Nhóm enzyme protease

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chếphẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnhvực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm, lượngenzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau Khoảng 75% chế phẩm làenzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên Protease làenzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biếnthực phẩm (đông tụ sữa làm fomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sảnphẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuấtchất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Vì tầm quan trọng của protease trongnhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm, nên nhóm chúng tôi đã lựachọn ứng dụng của protease trong công nghệ thực phẩm làm đề tài báo cáo

DANH MỤC BẢNG, HÌNH, SƠ ĐỒ

Trang

Bảng 1: Một số enzyme đông tụ sữa trong sản xuất Fomat 14

Bảng 2: Tỉ lệ nước, muối trong ướp cá 27

Hình 1: Mô hình phân tử enzyme protease (papain) 6

Hình 2: Cấu trúc không gian enzym protease (renin) 7

Hình 3: Bào tử xạ khuẩn 10

Hình 4: Sản xuất Fomat 13

Sơ đồ 1: Các giai đoạn trong quá trình thu nhận protease 10

Sơ đồ 2: quy trình chế biến nước mắm bằng phương pháp cổ truyền 25

Sơ đồ 3: qui trình chế biến nước mắm bằng phương pháp vi sinh vật 26

Sơ đồ 4: Các giai đoạn trong sản xuất nước chấm lên men chìm 28

Sơ đồ 5: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật 29

Sơ đồ 6: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp thủy phân 30

NỘI DUNG

Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấpprotease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn.Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụngrộng rãi enzyme trong sản xuất Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sảnxuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20 –30% Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằmthu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết

Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme ở

vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạkhuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuấtenzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống

Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệptrên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân(75%), và protease là mô ̣t trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp(60%)

1 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE

1.1 Giới thiệu chung

Nhóm enzyme protease (peptidase) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptid(-CO-NH-) trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các acidamin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vậnchuyển acid amin

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ visinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dàybê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểmkhác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồmnhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rấtkhó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Hình 1: Mô hình phân tử enzyme protease (papain)

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ visinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dàybê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểmkhác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồmnhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rấtkhó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sửdụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptitdđịnh trước Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxylhoặc nhóm amin được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,…

Trong cơ thể protein thực phẩm được phân giải ở bộ máy tiêu hóa bởi cácenzyme phân giải protein, đầu tiên là pepsin trong dịch dạ dày và sau đó là cácprotease được tiết ra ở tuyến tụy và từ các tế bào ở màng nhày thành ruột Các acidamin tự do và các peptid ngắn được hấp thụ và đi qua các tế bào hình lông ở thànhruột Phần lớn các peptid được hấp thụ bị thủy phân ở các tế bào thành ruột Các acidamin được hấp thụ sẽ đi vào gan và sau đó tham gia vào quá trình chuyển hóa

Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều loạithực phẩm Quá trình này có thể được thực hiện nhờ chính protease của thực phẩm đóhay do các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình chế biến thực phẩm

Trong nhiều trường hợp các tính chất protein thực phẩm được cải thiện nhờthủy phân hạn chế hoặc sâu sắc nhờ các enzyme protease Sự thủy phân hạn chế cótác dụng tăng khả năng nhũ hóa và tạo bọt của protein (do tăng tính hòa tan và khảnăng khuếch tán đến bề mặt phân chia).

Hình 2: Cấu trúc không gian enzym protease (renin)

1.2.Phân loại protease

 Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thốngphân loại các nhóm enzyme;

 Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase;

 Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptit, exopeptidase đươ ̣c phân chiathành hai loa ̣i:

 Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu N tự do của

chuỗi polypeptit để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc mộttripeptit;

 Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi

polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid

 Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốnnhóm:

 Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine

trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt độngxúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và

subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật nhưchymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vikhuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN Các serine proteinase thườnghoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đốirộng.

 Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm

hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cysteinproteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chấtrộng

 Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm

pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin,cathepsin, rennin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trungtâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

 Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm

thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metalloproteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dướitác dụng của EDTA

 Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

 Protease acid: pH = 2 – 4;

 Protease trung tính: pH = 7 – 8;

 Protease kiềm: pH = 9 – 11.

1.3 Nguồn thu protease vi sinh vật

Trong công nghiệp protease có thể thu từ nhiều nguồn chủ yếu từ vi sinh vật như:

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus

subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium Trong đó, B subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất Các vi

khuẩn thường tổng hợp các protease hoa ̣t động thích hợp ở vùng pH trung tính vàkiềm yếu

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 – 8)

và có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân proteinthực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng Cácprotease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm

Chúng được sinh ra nhiều bởi B subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.

Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử

từ 20.000-30.000 Ổn định trong khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng pHrộng 7 – 12

1.3.2 Nấm mốc:

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng

dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A terricola, A.

fumigatus, A saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả năng

tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủyếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3

Một số nấm mốc khác như: A candidatus, P cameberti, P roqueforti… cũng

có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất fomat

1.3.3 Xạ khuẩn:

Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn

và nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng

hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S fradiae, S trerimosus

Hình 3: Bào tử xạ khuẩn

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được

tách chiết từ S grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân

tới 90% liên kết peptit của nhiều protein thành amino acid Ở Liên Xô (cũ), người ta

cũng tách được chế phẩm tương tự từ S grieus có tên là protelin.

Từ S fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da Protease từ S.

fradiae cũng có hoa ̣t tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế

biến thịt

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vậtthường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

1.4 Thu nhận protease từ vi sinh vật

Sự thu nhận protease từ vi sinh vật trải qua các giai đoạn chính có thể tóm tắtthành sơ đồ như sau:

Sơ đồ 1: Các giai đoạn trong quá trình thu nhận protease

1.4.1 Tuyển chọn chủng:

Yêu cầu tuyển chọn chủng tổng hợp được enzyme cần thiết, với lượng đáng

kể và hoạt tính cao Đối với việc thu protease thì thu từ nguồn như nấm mốc, vikhuẩn, xạ khuẩn

Môi trường tuyển chọn phân lập thường từ đất, nước, lương thực, thựcphẩm…Tuy nhiên các chủng phân lập theo phương pháp thông thường chỉ tổng hợpđược một lượng nhỏ enzyme (enzyme bản thể), người ta cần tiến hành gây đột biếnbằng phương pháp sinh học, lý, hóa học… để tạo chủng có khả năng “siêu tổng hợpenzyme” Vi sinh vật sau khi được tuyển chọn cần được nhân giống và nuôi trongđiều kiện tối ưu để chúng sinh sản và phát triển tốt, tổng hợp nhiều enzyme

1.4.2 Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp

Protease:

Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởngtrực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Trong thành phầnmôi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinhvật và tổng hợp enzyme

Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiệntượng cảm ứng Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thìchất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng phong toảcủa chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bịcản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơchất tương ứng của enzyme cần tổng hợp

Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O Ngoài ra các chất vô cơ: Mn,

Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác

Về phương pháp nuôi cấy hiên nay người ta thường dùng hai phương phápsau:

 Nuôi bề mặt (môi trường nuôi dạng rắn) hay trên bề mặt dạng lỏng;

 Nuôi bề sâu (nuôi chìm) – môi trường nuôi dạng lỏng

1.4.3 Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme:

Tách chiết enzyme theo các công đoạn như sau:

 Phá vỡ màng tế bào để giải phóng enzyme: có thể dùng các phương pháp vật

lý, hóa học, cơ học…;

 Dùng dung môi chiết enzyme: thường dùng nước, NaCl, dung dịch đệm có pH

 Sấy kết tủa cho đến khô

Qua các bước như trên ta thu được enzyme chưa tinh khiết, cần qua giai đoạn tinhsạch enzyme để được enzyme tinh khiết Có nhiều phương pháp tinh sạch như sau:

 Phương pháp thẩm tích Dialise: là phương pháp sử dụng màng lọc bán thấmchỉ cho những chất có khối lượng phân tử nhỏ đi qua;

 Phương pháp kết tủa phân loại: thay đổi nồng độ chất kết tủa;

 Phương pháp điện di;

 Phương pháp lọc gel (gel Sephadex);

 Phương pháp sắc ký

2 ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

2.1 Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa

2.1.1 Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa [4]:

Sữa là loại thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng đầy đủ và cân đối nhất Cácsản phẩm từ sữa là rất đa dạng và phổ biến Từ nguyên liệu sữa, người ta đã cho ra vôvàn các sản phẩm có cấu trúc, trạng thái và hương vị khác nhau

Sữa chứa hầu hết các men có trong tự nhiên Các men này vào sữa theo tuyếnsữa và từ các vi sinh vật trong không khí hay dụng cụ chứa sữa như lipase, protease

Protease tham gia vào quá trình thủy phân protein tạo thành các sản phẩm nhưpepton, acid amin, Một số peptone được hình thành có thể gây vị đắng trong sữa.Protease được hình thành tự nhiên trong sữa và chúng không bị phân hủy hoàn toànkhi thanh trùng ở nhiệt độ 76 ÷ 78oC

Khi điều kiện vệ sinh không tốt, một số men tạo ra từ các nguồn vi sinh vậtxâm nhập vào gây tác hại đến sữa Chúng có thể làm giảm nghiêm trọng chất lượngcủa sữa ban đầu Sự có mặt một số men trong sữa được dùng làm chỉ tiêu trong kiểmtra chất lượng sữa

Các sản phẩm từ sữa có thể ở dạng rắn như các fomat với kết cấu hình thù vàtính cảm vị đặc trưng, dạng hạt đơn điệu như trong các sữa bột, dạng đặc mịn màngnhư trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc với đường.

Trong đó, mảng sản phẩm lên men truyền thống từ sữa vô cùng phong phú vàchiếm một vị trí quan trọng trong ngành công nghiệp chế biến các sản phẩm sữa Cóthể kể ra đây là bơ, fomat, kefir, yoghurt,…do đó các enzyme sử dụng trong côngnghiệp sữa ngày càng được nghiên cứu và ứng dụng, có thể kể đến như rennin(chymosin), pepsin có thể làm đông tụ sữa được dùng trong sản xuất fomat, sữa đôngtụ…

2.1.2 Ứng dụng trong việc sản xuất fomat:

Hình 4: Sản xuất Fomat

Fomat là sản phẩm chế biến từ sữa có sử dụng quá trình lên men lactic Đây làmôt thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, bảo quản được lâu, rất phổ biến và thíchhợp khẩu vị người châu Âu, châu Mỹ

Protease ngoài khả năng thuỷ phân protein đều có khả năng đông tụ sữa tuỳmức độ khác nhau, mạnh nhất là rennin, sau đó là pepsin và các protease khác Quátrình đông tụ sữa được ứng dụng trong sản xuất fomat Protease được thu nhận từ

một số vi sinh vật như Asp candidus, P roquerti, Bac mesentericus,…

Bảng 1: Một số enzyme đông tụ sữa trong sản xuất Fomat

Động vật

Dạ dày bê Chymosin A, pepsin và

gastriscin

Dạ dày cừu Chymosin và pepsin

Dạ dày dê Chymosin và pepsin

Dạ dày heo Pepsin A, B và gastricinThực vật Cynara cardunculus Cyprosin 1, 2, 3 hoặc

Vi sinh vật chuyển gen

 Khái niệm chung:

 Năm 1951, Heinz khám phá ra enzyme đông tụ sữa ở dịch tiêu hoángăn thứ tư dạ dày bê gọi là rennin

 Rennin có trong dịch dạ dày của động vật đang bú mẹ (trâu, bò, dê…mới đẻ), đặc biệt ngăn thứ tư dạ dày bê Khi con vật lớn hơn 5 tháng tuổi, bắtđầu ăn, hàm lượng rennin giảm dần và được thay thế bằng pepsin

 Từ năm 1971, người ta đã thành công trong việc dung chymotrypsin cốđịnh trên carboxylmethylcellulose để làm dông tụ sữa thay cho rennin đắt tiền

[3]

 Phân loại:

 Rennin là một protease acid tính, số phân loại E.C.3.4.4.3 Rennin đặcbiệt có khả năng đông tụ sữa cao và phân giải protein (chủ yếu casein củasữa).

 Rennin là enzyme thuỷ phân liên kết peptit trong protein có trọng lượngphân tử khoảng 33.000 – 34.000 Da Rennin tinh khiết có dạng tinh thể hìnhlập phương Về mặt cấu tạo phân tử, rennin có mạch polypeptit có gắn glycinetrong mạch có vòng cacbon Các liên kết hydro có thể đóng vai trò quan trọngtrong việc bảo vệ cấu trúc bậc 2, 3 của rennin ở dạng hoạt động Trong thànhphần hoá học, rennin chứa nhiều amino acid có tính acid nhưng ít hơn pepsin

Do đó, rennin thể hiện tính acid yếu hơn pepsin

 Đặc tính và khả năng thuỷ phân của rennin:

 Rennin tinh khiết có đặc tính của một globulin Điểm đẳng điện củarennin pI = 4,5 Rennin thấm chọn lọc qua màng tế bào nhưng không thấm quamàng tế bào ở môi trường kiềm

 Đặc hiệu thuỷ phân:

 Rennin chỉ thuỷ phân các liên kết peptit và không làm ảnh hưởng đếnliên kết ester và amin Rennin đặc biệt có tác động mạnh lên các liên kết đượctạo nên bởi tyrosine và phenylalanine

 Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác.Đặc tính thuỷ phân casein của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH Ở pH = 6,8rennin phân cắt trung bình 1/33 còn ở pH = 2,3 thì phân cắt 1/8 số liên kếtpeptit trong phân tử casein

 Sự hoạt hoá prorennin thành rennin:

 Prorennin là một chuỗi protein đơn chứa 3 cầu nối disulfite được giữlại trong phân tử rennin hỗ trợ cho hoạt động của enzyme

 Quá trình hoạt hoá prorennin giống sự hoạt hoá pepsinogen, ở pH < 3quá trình chuyển hoá từ prorennin thành rennin xảy ra rất mạnh Nhưng quátrình hoạt hoá prorennin không phải là quá trình tự xúc tác và peptit được giảiphóng ra không thể có tác động kìm hãm với rennin

 Các yếu tố ảnh hưởng:

 Hoạt động xúc tác tối ưu của rennin ở pH = 3,7; pH tối ưu của renninnằm ở vùng pH acid yếu hơn so với pepsin và thay đổi tuỳ theo cơ chất vào

khoảng 3,4 – 4 Đặc điểm của rennin là tác động ở môi trường acid vừa phải

và cần có sự hiện diện Ca2+ Ở pH = 3,7, các ion Ca2+ làm tăng hoạt độ rennin,những cation hoá trị 1+ làm giảm hoạt độ của nó

 Ở pH = 7 có sự tự phân huỷ và hoạt tính thuỷ phân của rennin ở pH nàyrất thấp Hoạt tính bị giảm khi pH > 6 kèm theo sự xuất hiện protein kết tủatrong dung dịch ở nhiệt độ cao

 Rennin tiếp xúc trong môi trường kiềm yếu pH = 9 sẽ bị bất hoạt dầnnhưng trong môi trường acid mạnh sẽ bất hoạt nhanh chóng

 Bảo quản rennin:

 Dịch rennin có màu hổ phách nhạt đến màu nâu đậm hoặc bột màutrắng đến nâu nhạt

 Rennin tinh khiết được bảo quản ở 15oC Dịch rennin được bảo quản ởnồng độ cao 14 – 20% và có thể thêm Na – benzoate và propylene – glycol đểbảo quản

 Thu nhận enzyme rennin:

 Nguyên liệu thu rennin là ngăn thứ tư dạ dày bê non (dạ múi khế) dưới

5 tháng tuổi

 Xử lý sơ bộ: tách mỡ, rửa sơ: Lấy phần múi khế của bao tử bê và lộnngược một cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, cân trọnglượng Rửa nhẹ bằng nước lạnh , không nên rửa quá kỹ sẽ làm mất enzyme,sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%

 Xay nhuyễn: Dùng kéo cắt nhuyễn màng nhầy dạ dày thành miếng nhỏkhoảng 1cm rồi xay nhuyễn đồng nhất nhằm phá vỡ các mô tế bào tạo điềukiện cho quá trình trích ly

 Chiết enzyme và chỉnh pH = 4:

 Bản chất của quá trình chiết tách enzyme từ màng nhầy dạ dày độngvật là sự phối hợp của ba giai đoạn: phá vỡ tế bào, hoạt hoá và chiết táchenzyme

 Có hai phương pháp là: phương pháp chiết và phương pháp tự phân Cảhai phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc: enzyme rennin được giải phóng

từ màng nhầy dạ dày động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid loãng haynhờ sự tự phân trong môi trường acid

• Phương pháp 1: phương pháp chiết: dạ dày rửa sạch, tách màng

nhầy, nghiền ngâm vào nước 5% butanol hay glycerin có cloroform đểtránh nhiễm khuẩn, thời gian ngâm 48 – 72 giờ, nhiệt độ thường Sau đóchế hoá bằng etanol để rennin kết tủa

♦ Niêm mạc dạ dày xay nhỏ, dùng HCl hay H3PO4, H2SO4 vớinồng độ thích hợp để chiết xuất và hoạt hoá prorennin thành rennin.HCl là acid vô cơ quan trọng có trong thành phần dịch vị dạ dày độngvật giúp prorennin được hoạt hoá thành rennin Thời gian tự phân 30giờ ở 40 – 42oC

♦ Dùng HCl để điều chỉnh pH môi trường về 4 sẽ cho hoạt tínhenzyme cao, khả năng hoà tan tốt

♦ Chiết enzyme dựa theo phương pháp tự phân do phương phápnày có sự phá vỡ một cách triệt để cấu trúc tế bào, hiệu suất thuenzyme cao hơn phương pháp chiết 5–7 lần

 Phối trộn NaCl 12% vào dạ dày bê theo tỉ lệ 1: 3 giúp cho quá trìnhchiết tách

 Khuấy: khuấy đều, bổ sung thêm chất bảo quản Natri benzoat 1% đểtránh VSV phát triển trong dung dịch, chống oxy hoá,

 Lọc: vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua nhiều lớp vải mùn

để thu được dịch enzyme

 Kết Tủa: tiến hành tủa enzyme theo phương pháp diêm tích với muốiNaCl nồng độ bão hoà 25% Cho muối từ từ, khuấy nhẹ đến khi dung dịch bãohoà, để tủ lạnh 20 phút Tủa bằng muối trung tính có nồng độ cao để kết tủathuận nghịch enzyme mà không làm giảm hoạt tính của chúng Ngoài ra, cóthể dùng các tác nhân tủa như: amon sulfate, cồn tuyệt đối, aceton,izopropanol… Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra một nhiệtlượng lớn có thể làm mất hoạt tính enzyme Do đó, dung dịch sau tự phân đãlọc cùng dung môi được làm lạnh trước khi sử dụng và dung môi phải đượccho từ từ và tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp Thời gian 5–10phút, nhiệt độ thấp 0–5oC

 Ly tâm: hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm lạnh ở

4oC, trong 45 phút, tốc độ 5000 vòng/phút để thu tủa

 Tinh sạch enzyme rennin:

Có thể sử dụng hai phương pháp sau:

 Phương pháp1: thẩm tích bằng màng bán thấm (cellophan)

Nguyên tắc:

Màng bán thấm (cellophane) có cấu tạo gồm nhiều lỗ nhỏ dùng để táchmuối và cho chất có phân tử lượng nhỏ qua túi và giữ lại những chất cóphân tử lượng lớn theo nguyên tắc khuyếch tán từ nồng độ cao (dung dịchtrong cellophane) đến nồng độ thấp (bên ngoài cellophane) cho đến khi đạtcân bằng nồng độ

Cho dịch rennin thô vào giấy cellophan, đặt vào nước cất lạnh có nhiệt

độ 0–4oC, khuấy và thay nước cất lạnh cho đến khi thử âm tính vớiAgNO3, thời gian thẩm tích khoảng 2 ngày đêm

 Phương pháp 2: phương pháp sắc ký lọc gel sephadex G–50

Nguyên tắc:

Khi cho một dung dịch chứa nhiều chất có phân tử lượng khác nhauchạy qua cột chứa các hạt gel sephadex đã trương nở thì xảy ra quá trìnhtách những phân tử có kích thước và trọng lượng khác nhau Những chất

có phân tử lượng nhỏ sẽ lọt vào bên trong lỗ gel do đó sẽ di chuyển chậmqua cột Các chất có phân tử lượng lớn hơn sẽ di chuyển bên ngoài hạt gelnên sẽ chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột trước Sau đó, chất có phân

tử lượng nhỏ sẽ lần lượt đi ra theo mức độ phân tử lượng của chúng Kếtquả là tách được các chất có phân tử lượng khác nhau thành các phân đoạntheo trình tự: các phân đoạn có trọng lượng phân tử lớn ra trước, các phânđoạn có trọng lượng phân tử nhỏ ra sau

 Sấy đông khô:

 Nguyên tắc của quá trình sấy đông khô: Nguyên tắc của phương phápsấy đông khô là tách nước ra khỏi nguyên liệu bằng cách chuyển từ trạngthái đá (rắn) vào trạng thái khí mà không qua giai đoạn lỏng (nước) Nhờvậy, nước được đưa ra khỏi nguyên liệu mà không làm hỏng nguyên liệu

 Quá trình sấy đông khô: gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1– làm lạnh: đây là giai đoạn quan trọng làm lạnh nguyên

liệu xuống điểm eutectic - điểm có nhiệt độ thấp nhất mà tại đó pha lỏng

và pha rắn cùng tồn tại - đảm bảo cho quá trình thăng hoa xảy ra ở giaiđoạn kế tiếp

Giai đoạn 2– sấy bậc 1: tạo áp suất chân không và hạ nhiệt độ xuống

-40oC để nước trong nguyên liệu thăng hoa ở trạng thái lạnh

Giai đoạn 3– sấy bậc 2: giai đoạn này có nhiệt độ cao hơn giai đoạn

sấy bậc 1 để giúp cho nguyên liệu giữ nguyên các tính chất hoá lý Giaiđoạn này áp suất chân không tiếp tục thúc đấy quá trình thăng hoa

 Tính chất của sản phẩm sấy đông khô:

Nếu sấy ở nhiệt độ thường dễ làm enzyme bị hư hỏng, mất đi tính chấtban đầu thì phương pháp này giúp cho enzyme giữ nguyên được tính chấthoá lý và có thể bảo quản trong thời gian dài

Sau khi sấy đông khô, enzyme thu được có dạng mảnh, màu trắng hoặcphớt hồng

2.1.2.2 Quy trình chế biến fomat:

 Giai đoạn lên men sữa, kết tủa casein:

Sữa sau khi đã thanh trùng Pasteur ở 85 – 95oC từ 15 - 20 phút, dùng chế phẩmmen Rennin và vi khuẩn lactic để kết tủa sữa Vi khuẩn lactic lên men sinh ra acidlactic, làm giảm pH môi trường tạo điều kiện thuận lợi để casein kết tủa và enzymeRennin giúp cho sự kết tủa casein tốt hơn, casein lắng xuống và thu được fomat.Ngoài tác dụng kết tủa, Renin còn thủy phân một phần casein thành pepton, acidamin…

Chú ý: Thanh trùng để tiêu diệt các loại vi trùng là cần thiết Tuy nhiên, thanh

trùng đã phá vỡ cân bằng giữa các muối, làm giảm hàm lượng muối calci mà kết quả

là làm giảm khả năng đông tụ sữa bằng men sữa (rennin) Để khắc phục nhược điểmnày, người ta phải bổ sung calci dưới dạng CaCl2

 Giai đoạn ép nén tách huyết thanh:

Phần casein kết tủa được ép từ 20 - 24 giờ, ở nhiệt độ 35 – 50oC Trong thờigian này sự lên men lactic vẫn tiếp tục mạnh mẽ Sau khi ép huyết thanh ra khỏi cục

sữa kết tủa, Fomat lúc này có thành phần chủ yếu là casein và lipid Huyết thanh sữa

bị loại ra chứa lacto, lactalbumin, lactoglobulin…

 Giai đoạn muối fomat:

Khối fomat sau khi tách huyết thanh sẽ cho vào bể nước muối nồng độ 24%ngâm trong vài ngày để tăng vị mặn, tạo sự đồng nhất về thành phần cho khối fomat

và kìm hãm vi sinh vật có hại phát triển chủ yếu là trực khuẩn đường ruột

 Giai đoạn ủ chín:

Sau khi muối xong, khối fomat được chuyển vào hầm lên men ở nhiệt độ 18 –

22oC, độ ẩm 80 - 90% Quá trình lên men chậm dần do đường lactoza đã bị tách hầuhết trong giai đoạn ép nén Trong khối fomat, vi khuẩn Propionic hoạt động mạnh,lên men lactic thành acid propionic, acid acetic và CO2 Cả hai acid này làm choFomat có vị chua, hăng đặc biệt Sự lên men propionic sẽ kết thúc sau 2 – 2,5 tháng.Giai đoạn này gọi là quá trình ủ chín Tuy vậy, quá trình ủ chín Fomat vẫn được tiếptục một thời gian nữa cho fomat hoàn toàn chín Trong thời gian này casein tiếp tụcđược phân giải thành đạm dưới tác dụng của enzyme Rennin và vi khuẩn lactic Khifomat chín thì 2/3 casein được phân giải thành pepton, acid amin và một ít NH3

Fomat được bảo quản lạnh, bao gói bằng một số vật liệu thích hợp, cách ẩm vàchống oxy hóa tốt để sử dụng lâu dài và vận chuyển đi xa

2.2 Ứng dụng protease trong công nghệ sản xuất nước mắm

Nước mắm là loại thực phẩm, gia vị giàu dinh dưỡng, chứa nhiều loại acidamin, đặc biệt là các loại acid amin không thay thế Nhờ hệ enzyme có sẵn do hệ visinh vật sống trong ruột cá, các protid của cá được thủy phân thành acid amin, peptid

Thành phần đạm có trong nước mắm:

Đạm toàn phần 13 – 30g/lĐạm formon 12 – 18g/lĐạm NH3 4 – 6g/l2.2.1 Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm

Gồm 3 hệ enzyme lớn:

 Hệ enzyme Metalo-protease (Aminodipeptidase):

Hệ enzyme này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối caonên ngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau.Loại enzyme này có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đốivới các loại peptid Đây là nhóm thủy phân enzyme trung tính, pH tối thích từ5–7, pI = 4–5, nó ổn định với ion Mg2+, Ca2+và mất hoạt tính với Zn2+, Ni2+,

Pb2+, Hg2+

 Hệ enzyme serin-protease:

Điển hình là enzyme trypsin, tồn tại nhiều trong nội tạng của cá Ở giai đoạnđầu của quá trình sản xuất nước mắm hoạt động của nó yếu đến tháng thứ 2 vàphát triển dần đạt giá trị cực đại ở tháng tứ 3 rồi giảm dần đến khi chượp chín(protein phân giải gần như hoàn toàn không còn ở dạng pepton) Hệ enzymenày luôn bị ức chế bởi chuỗi acid amin trong cấu trúc của enzyme Để tháo gỡchuỗi này phải nhờ đến hoạt động của men cathepsin B nhưng men cathepsin

B dễ bị ức chế bởi nồng độ muối cao Vì vậy để men cathepsin B hoạt độngđược người ta thực hiện phương pháp cho muối nhiều lần Enzyme serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5–10, mạnh nhất ở pH=9

 Hệ enzyme acid-protease:

Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzyme cathepsin D Hệ enzyme này

dễ bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường nó chỉ tồn tại một thờigian ngắn ở đầu thời kỳ của quá trình thủy phân Loại men này đóng vai tròthứ yếu trong quá trình sản xuất nước mắm

2.2.2 Quá trình sản xuất nước mắm xảy ra theo 3 pha

 Pha 1 (trong khoảng 25 ngày đầu): Có sự gia tăng thể tích của phần chất

lỏng nổi ở trên bề mặt sản phẩm và protein hòa tan

 Pha 2 (80 – 120 ngày): Mô tế bào bị phá vỡ, protein của tế bào trở nên tiếp

xúc với enzyme, sản phẩm của quá trình tự phân protein được phóng thích.Hầu như tất cả mô tế bào đều bị phân hủy và biến mất sau 120 – 140 ngày

 Pha 3 (140 – 200 ngày): Enzyme phóng thích và tấn công vào các phần

protein hòa tan Đây là nguyên nhân làm thay đổi hợp chất Nitơ

Ngoài ra đường, chất béo cũng bị phân giải thành rượu và các acid hữucơ