyme này bằng cách đo độ nhớt của dung dịch pectic acid gồm methylester và glycolester cho thấy sự giảm nhanh tốc độ và mức độ thuỷ phân, đồng thới tăng mức độ ester hoá Các nhóm acetyl có mặt làm giảm mức độ thủy phân bằng cách giảm ái lực của các phân tử cơ chất qua các khối chứa các điểm liên kết Sự thủy phân bị hạn chế do sự có mặt của các nhóm acetyl có thể được xác minh bằng cách sử dụng pectin củ cải đường làm

cơ chất PG tạo bởi nấm có thể thủy phân đến 70% pectin bị acetyl hoá Tuy nhiên, kiểu tác dụng lên cơ chất của các PG có từ các nguồn khác nhau thì khác nhau

Cơ chất tốt nhất cho sự phân hủy của endo-pectin-lyase ở pH>7 là pectin hoàn toàn bị ester hóa Tuy nhiên,ở các giá trị pH nhỏ hơn, enzyme này vẫn hoạt động đối với pectin bị ester hóa ít hơn, đồng thời cần Ca++ để kích hoạt Điều này có ý nghĩa thực sự đối với các quá trình chế biến trái cây Những enzyme này cần các nhóm methylester để hoạt động, trái lại chúng bị bất hoạt khi có mặt các nhóm glycolester và các pectate bị amidate hóa

3.Endo-pectate lyates:

Trái lại, endo-pectate lyates không phân biệt methylester và glycolester của pectic acid Điều thú vị là pectate không phải là cơ chất tốt nhất cho vi khuẩn PAL từ vi khuẩn Chúng có hoạt độ cực đại (tốc độ ban đầu và mức độ phân hủy) nên pectin có hàm lượng methoxyl thấp

4.Rhamno-galacturonase:

Gần đây, rhamno-galacturonase là enzyme được phát hiện có khả năng phân cắt liên kết glucoside trong các vùng phân nhánh nhiều của phân tử galacturonic rhamnose acid có trong pectin của quả táo với hoạt tính rất cao khi những phân tử này bị đề ester hoá và arabinose bị lấy đi do bị thủy phân bởi acid (vùng phân nhánh nhiều bị sửa chữa) Enzyme này có mặt trong các chế phẩm thương mại của pectinase và chắc chắn phải được phân loại là pectinase Sản phẩm cuối là các oligomer có các đơn vị rhamnose và galacturonic acid, trong đó rhamnose làm hình thành đầu không khử

5 Pectinase thương mại:

Enzyme thương mại là các chế phẩm enzyme của nấm mốc, được điều chế chủ yếu từ các loại Aspergillus Chúng thường là hỗn hợp của các PE, PG và Pl, hemicellulase và endo-β -glucanase (C-x-cellulase) Hoạt tính của ba chế phẩm thương mại khác nhau được trình bày ở bảng 6.13 Các enzyme đều được thu nhận từ nấm mốc được sử dụng để sản xuất chế phẩm pectinase, trừ enzyme C-1-dellulase (cellobiohydrolase) là được thêm vào để chế phẩm đạt được mục đích kỹ thuật Enzyme arabinanase đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình chế biến nước ép trái cây

Bảng 1:Hoạt tính riêng của các phức hợp đa enzyme trong các chế phẩm pectinase được sản xuất từ nấm

Hoạt tính enzyme Cơ chất A B C

Pectin DE 65 Pectin DE 75 CMC

A vicel 1-5-α-L-arabinan 1,3; 1,2; 1,5-α-L-arabinan

PNP-Arabinofuranoside Galactomannan

1,4-β-D-Mannan 1,4-β-D-Galactan 1,4-β-D-Xylan

V Thu nhận:[ I ]

Hiện nay, người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV Có hai phương pháp sản xuất pectinase:

1 Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt:

Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase thường là cám gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối ammonium, phosphoric… Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60% Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 30oC và trong thời gian 40h, sau đó giảm xuống 24oC và nuôi trong 48-52h Sản phẩm lên men được sấy khô thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế

Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối ammonium sulfate Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa enzyme pectinase có thể là rượu ethanol (72,5-75%) hoặc isopropanol (55-57%) Muối ammonium sulfat sử dụng có độ bảo hoà 0,79 Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết khoảng 90%, còn nếu bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75% Nhiệt độ kết tủa tối ưu với rượu là 2-5oC, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt Sau đó, ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản

2 Thu nhận chế phẩm enzyme từ canh trường bề sâu:

Phương pháp hiếu khí: Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hoá mạnh và khi lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7,2 là thích hợp Đối với nấm mốc, pH kiềm kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy enzyme pectinase pH=4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzyme pectinase Khi pH dịch về phía acid, ngay cả khi

pH nằm trong khoảng 4,5-5,0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm Tuy nhiên, pH của các trường nuôi cấu A niger và A awamori 16 có thể dịch về 3,5-3,8 và 2,9-3,2, theo thứ tự

Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi và với hàm lượng từ 2-10% Đối với A niger và A awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ

sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử Thời gian ủ sơ bộ thường là38-42h Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2% Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất hoà tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8%

Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180oC và đi ra đạt 60-70oC Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 40oC Chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm Có thể thu chết phẩm pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa enzyme

trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỉ lệ 4:1, với aceton theo tỉ lệ 2:1 và isopropanol thưo tỉ lệ 1,3:1, hoặc với muối ammonium sulfate (50-80% trong muối kết) Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu Nếu kết tủa bằng muối ammonium sulfate, cần tách muối ra khỏi enzyme bằng phương pháp thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khô Khi độ bão hoà của (NH4)2SO4 bằng 0,5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp (đoạn này chiếm 0,25% trọng lượng khô), nhưng nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bão hoà 1.0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao

Phương pháp yếm khí

Môi trường: Bã củ cải:2%; (NH4)2HPO4 0,75%

KH2PO4:0,1%; CaCO3: 0,3%; nước chiết ngô: 0,5%

Clostridium pectinopermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối Sự tích lũy enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là 6,5-7,0 Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35oC

Cl Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase Thành phần môi trường gồm có: Lactose:2%; pectin củ cải:1%; (NH4)2HPO4: 0,4%; K2HPO4: 0,7%; KH2PO4:0,3%; NaCl:0,1%; MgSO4: 0,025%; FeSO4: dạng vết; CaCO3: 0,5%; dịch nấm men tự phân: 0,05%; ascorbic acid: 0,5%

Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfate Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lí là: 6,5-6,8 Nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ của enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu

Khi kết tủa bằng ammonium sulfate có độ bão hoà bằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase; khi độ bão hoà là 0,9-1 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintranseliminase và exopolygalacturonase

Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzyme pectinase thường theo các bước cơ bản sau đây:

- Khử muối bằng phương pháp lọc gel(Biogel P100)

- Tách protein bằng phương pháp trao đổi anion (DEAE Biogel A), hay trao đổi cation (CM Biogel A)

- Tách enzyme pectinase bằng alginate liên kết ngang

- Tinh sạch bằng FPLC

Alginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng tĩnh điện và thay thế pectate liên kết ngang

3 Ý nghĩa về mặt kỹ thuật của các endo-enzyme

3.1-Pectinesterase: Ethanol có mặt trong phần chưng cất được từ thịt quả lên men là do pectin methylester bị phân cắt bởi endo-enzyme PE Trong suốt quá trình lên men, ethanol được sinh ra và các đơn vị sản xuất cần phải thanh trùng thịt quả trước khi lên men để nồng độ ethanol có mặt trong sản phẩm không vượt quá giới hạn cho phép Sự có mặt của PE trong trái cây họ citrus là nguyên nhân gây ra các vấn đề cần được giải quyết trong công nghiệp thực phẩm, tức là sự mất đi của các vết vẫn đục trong dịch ép Nếu PE không bị ức chế trực tiếp sau khi tách chiết dịch quả bằng cách bất hoạt bởi nhiệt hay làm đông, các phân tử pectin sẽ bị đề ester hoá và sẽ bị đông tụ bởi sự có mặt của các ion Ca++ trong dịch ép Để ngăn điều này, nước ép được tách thành phần cặn và phần trong Nếu nước ép quá đặc, gel pectate sẽ được hình thành và do đó nước ép sẽ không được hoàn nguyên lại nữa Những vấn đề này làm giảm chất lượng sản phẩm một cách nghiêm trọng Các chất tạo hương của trái cây họ citrus cực kỳ mẫn cảm với nhiệt, vì thế các phương pháp sản xuất sản phẩm trái cây đông lạnh đang rất cần thiết Phức hợp của ion Ca++ có thể ngăn ngừa sự biến mất của các đám mây vẫn đục do hoạt động của PE, nhưng lại làm phát sinh các vấn đề mang tính chất pháp lý Polyphenol có thể ức chế hoạt động của PE nhưng lai gây ảnh hưởng đến vấn đề cảm quan, chẳng hạn về vị trí và tính đồng nhất của sản phẩm PE đồng thời là một chất ức chế sản phẩm cuối, nhưng nếu thêm pectic acid vào lại làm nước ép bị phân lớp, thế là lại tạo ra một vấn đề không mong muốn khác Tuy nhiên, việc thủy phân pectic acid, đến mức polymer hoá 8-10, có ảnh hưởng ức chế của các chế phẩm polymer cao phân tử nhưng lại không đông tụ với Ca++ Việc thêm các chế phẩm như thế sẽ không ngăn ngừa được nhưng sẽ trì hoãn được quá trình tự phân lớp, có lẽ đủ lâu để phân phối nhanh các loại nước ép trái cây tươi được làm tan giá Một khả năng khác là việc thêm các exo-enzyme (H.6.10): PG làm phân hủy pectin có mức ester thấp hình thành trước khi sự đông tụ với Ca++ xảy ra, hay PL phân hủy các pectin trong nước ép trái cây đến các sản phẩm có khối lượng phân tử thấp hơn, là các hợp chất không mẫn cảm với Ca++, dù là đề ester hoá và thực tế cũng có thể hiện chức năng ức chế PE Hoạt động phân hủy pectin bởi enzyme như thế đã được ứng dụng trong việc làm giảm độ nhớt trong nước trái cây, vì thế làm tăng nồng độ của các thành phần chất chiết đến các giá trị Brix cao hơn như bình thường có thể Cũng cần phải lưu ý việc sử dụng các giai đoạn bay hơi nhiều lần nhằm tối ưu hoá quá trình xử lý nhiệt và khôi phục hương vị sản phẩm, kết hợp với việc bảo quản trong điều kiện đông lạnh và vận chuyển sản phẩm nước ép cô đặc giúp tránh được phần lớn PE bị bất hoạt do tác động của nhiệt độ.Tuy nhiên, đối với các nước đang phát triển, vẫn đang tồn tại vấn đề này trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây họ citrus và các loại nước ép vẩn đục khác có hoạt lực PE cao và các chất tạo hương rất mẫn cảm với nhiệt, chẳng hạn như ổi và xoài

Các PE được phân lập từ cam có hình thức khác nhau và có ái lực khác nhau đối với pectin và pectate Mặt khác, chúng cũng khác nhau về độ bền nhiệt, và cũng dễ hiểu rằng chúng đóng vai trò khác nhau trong hiện tượng làm

trong dịch quả ép Một loại được phân biệt bởi khối lượng phân tử của nó rất cao, chỉ chiếm khoảng 5% hoạt tính toàn phần và mang một số đặc điểm nổi bật Loại này bền nhiệt và vì thế đóng vai trò chính yếu trong việc làm trong dịch quả ép đã thanh trùng với lượng nhiệt không đủ Enzyme này cũng hoạt động ở nhiệt độ thấp và pH thấp và do đó được coi là có vai trò quan trọng trong quá trình tự tách lớp của nước chanh trong và nước ép từ quả chanh thu được bằng cách để lắng nước ép trong tank có chất bảo quản là sulfur dioxide Những dịch trong từ quả ép như thế vẫn đang là những sản phẩm có giá trị thương mại được sản xuất với việc ứng dụng các chế phẩm pectinase thương mại

Trong số hai isoenzyme trong bảng 6.13, chỉ có isoenzyme PE loại I có khả năng làm tách lớp PE loại II không có khả năng này; lượng methanol tự do được thoát ra ít hơn so với methanol tạo ra bởi các enzyme tách lớp Bảng 6 cho thấy khả năng ức chế rất cao của pectate có lẽ đã ức chế sự hoạt động của enzyme ở một mức nhất định trong quá trình ester hoá Aûnh hưởng này được tăng lên bởi sự đóng góp của các nhóm acid tạo thành Hình 6.11 cho thấy, nếu thêm PG vào thì khối pectate lại bị phân hủy tiếp và trên thực tế tốc độ phản ứng mà tại đó methanol tự do hình thành trong nước cam ép có PE hoạt động được tăng lên bởi PG Các sự khác nhau về mặt động học như thế cũng có thể giải thích tính ức chế không hoàn toàn bởi oligogalacturonate Một loại PE khác trong nước cam ép không gây ra sự tự phân lớp, thậm chí ngay cả sau khi giải phóng một lượng methanol bằng với lượng methanol mà PE phóng thích Các kiểu tấn công của enzyme phải được giả định sao đó để pectin với hàm lượng ester thấp được sinh ra mà có tính mẫn cảm với Ca++ giảm đi, có lẽ bởi sự phân bố ngẫu nhiên của các nhóm carboxyl tự do Cơ chế này thường thấy ở các PE của nấm, chẳng hạn như ở A japonicus, enzyme này được sử dụng để sản xuất pectin có mức ester hoá thấp dùng trong chế biến mức ít đường Những pectin như vậy thường được sản xuất nhờ quá trình thủy phân nhờ acid Pectinesterase của nấm cũng được sử dụng để tách lớp rượu táo Pháp Hai isoenzyme với đặc tính làm tách lớp nước cam này được tìm thấy trong tất cả các thành phần của quả cam Có đến 12 loại PE được tìm thấy trong quả cam trồng và các loại quả họ citrus khác và chúng được tách trên cơ sở ái lực của chúng đối với pectate Điều cần chú ý là hoạt động của các PE bị ức chế bởi nồng độ cao của đường để tạo nước ép cô đặc đến 60oBx, tại đó các enzyme này không hoạt động nhưng lại có thể hoạt động sau khi hoàn nguyên (pha loãng trong nước)

Hiện tượng đông tụ với calcium của pectin bị đề ester hoá bởi PE được khai thác khi sấy khô vỏ trái cây họ citrus sau khi ép làm thức ăn cho gia súc Chất vữa calcium hydroxide được thêm vào khối vỏ trong khi nghiền để đưa pH

ve giá trị trung tính hay cao hơn pH cao, và nồng độ ion Ca++ cao, làm kích hoạt PE, quá trình đề ester hoá xảy ra nhanh và sự đông tụ của pectate với calcium xảy ra Chất lỏng được tiết ra và được ép, để chỉ có một phần ít nước còn lại cần được loại bỏ nhờ quá trình sấy bởi nhiệt Phần nước ép có thành phần tương tự như nước ép từ quả được cô thành mật và cũng được làm thức ăn

cho gia súc Dĩ nhiên, vỏ trái cây họ citrus khô được sử dụng làm nguyên liệu thô để trích chiết pectin, do đó cần phải ngăn chăn hoạt tính của PE bằng cách tẩy trắng vỏ ngay lập tức, nếu không, pectin được chiết ra, cho dù bị đề ester hoá ít thôi, sẽ chứa các khối galacturonic acid tự do và sẽ rất mẫn cảm với Ca++

và vì vậy không sử dụng được để làm yếu tố tạo đông

Endo-PE cũng được khai thác để bảo vệ và cải tạo kết cấu và độ chắc của nhiều loại rau quả chế biến, như táo cắt lát, cà chua đóng hộp, súp lơ, cà rốt, khoai tây và đậu Quá trình làm trắng ở nhiệt độ thấp, thời gian dài kích hoạt PE, làm cho pectin bị đề ester hoá một phần, sau đó pectin bị đề ester hoá này phản ứng với Ca++, tạo nên sự kết dính nội bào mạnh hơn

Sự kích thích mạnh hơn đối với PG và mạnh hơn trong thí nghiệm b, trong đó enzyme, esterase bị ức chế mạnh hơn bởi sản phẩm cuối so với trong thí nghiệm a Rõ ràng PL ( ) không phân hủy được các vùng ức chế đề ester hoá nên không có ảnh hưởng gì

3.2-Pectinesterase và polygalacturonase:

Hai enzyme này có mặt cùng nhau rất nhiều trong cà chua, có ảnh hưởng rất lớn trong quá trình chế biến cà chua Việc gây bất hoạt các enzyme này bởi nhiệt ngay lập tức là cần thiết để có được nước ép có độ nhớt cao như người tiêu dùng mong muốn hay nước ép dạng paste, sử dụng làm nước chấm, soup, nước sốt cà chua nấm và một số sản phẩm tương tự Những loại nước quả này được xử lý nhiệt trong một thiết bị đặc biệt mà trong đó cà chua được nghiền trực tiếp thành cà chua nóng dạng nhão Rõ ràng, quá trình xử lý nhiệt tạo ra một số các hương vị đặc trưng cho sản phẩm cà chua chế biến Trong trường hợp các thành phần cà chua được sử dụng để tạo màu và hương vị, còn phần chính của sản phẩm là do các thành phần khác, như tinh bột tạo nên thì nguyên liệu nước ép phải ở trạng thái nguội hơn, đồng thời phải có một thời gian nghỉ giữa hai giai đoạn nghiền ép và xử lý nhiệt để pectin có thể bị phân hủy nhiều hơn nhờ tác động kết hợp của PG và PE Còn trong những trái cà chua được cải tạo gen để giảm hàm lượng PG, phần rắn và độ chắc cũng như độ nhớt của quả được tăng lên

3.3-Hoạt tính pectinase từ nguồn VSV gây nhiễm

PG từ nấm men và PAL từ vi khuẩn cùng với các endo-PE đều có liên quan đến quá trình làm chín dưa chuột và ô liu ngâm trong nước muối Sự hao hụt về chất lượng này có thể tránh được bằng cách sử dụng các chất ức chế, chẳng hạn như các polyphenol rò rỉ ra từ lá nho vào trong nước muối Nước muối có thể được sử dụng để thanh trùng nấm mốc bền nhiệt Byssochlamys fulva Nấm mốc này sinh enzyme làm hỏng dâu tây trong sirô (syrup) hay mứt Một loại PG bền nhiệt có từ loài Rhizobium có thể làm hỏng kết cấu của thịt quả mơ đóng hộp Sự nhiễm nấm có thể gây ra hiện tượng tách lớp của nước cam vô khuẩn và đã đóng chai, không rõ là do tác động của PE, PG hay cả hai, nhưng một lượng lớn methanol tự do được tìm thấy trong loại nước quả phân lớp này PG nấm men có thể phân hủy pectin trong quá trình lên men bột táo

nghiền, làm cho bã táo bị mất đi một lượng lớn pectin nếu được đem làm nguyên liệu thô để sản xuất pectin

Lên men cà phê và cacao là một lĩnh vực ứng dụng nhiều triển vọng của enzyme pectinase có từ nguồn VSV Trong quá trình len men, lớp chất nhầy xung quanh các hạt này bị phân hủy nhanh hơn và bị rửa khỏi hạt trước khi hạt được sấy khô Một ứng dụng khác là sự tạo hương đặc biệt cho sản phẩm rượu

do sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc nhiễm vào trái nho chín có hàm lượng đường cao bằng cách đâm thủng vỏ trái nho và để nước trong nho bay hơi, và để nho bị nhiễm nấm

PHẦN II ỨNG DỤNG CỦA HỆ ENZYM PECTINASE

I Tình hình ứng dụng enzym trong công nghiệp trên thế giới :[I ]

Từ khi phát hiện ra enzym và khả năng chuyển hóa của enzym loài người đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzym trong công nghiệp Số lượng enzym phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzym được ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều Các enzym quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp được trình bày trong bảng sau:

Bảng 2:Mức độ ứng dụng của một số enzym quan trọng hiện nay trên thế giới Qua bảng trên ta thấy các enzym thuộc nhóm protease hiện đang được ứng dụng nhiều nhất Trong đó enzym protease kiềm được ứng dụng trong chất tẩy rửa với số lượng lớn nhất so với các loại emzym khác

Trong số các enzym được sản xuất và ứng dụng trên thế giới, các nước châu Âu sản xuất và bán ra thị trường thế giới số lượng nhiều nhất

Stt Loại enzym Tỷ lệ ứng

- Protease kiềm yếu

- Protease kiềm mạnh dùng trong chất tẩy rửa

Bảng 3:Thị trường enzym châu Aâu

Riêng trong công nghệ thức phẩm, lượng enzym được tiêu thụ nhiều nhất Số lượng enzym được ứng dụng trong công nghiệp thức phẩm chủ yếu ở các nước châu Mỹ, châu Âu

Những loại enzym đặc biệt

Các loại enzym khác

83,2 187,2 31,6 41,6 20,8 41,6

Stt Lĩnh vực công

nghiệp và enzym

Giá trị buôn bán enzym (triệu USD)

Stt Lĩnh vực công

nghiệp và enzym

Giá trị buôn bán enzym (triệu USD)

Công nghiệp sữa

Rennet động vật

Rennet vi sinh vật

β - glucanase Cellulase-hemicellulase Công nghiệp bánh kẹo

Amylase nấm sợi

α - amylase Protease Cellulase-hemicellulase Thực phẩm hỗn hợp Invertase

Lipase Bromelin Glucose oxidase Thức ăn gia súc

β - glucanase Cellualse-hemicellulase

α - amylase Glucose oxidase Protease vi khuẩn