ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự nảy mầm và sinh trưởng của cà rốt (daucus carota l ) và xà lách (lactuca sativa l )

Ảnh hưởng của sự phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và độc tố microcystin trên sự phát triển của cây mầm .... Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự phát triển của cây mầm

Quách Văn Lợi

ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘC TỐ VI KHUẨN

XÀ LÁCH (Lactuca sativa L.)

Thành ph ố Hồ Chí Minh – 2015

Quách Văn Lợi

ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘC TỐ VI KHUẨN

XÀ LÁCH (Lactuca sativa L.)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS ĐÀO THANH SƠN

TS TRẦN THANH HƯƠNG

Thành ph ố Hồ Chí Minh - 2015

Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi

K ết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công

b ố trong bất kì công trình nào

Các trích d ẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài

li ệu tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định

TP H ồ Chí Minh, ngày 20 tháng 03 năm 2015

Quách Văn Lợi

TS ĐÀO THANH SƠN, khoa Môi trường và Tài nguyên – Đại học Bách

Khoa TP Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn

TS TR ẦN THANH HƯƠNG, Bộ môn Sinh Lý thực vật – Đại học Khoa học

Tự nhiên TP Hồ Chí Minh đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và làm luận văn

Ban giám hiệu, phòng đào tạo Sau đại học, ban chủ nhiệm khoa Sinh học và

bộ môn Sinh lý thực vật trường đại học Sư Phạm TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập và làm luận văn ở trường

Các Thầy, Cô trong bộ môn sinh lý thực vật trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc gia TPHCM đã hỗ trợ cho em trong suốt thời gian làm luận văn ở trường

Các Thầy, Cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và góp nhiều ý kiến cho

luận văn của em

ThS Nguyễn Thanh Sơn công tác tại phòng thí nghiệm Độc học môi trường –

Viện Môi trường và Tài nguyên – ĐH Quốc gia TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

ThS Hồ Thị Mỹ Linh công tác tại phòng thí nghiệm Sinh lý Thực vật – Đại

học Sư Phạm TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn

Các bạn học viên lớp Sinh học thực nghiệm khóa 23 đã động viên, giúp đỡ tôi

suốt quá trình làm luận văn

Cuối cùng, con xin cảm ơn gia đình đã luôn tạo điều kiện tốt nhất con trong

suốt quá trình học tập và làm luận văn

QUÁCH VĂN LỢI

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Độc tố vi khuẩn lam 3

1.2 Nghiên cứu về ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên thực vật trên thế giới 5

1.3 Nghiên cứu về độc tố vi khuẩn lam ở việt nam 7

1.4 Giới thiệu về cà rốt và xà lách 10

1.1.1 Cây cà rốt 10

1.1.2 Cây xà lách 11

1.5 Phát triển của thực vật 11

1.6 Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự nảy mầm và tăng trưởng của cây mầm 13

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu 17

2.1.1 Thực vật 17

2.1.2 Độc tố vi khuẩn lam 17

2.1.3 Vật liệu sử dụng cho sinh trắc nghiệm 17

2.2 Thiết kế thí nghiệm 18

2.2.1 Khảo sát các biến đổi hình thái của hột trong quá trình nảy mầm 18

cà rốt và xà lách 18

2.2.4 Đo cường độ hô hấp của cây mầm cà rốt và xà lách 19

2.2.5 Đo hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có trong cây mầm xà lách và cà rốt 19

2.2.6 Ảnh hưởng của sự phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và độc tố microcystin trên sự phát triển của cây mầm 23

2.3 Xử lý số liệu 23

2.4 Thời gian và nơi thực hiện đề tài 23

Chương 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 24

3.1 Kết quả 24

3.1.1 Các biến đổi hình thái trong quá trình nảy mầm 24

3.1.2 Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự nảy mầm 26

3.1.3 Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự phát triển của cây mầm cà rốt và xà lách 27

3.1.5 Sự thay đổi hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dưới ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam 44

3.1.6 Ảnh hưởng kết hợp giữa độc tố vi khuẩn lam và chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự phát triển của cây mầm 46

3.2 Thảo luận 55

3.2.1 Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam trên sự nảy mầm 55

3.2.2 Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự tăng trưởng của cây mầm 56

3.2.4 Mối liên hệ giữa độc tố vi khuẩn lam và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển của cây mầm 58

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 61TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC

ABA: Abcisic acid

ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

GA3: Gibberellic acid

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

IAA: Indole-3-acetic acid

MC: Microcystin

POD: Peroxidase

SOD: Superoxide dismutase

Bảng 3.1 Tỉ lệ nảy mầm của hột cà rốt và xà lách 27

Hình 1.1 Cây mầm mù tạt (Sinapis alba L.) sau 7 ngày xử lý với độc tố microcystin 5

Hình 1.2 Cây cải dầu sau 10 ngày xử lý với microcystin ở các nồng độ khác nhau 6

Hình 1.3 Cây cà rốt 10

Hình 1.4 Cây xà lách 11

Hình 2.1 Sơ đồ ly trích các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 21

Hình 3.1 Các giai đoạn trong quá trình nảy mầm của hột cà rốt 25

Hình 3.2 Các giai đoạn trong quá trình nảy mầm của hột xà lách 25

Hình 3.3 Sự thay đổi trọng lượng tươi của hột cà rốt và xà lách trong quá trình nảy mầm 26

Hình 3.4 Chiều dài rễ cà rốt sau 2 ngày xử lý với độc tố vi khuẩn lam từ mẫu tạo váng 28

Hình 3.5 Cây mầm xà lách 7 ngày sau khi xử lý với dịch chiết từ mẫu tạo váng (SCUM) chứa độc tố ở những nồng độ microcystin khác nhau 29

Hình 3.6 Cây mầm xà lách sau 7 ngày thí nghiệm với độc tố vi khuẩn lam từ dịch chiết mẫu tế bào in vitro 30

Hình 3.7 Chiều dài rễ cà rốt ở những nghiệm thức khác nhau 31

Hình 3.8 Chiều dài rễ xà lách ở những nghiệm thức khác nhau 32

Hình 3.9 Chiều dài trụ hạ diệp cà rốt ở những nồng độ độc tố khác nhau 34

Hình 3.10 Chiều dài trụ hạ diệp xà lách ở những nồng độ độc tố khác nhau 35

Hình 3.11 Cây mầm xà lách 4 ngày sau khi xử lý với độc tố vi khuẩn lam từ dịch chiết mẫu tế bào in vitro 36

Hình 3.12 Trọng lượng tươi của cây mầm cà rốt ở các nồng độ độc tố khác nhau 38

Hình 3.13 Trọng lượng tươi của cây mầm xà lách ở các nồng độ độc tố khác nhau 39

Hình 3.14 Đường kính của cây mầm cà rốt và xà lách ở các nồng độ độc tố khác nhau 40

Hình 3.15 Cường độ hô hấp của cây mầm cà rốt ở các nồng độ độc tố khác nhau 42

Hình 3.16 Cường độ hô hấp của cây mầm xà lách ở các nồng độ độc tố khác nhau 43

Hình 3.18 Chiều dài rễ cà rốt sau khi xử lý với độc tố kết hợp chất điều hòa tăng

trưởng thực vật 47 Hình 3.19 Chiều dài rễ xà lách sau khi xử lý với độc tố kết hợp chất điều hòa tăng

trưởng thực vật 48 Hình 3.20 Chiều dài trụ hạ diệp cà rốt sau khi xử lý với độc tố kết hợp chất điều

hòa tăng trưởng thực vật 50 Hình 3.21 Chiều dài trụ hạ diệp xà lách sau khi xử lý với độc tố kết hợp chất điều

hòa tăng trưởng thực vật 51 Hình 3.22 Khối lượng cà rốt sau khi xử lý với độc tố kết hợp chất điều hòa tăng

trưởng thực vật 53 Hình 3.23 Khối lượng xà lách sau khi xử lý với độc tố kết hợp chất điều hòa tăng

trưởng thực vật 54

MỞ ĐẦU

 Lí do ch ọn đề tài

Việc gia tăng dân số, phát triển các ngành công nghiệp, nông nghiệp đã và đang làm gia tăng đáng kể các chất dinh dưỡng trong các thủy vực Nguồn nước mặt giàu dinh dưỡng đặc biệt là nitơ và phospho, thường dẫn đến sự thay đổi của quần xã thực

vật nổi và quần xã có xu hướng thống trị bởi vi khuẩn lam (hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam) Các chất dinh dưỡng (nitơ và phospho) là nguyên nhân chính gây nên hiện tượng phú dưỡng xảy ra ở hơn 54% hồ nước ngọt ở khu vực châu Á Thái Bình Dương trong nhiều năm trở lại đây

Nở hoa của vi khuẩn lam gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng nước như gây mùi khó chịu, làm giảm, cạn kiệt nguồn oxi hòa tan trong nước, làm giảm đa dạng sinh

học Nở hoa của vi khuẩn lam xuất hiện trong nhiều điều kiện môi trường, trong đó 25-75% các trường hợp nở hoa kèm theo sự hiện diện của độc tố vi khuẩn lam Vi khuẩn lam có thể tiết ra những hợp chất thứ cấp trong đó có các độc tố Độc tố vi khuẩn lam có nhiều loại khác nhau, trong đó microcystin là độc tố có cường độ mạnh

và phổ biến nhất, với hơn 80 dạng đồng phân khác nhau đã được xác định Sự có mặt

của những độc tố này trong các thủy vực gây ảnh hưởng xấu đến những sinh vật sống trong thủy vực đó Bên cạnh đó, việc sử dụng những nguồn nước có chứa những loại độc tố này nhằm phục vụ cho mục đích sinh hoạt có thể có những ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người Ngoài ra, khi sử dụng cho hoạt động tưới tiêu trong nông nghiệp cũng có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của thực vật, từ đó làm ảnh hưởng đến năng suất cây trồng

Nhiều nghiên cứu về độc tính của độc tố vi khuẩn lam trên thế giới đã được tiến hành, tuy nhiên công bố về độc tính vi khuẩn lam và độc tố của chúng có nguồn gốc

Việt nam thì vẫn còn rất khiêm tốn, rời rạc, những nghiên cứu chủ yếu tập trung vào động vật, trong khi đó ảnh hưởng của thực vật vi khuẩn lam lên thực vật thì vẫn chưa được quan tâm, nghiên cứu sâu Do đó, đề tài “Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên

sự nảy mầm và sinh trưởng của cà rốt (Daucus carota L.) và xà lách (Lactuca sativa

L.)” được đề xuất, với nguồn độc tố vi khuẩn lam lấy từ hồ Dầu Tiếng – hồ chứa cung

cấp nước sinh hoạt và nông nghiệp cho một số tỉnh Đông Nam Bộ Theo những nghiên

cứu gần đây cho thấy hàm lượng microcystin trong nước hồ khá cao, do đó việc sử

dụng nước hồ Dầu Tiếng chứa đựng mối nguy hiểm tiềm tàng đối với mùa màng và

sức khỏe con người

 M ục đích nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam từ hồ Dầu Tiếng lên sự nảy mầm

và phát triển của cây cà rốt và xà lách

 Gi ới hạn - phạm vi nghiên cứu

Tìm hiểu ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự nảy mầm và phát triển của

hột cà rốt và xà lách ở giai đoạn tăng trưởng trong khoảng thời gian 7 ngày tuổi trong

điều kiện phòng thí nghiệm

 Ý nghĩa khoa học

Đóng góp thêm kiến thức về sự tác động của độc tố vi khuẩn lam có nguồn gốc

Việt Nam lên sự nảy mầm và phát triển ở cà rốt và xà lách

 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài sẽ góp phần đánh giá độc tính sinh thái của vi khuẩn lam có nguồn gốc từ Việt Nam, khả năng ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam từ hồ Dầu Tiếng lên sản lượng nông nghiệp (cà rốt, xà lách) ở địa phương khi sử dụng nước hồ làm nước tưới trực tiếp cho cây trồng

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Độc tố vi khuẩn lam

Vi khuẩn lam (cyanobacteria, cyanoprokaryota, cyanophyta, blue-green algae), còn có tên là tảo lam Chúng là một trong những sinh vật xuất hiện sớm nhất trên Trái đất và tồn tại qua hàng tỉ năm Vi khuẩn lam hầu như có mặt ở khắp mọi nơi, có khả năng chống chịu cao hơn so với thực vật đối với các điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao, ánh sáng thấp, cạn kiệt dinh dưỡng [33]

Vi khuẩn lam là những sinh vật chưa có màng nhân, và có khả năng quang tự dưỡng vô cơ và dùng H2O làm chất cho điện tử trong quá trình quang hợp Vi khuẩn lam chứa chlorophyll a và các sắc tố như phycocyanin, phycobiliprotein Một số loài

có sắc tố đỏ phycoerythrin, chúng phối hợp với sắc tố lục tạo nên màu nâu Vi khuẩn lam có thể đơn bào hoặc đa bào dạng sợi, không di động hoặc di động bằng cách trườn (gliding), một số loài có túi khí (gas vesicles) Nhiều loài có dị bào (heterocysts) và có khả năng cố định nitơ Vi khuẩn lam sống đơn lẻ hoặc liên kết với nhau tạo thành các tập đoàn hình cầu hoặc các bó sợi lớn, có thể nhìn thấy bằng mắt thường Chúng phát triển trong các môi trường khác nhau, từ nước ngọt đến nước mặn, thậm chí sống trên đất ẩm hoặc cộng sinh trên các loài thực vật bậc cao thuộc họ đậu [33]

Trong thủy vực, vi khuẩn lam có thể chiếm đến 99,8% tổng mật độ thực vật phù

du Đồng thời chúng có thể dễ dàng nở hoa trong nhiều điều kiện môi trường trên khắp thế giới và ước tính khoảng 25 – 75% những nở hoa vi khuẩn lam có kèm theo độc tố

Vi khuẩn lam nở hoa có thể hủy hoại cảnh quan, ô nhiễm môi trường nước vì chúng gồm nhiều loài có thể sản sinh độc tố, ảnh hưởng xấu đến chất lượng nước Hơn 60

loài vi khuẩn lam có độc tố đã được liệt kê thuộc các giống như Microcystis,

Anabaena, Aphanizomenon, Planktothrix, Cylindrospermopsis, Anabaenopsis, Nostoc, Raphidiopsis, Nodularia Một chủng vi khuẩn lam có thể sản sinh ra nhiều loại độc tố, ngược lại một loại độc tố có thể được tạo ra bởi nhiều loài vi khuẩn lam có độc [16]

Dựa trên độc tính ảnh hưởng lên động vật, độc tố vi khuẩn lam được theo làm 5 nhóm như sau: (i) độc tố gan (hepatoxins) bao gồm: microcystins, nodularins; (ii) độc

tố thần kinh (neurotoxins) bao gồm: anatonxin-a, anatoxin-a(S), homoanatoxin-a; (iii) độc tố gây ngứa da, tiêu chảy: aplysiatoxins, debromoaplysiatoxin; (iv) nhóm độc tố tế bào: cylindrospermopsin (gây đột biến nhiễm sắc thể hay đứt gãy DNA); (v) nội độc tố lipopolysaccharides

Ngoài ra, hàng trăm hợp chất có hoạt tính sinh học đã được tìm thấy trong nhiều chi vi khuẩn lam như Microcystis, Planktothrix, Oscillatoria, Aphanizomenon,

Anabaeba, Cylindrospermopsis, Nostoc, Nodularia, Lyngbya, Schizothrix, Plectonema, Westiellopsis, Scytonema và Hapalosiphon [33]

Độc tố microcystin (MC) dùng thí nghiệm được tạo ra từ nhiều chi vi khuẩn lam khác nhau như: Microcystis, Anabaena, Planktothrix, Nostoc, Anabaenopsis,

Hapalosiphon, Arthrospira fusiformis, Annamia toxica, Merismopedia tenuissima, Leptolyngbya boryana MC là cấu trúc dạng vòng phổ biến, được mô tả là một

heptapeptide dạng vòng chứa D- và L-amino acid cộng với N-methylldehydroalanine

và một nhóm β-amino acid duy nhất bên cạnh, acid trymethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic Những đồng phân của MC khác nhau cơ bản ở hai L-amino acid, và khác nhau thứ hai là sự hiện diện hoặc biến mất của nhóm methyl

3-amino-9-methoxy-2-6,8-trên acid D-erythro- β-methylaspartic (D-MeAsp) và/hoặc N-methyldehydroalanine

(Mdha) [33]

Cơ chế gây độc của microcystins liên quan chặt chẽ với quá trình ức chế protein phosphatases 1 và 2A Sự ức chế protein này dẫn đến quá tải quá trình phosphoryl hóa của những cấu trúc dạng sợi, sau đó bộ xương tế bào bị thoái hóa và phá vỡ cấu trúc tế bào Sự co rút của tế bào gan từ những tế bào lân cận và những mao

mạch hình sin làm máu trở nên ức đọng trong những mô gan Kết quả sau cùng là phá

hủy những mô gần đó, bộ phận bị hư hại và gây xuất huyết [33]

1.2 Nghiên cứu về ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên thực vật trên thế giới

Kurki-Helasmo và Meriluoto (1998) đã nghiên cứu về tác động của MC lên sự

phát triển của hột giống mù tạt (Sinapis alba L.) sau 7 ngày xử lý độc tố ở những nồng

độ khác nhau Dạng đồng phân MC-RR ức chế sự phát triển của cây con và hình thành những cây con dị dạng ở nồng độ MC ≥ 5,0 μg/mL MC-LR ức chế quá trình khử phospho của những protein bên trong cây dẫn đến những rối loạn trong sự phát triển rễ

và những bộ phận khác Đặc điểm của những cây con bị ức chế sự kéo dài rễ và lá non [21] Pfugmacher (1998) cho rằng MC gây ức chế chuyển hóa và phát triển thực vật sau khi cho hấp thu MC bởi một số loài cây thủy sinh

Hình 1.1 Cây mầm mù tạt (Sinapis alba L.) sau 7 ngày xử lý với độc tố microcystin

(MC); từ trái sang: 20 mg MC/L; đối chứng; 5 mg MC/L (Kurki-Helasmo và Meriluoto, 1998)

McElhiney (2001) đã khảo sát sự ức chế của MC ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật, bằng cách cho xử lý những cây trồng trên giá thể là khăn giấy Thí

nghiệm cho thấy MC ức chế sự phát triển cây khoai tây và mù tạt dưới điều kiện

phòng thí nghiệm Cây Solanum tuberosum có chứa chất diệp lục bị ức chế bởi

MC-LR ở nồng độ 0,005 và 0,05 μg/mL Độc tố có ảnh hưởng rất ít trên cây 18 ngày tuổi, tuy nhiên khi cho xử lý với độc tố, cây con có bộ rễ kém phát triển, làm giảm 30% lượng nước hấp thu so với những cây không xử lý Xử lý MC qua nước tưới chứa độc

tố vi khuẩn lam đe dọa đến chất lượng và sản lượng vụ mùa trong canh tác [30]

Trong một khảo sát khác, dịch chiết chứa độc tố vi khuẩn lam nở hoa thu từ hồ Dianchi ở tây nam Trung Quốc được dùng để đánh giá ảnh hưởng của MC lên cây cải

dầu (Brassica napus) và cây lúa (Oryza sativa) Thí nghiệm được tiến hành trong

khoảng nồng độ dịch chiết (0; 0,024; 0,12; 0,6 và 3μg MC-LR/ml) Nghiên cứu chỉ ra

rằng sự xử lý MC ức chế sự phát triển của lúa và hột cải, tuy nhiên, MC có tác dụng ức

chế mạnh mẽ trên cây cải dầu hơn cây lúa về tỉ lệ nảy nầm của hột và chiều cao cây con MC ức chế đáng kể sự dài ra của rễ gốc của cây cải dầu và cây lúa con Sử dụng ELISA, MC được kiểm tra từ dịch chiết của cây cải dầu và cây lúa con bị nhiễm, chỉ ra

rằng khả năng hấp thụ của thực vật xử lý MC thông qua hút nước có thể gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe [13]

Hình 1.2 Cây cải dầu sau 10 ngày xử lý với microcystin ở các nồng độ khác nhau; từ trái sang: 3; 0,6; 0,12; 0,024; 0 mg/L (Chen và cs., 2004)

Chen và cộng sự (2004) đã nghiên cứu ảnh hưởng của MC lên hoạt động của enzyme kháng oxi hóa superoxide dismutase (SOD) và peroxidase (POD) của cây cải

dầu (Brassica napus) và cây lúa (Oryza sativa) Sau 10 ngày thí nghiệm, cho kiểm tra

hoạt tính SOD và POD của cây lúa và cây cải dầu cho thấy MC có ảnh hưởng xấu lên

hoạt tính của SOD và POD trên cây cải dầu Hoạt tính của SOD giảm khi nồng độ MC tăng lên Xác định hoạt tính của POD và SOD cho thấy nồng độ MC cao dẫn đến quá

tải oxi hóa Ngược lại, MC thúc đẩy hoạt động POD trên cây cải dầu, hoạt động của POD ở nồng độ 3 μg/mL được tăng cường rõ rệt So sánh cây cải dầu và cây lúa xử lý cho thấy phản ứng khác nhau trong hoạt động của SOD và POD MC ở nồng độ thấp (0,024 – 0,12 μg/mL) gây gia tăng hoạt tính của SOD trong cây lúa, trong khi đó sự gia tăng rất ít ở nồng độ độc tố cao hơn (0,6 – 3 μg/mL) [13]

Peuthert và Pflugmacher (2010) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của MC-LR

đến tocopherol trong cây mầm Alfalfa (Medicago sativa) Trong nghiên cứu này tác động của MC-LR và mẫu dịch chiết thô Microcystis (Mic-CE) chứa MC-LR với

tocopherol và mẫu gen của Homogentisate phytyltransferase (HPT), bao gồm sự tổng

hợp tocopherol, được khảo sát trên cây mầm Medicago sativa Xử lý trong môi trường

với nồng độ thích hợp cho thấy Mic-CE tác động đến tocopherols ở nồng độ thấp hơn

với độc tố tinh khiết Sự thay đổi trong 3 ngày xử lý với 0,5 μg/L MC-LR và Mic-CE

cho thấy sự gia tăng mạnh mẽ α- và tocopherol, trong khi ảnh hưởng trên tocopherol mạnh hơn nhiều so với trên α-tocopherol HPT mRNA tăng lên sau 24 và

β-27 giờ xử lý với MC-LR Do đó, kết quả cho thấy dù ở nồng độ thấp trong nước nhưng

độc tố vi khuẩn lam lại có ảnh hưởng mạnh với tocopherol trong cây mầm M sativa,

vì vậy gây stress cho cây trồng [34]

1.3 Nghiên cứu về độc tố vi khuẩn lam ở việt nam

Vi khuẩn lam và độc tố MC trong các thủy vực nước ngọt Việt Nam đã được ghi nhận Sự bùng phát vi khuẩn lam và hiện diện độc tố của chúng xảy ra với cường

độ và tần suất ngày càng cao hơn [18] Tuy nhiên những công bố về độc tính của vi

khuẩn lam và độc tố vi khuẩn lam có nguồn gốc Việt Nam lên sinh vật còn vẫn còn ở

những bước đầu tiên trong nghiên cứu

Công trình nghiên cứu về vi khuẩn lam và độc tố microcystin tại hồ núi Cốc (Thái Nguyên) vào năm 2011 cho thấy vi khuẩn lam là nhóm chiếm ưu thế trong quần

xã thực vật nổi ở hồ Núi Cốc Nhóm vi khuẩn lam sản sinh độc tố gan Microcystis là

thành phần chính trong các mẫu nước và các mẫu tạo váng thu tại hồ Núi Cốc với hàm

lượng độc tố dao động trong khoảng 0,11-0,52 µg/L và 48-1699 µg/L tương ứng Việc phát hiện các loài vi khuẩn lam và độc tố của chúng cho thấy nguy cơ ô nhiễm từ các loài tảo gây hại và độc tố tại hồ Núi Cốc Nghiên cứu cũng cho thấy khả năng ảnh hưởng đến sức khỏe con người khi sử dụng nguồn nước này cung cấp nước sinh hoạt

Do vậy, cần đưa vi khuẩn lam và độc tố của chúng vào chương trình quan trắc chất lượng nước tại các thủy vực [6]

Trong nghiên cứu về hình thái và khả năng sinh độc tố cylindrospermopsin được

thực hiện tại một số thủy vực ở Việt Nam vào năm 2011 đã phân lập được 28 chủng vi khuẩn lam có khả năng sinh độc tố Cylindrospermopsin, thuộc các chi

Cylindrospermopsis, Aphanizomenon, Anabaena và Raphidiopsis Phân tích hình thái

và thăm dò khả năng sinh độc tố bằng phương pháp ELISA cho thấy có 14 chủng phát

hiện có độcc tố cylindrospermopsin trong mẫu nuôi cấy, điều này có thể ảnh hưởng

trực tiếp hoặc gián tiếp đến sức khỏe con người trong thủy vực [6]

Nghiên cứu của Đào Thanh Sơn và cộng sự (2013) về sự ảnh hưởng của độc tố

vi khuẩn lam thu từ mẫu tạo váng (scum) thu từ hồ Dầu Tiếng lên các giai đoạn phát

triển của phôi cá ngựa vằn, cho thấy có sự giảm tỷ lệ trứng nở sau khi cho trứng cá xử

lý với mẫu chứa độc tố MC ở nồng độ 50µg/L và mẫu dịch chiết của vi khuẩn lam

Arthrospira không chứa MC Với nồng độ cao MC (200 µg/L) thì có sự giảm mạnh về

tỷ lệ trứng nở Ngoài ra, tỷ lệ tử vong của cá sau khi nở cũng tăng lên sau 11 ngày xử

lý mặc dù được nuôi ở môi trường không chứa độc tố Bên cạnh đó, nghiên cứu này cũng ghi nhận những dị dạng khác thường của phôi cá trong quá trình phát triển khi xử

lý với độc tố [17]

Một số loài vi khuẩn lam mặc dù không sản sinh độc tố MC và cylindrospermopsin, nhưng dịch chiết của chúng với hàm lượng 10 mg trọng lượng khô/L, có ảnh hưởng xấu đến những đáp ứng sinh hóa trong cơ thể Daphnia magna, cụ

thể là làm gia tăng hoạt tính của các enzyme chuyển hóa sinh học đặc biệt là catalase Ngoài ra trong nghiên cứu này, nhóm tác giả cũng làm thí nghiệm khảo sát sự thay đổi hành vi của D magna khi nuôi trong môi trường có chứa các loài vi khuẩn lam không

sản sinh MC và cylindrospermopsin với mật độ 400.000 tế bào/mL Kết quả cho thấy hành vi của Daphnia magna bị thay đổi (hoạt động bơi, vị trí trong cột nước) Những

thay đổi về sinh lý và hành vi gây ra hiện tượng stress, có thể làm giảm tổng hiệu suất

của nhóm động vật phù du trong điều kiện tiếp xúc mãn tính ở môi trường thực tế

Ảnh hưởng cấp tính của Microcystis aeruginosa ở hồ Dầu Tiếng lên vi giáp xác

được Đào Thanh Sơn và cộng sự thực hiện năm 2013 Nghiên cứu cho thấy hàm lượng microcystin từ chủng M aeruginosa lên đến 3733 µg/g trọng lượng khô Kết quả đánh

giá ảnh hưởng cấp tính (LC50-24h) của các chủng M aeruginosa lên ba loài vi giáp xác Daphnia magna, Ceriodapnia cornuta, Moina dubia lần lượt là 6,7x106

, 8,9x106, 4,4x106 Theo nhóm tác giả, đây là công bố đầu tiên về ảnh hưởng cấp tính của M

aeruginosa lên ba loài vi giáp xác Daphnia magna, Ceriodapnia cornuta, Moina dubia

[14]

Công bố đầu tiên về ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam có nguồn gốc Việt Nam lên thực vật được tiến hành trên ba loài họ cải: cải bẹ trắng (Brassica rapa-

chinensis), c ải misome Nhật (Brassica narinose), cải xà lách soong Pháp (Nasturtium

officinale) X ử lý hột giống với mẫu mẫu tạo váng và dịch chiết từ mẫu tạo váng thu ở

hồ Dầu Tiếng (chủ yếu là các loài Microcystis) Theo dõi chiều dài rễ, thân mầm và

trọng lượng cây mầm cho thấy có sự giảm trọng lượng tươi chiều dài rễ và thân mầm

so với lô thí nghiệm đối chứng không có độc tố Ngoài ra, sự thay đổi hình dạng lá, màu sắc lá so với mẫu đối chứng cũng được ghi nhận ở loài Brassica rapa-chinensis

[15]

Nhìn chung những nghiên cứu về độc tính của vi khuẩn lam và độc tố của vi khuẩn lam có nguồn gốc Việt Nam chưa nhiều, chủ yếu tập trung vào đối tượng động

vật thủy sinh Sự ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự phát triển thực vật chỉ ở bước khởi đầu, tập trung vào tìm hiểu sự thay đổi hình thái ngoài của thực vật, do đó

đề tài “Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự thay đổi hình thái ở cà rốt

(Dacus carota L.) và xà lách (Lactuca sativa L.)” được đề xuất thực hiện nhằm mục tiêu khảo sát sự ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên quá trình nảy mầm để đánh giá độc tính của độc tố vi khẩn lam có nguồn gốc Việt Nam

Loài: Daucus carota L Hình 1.3 Cây cà rốt (nguồn: internet)

Cà rốt (hình 1.3) là loài thực vật thân cỏ, sống đến 2 năm, cao từ 30 đến 100

cm Thân tiết diện tròn, mặt ngoài có nhiều khía dọc và lông cứng, tủy xốp Thân non màu xanh lục, thân già màu xanh lục ở lóng, màu tía ở mấu Toàn cây có chất nhựa màu vàng trong Rễ củ hình tháp ngược, màu vàng cam, mọng nước, dài 13-15 cm, khi già xuất hiện rễ con phân nhánh dài 3-5 cm Lá đơn, mọc cách; phiến lá xẻ lông chim 2-3 lần ở đáy càng về đỉnh xẻ thùy ít hơn, dài 14-20 cm, rộng 15-30 cm; thùy hình bản

hẹp dài 1,5-3 cm, tận cùng là một răng nhọn, 2 mặt lá màu xanh lục Gân lá hình lông chim, mặt trên lõm, mặt dưới lồi và có khía dọc màu trắng, 7-10 cặp gân phụ Cuống

lá chỉ có ở các lá gần gốc, hình lòng máng không đối xứng, dài 8,5-16 cm, màu tía lẫn

xanh, mặt trong nhẵn, mặt ngoài có khía dọc bẹ lá dài 3,5-5 cm, rộng 1,3-1,5 cm, màu tím ở lá già, màu xanh có đốm tím ở lá non, mặt ngoài có nhiều khía dọc, mép khô xác

dạng màng mỏng màu trắng có nhiều lông cứng ở rìa Lá không có lá kèm Cụm hoa

dạng tán kép đường kính 9-10 cm, mọc ở đầu cành, gồm rất nhiều tán con [1], [2],[40] Ngoài việc sử dụng cà rốt như thực phẩm thì hiện nay con người còn sử dụng cà rốt như một nguồn dược liệu do chứa nhiều loại tinh dầu như pinen, limonen, daucola [5]

Loài: Lactuca sativa L

Hình 1.4 Cây xà lách (nguồn: internet)

Xà lách (hình 1.4) là thực vật thân thảo, nhất niên, có rễ trụ và có xơ Thân hình

trụ và thẳng, cao tới 60 cm, phân nhánh ở phần trên Lá ở gốc xếp hình hoa thị, lá tạo thành búp dày đặc hình cầu; các lá ở thân mọc so le; lá có màu lục sáng, gần tròn hay thuôn, hình xoan ngược, lượn sóng, dài 6-20 cm, rộng 3-7 cm, mép có răng không đều

Cụm hoa chùy dạng ngù ở ngọn gồm nhiều đầu hoa, mỗi đầu có 20 hoa, hình môi màu vàng Quả bế nhỏ, dẹp, có khía màu xám với mào lông trắng [1], [2]

1.5 Phát triển của thực vật

Sự phát sinh hình thái thực vật là quá trình phát triển một cấu trúc hình thái mới thông qua sự phân chia, tăng trưởng và phân hóa tế bào Sự phát sinh hình thái được nghiên cứu ở nhiều mức độ tổ chức: cơ quan, mô, tế bào, phân tử Sự phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai quá trình căn bản: sự điều hòa hướng kéo dài tế bào, sự

kiểm soát vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia tế bào Chính kiểu tăng trưởng của

mọi tế bào riêng rẽ quyết định hình thái của cơ quan và cơ thể thực vật Sự phát sinh hình thái liên quan một cách toàn diện tới nguồn gốc và sự phát triển hình thái thực

vật, những kỹ thuật từ nhiều lĩnh vực khác nhau: mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học, di truyền học đều có thể giúp nghiên cứu hiện tượng phát sinh hình thái [9]

Sự phát triển cơ quan rễ được thực hiện nhờ mô phân sinh ngọn rễ Trong vùng kéo dài, các tế bào dẫn xuất từ mô phân sinh ngọn vừa kéo dài vừa phân hóa Mô phân sinh ngọn rễ vừa có khả năng tạo mô vừa có khả năng tạo cơ quan Ở thực vật hai lá

mầm, sự tăng trưởng rễ theo đường kính được thực hiện nhờ các tầng phát sinh libe –

mộc và sube – nhu bì; các tầng này có chức năng tạo mô Ở thực vật một lá mầm, sự tăng trưởng theo đường kính được thực hiện nhờ sự phát triển của các tổ chức sơ cấp

có nguồn gốc từ mô phân sinh ngọn [9]

Sự phát triển cơ quan chồi được thực hiện nhờ mô phân sinh ngọn chồi Đặc điểm của mô phân sinh ngọn chồi là sự phân thành nhiều lớp và vùng Mô phân sinh

ngọn chồi thường được chia thành ba vùng chính: (1) vùng đỉnh: hoạt tính phân chia

thấp, là vùng mô phân sinh chờ, chỉ hoạt động khi mô phân sinh ngọn chuyển sang

trạng thái sinh sản; (2) vùng bên: hay vùng phát sinh cơ quan, có hoạt tính phân chia cao – là nơi phát sinh các lá và các mô của thân; (3) vùng lõi: hoạt tính phân chia có đặc tính trung gian so với hai vùng đỉnh và bên, đây là vùng phát sinh mô, chỉ cho mô lõi [9]

Sự phát triển phôi hợp tử: ở các cây song tử diệp, sự phân chia không cân xứng đầu tiên của phôi cho ra tế bào gốc với không bào lớn và tế bào ngọn với không bào

nhỏ hơn có nhân to và tế bào chất đậm đặc tế bào gốc sẽ phân chia theo hướng ngang

để hình thành một chuỗi tế bào nhỏ (tạo thành dây treo sau này) Tế bào yên – là tế bào

của dây treo gần với tế bào ngọn nhất sẽ hình thành nên các phần của rễ Tế bào ngọn phân chia đầu tiên theo hướng ngang và sau đó theo hướng dọc, hình thành nên các thành phần chủ yếu của phôi, phôi tiếp tục phát triển để cho các mô và cơ quan phôi [9]

Sự nảy mầm là toàn bộ các quá trình bắt đầu từ sự tái thu nước của hột cho tới

sự lú rễ mầm ra khỏi hột [9] Các đặc tính quan trọng nhất của sự nảy mầm là: hấp thu nước mạnh, hoạt tính biến dưỡng mạnh và phát sinh nhiệt mạnh Một cách tổng quát,

sự nảy mầm gồm ba giai đoạn chính: thu nước, nảy mầm và tăng trưởng của cây mầm Giai đoạn thu nước: xảy ra nhờ thế nước của hột thấp, sau đó nhờ lực thẩm thấu khi các không bào phát triển khiến hột thu nước mạnh và phồng lên Sự thu nước đi kèm

với sự gia tăng cường độ hô hấp, tái lập hoạt tính biến dưỡng Giai đoạn nảy mầm: bắt đầu bởi sự bảo hòa nước và cường độ hô hấp ở mức cao của hột, các phản ứng biến dưỡng bắt đầu, các chất dự trữ bị thủy giải và được phôi đồng hóa Kế đó, phôi tái lập các phân chia tế bào, vỏ hột bị rách, rễ mầm kéo dài ra Sự nảy mầm theo nghĩa hẹp được xem như hoàn thành khi rễ mầm lú ra khỏi các vỏ hột Giai đoạn tăng trưởng của cây mầm: hột thu thêm nước và tăng cường độ hô hấp, rễ mầm và thân mầm tăng đáng

kể hoạt tính biến dưỡng của cây mầm tăng mạnh, hoạt tính biến dưỡng của mô dự trữ

giảm mạnh, các chất dự trữ cạn dần [9]

1.6 Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự nảy mầm và tăng trưởng của cây mầm

Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật đóng vài trò quan trọng trong việc điều

chỉnh quá trình kéo dài tế bào, cơ quan Acid abscisic duy trì trạng thái ngủ của hột, ngược với gibberellin và ethylene Có sự tương tác giữa acid abscisic và gibberellin để điều chỉnh quá trình nảy mầm của hột [19], [24], 26]

Trong quá trình nảy mầm của hột, lượng acid abscisic giảm, hoạt tính cytokinin đặc biệt là gibberellin tăng đến trị số cao nhất Trong đó, acid abscisic đóng vai trò ngăn cản, cytokinin đóng vai trò cho phép và gibberellin đóng vai trò chủ đạo kích thích hột nảy mầm [3] Nếu có mặt chất kìm hãm thì phải có cả cytokinin và gibberellin để trung hòa chất kìm hãm đó Đối với hột có tính ngủ nghỉ cao thì cần

phải phá ngủ theo cơ chế hormone thực vật [29]

1.4.1 Auxin

Hầu hết các mô thực vật đều có khả năng tổng hợp auxin ở nồng độ thấp mô phân sinh ngọn chồi, lá non, trái và hột là những nơi tổng hợp auxin, sau đó auxin di chuyển tới rễ và được tích tụ trong đó [9], [24]

Auxin đóng vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái Đặc tính di chuyển và

hiệu ứng theo nồng độ của auxin quyết định chiều hướng và tính hữu cực trong sự phát sinh cơ quan [32] Từ khi auxin lần đầu được mô tả, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy sự liên hệ chặt chẽ giữa auxin với sự phát triển rễ Auxin giúp sự kéo dài tế bào, sự phân chia, sự phát triển và duy trì mô phân sinh ngọn rễ Một trong những hiệu ứng rõ nét

nhất của auxin đối với sự phân hóa tế bào đã được chứng thực từ năm 1934 (Went, Skoog, Thimann) là khả năng phát sinh rễ Hiệu ứng đó tạo nên một trong các ứng

dụng quan trọng của auxin hoặc các chất gần giống auxin, là cơ sở của tất cả các sản

phẩm thương mại nhằm xúc tiến sự giâm cành [3]

Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu ở lúa và tế bào vùng kéo dài dưới ngọn của thân, nhờ sự hấp thu các chất khoáng hòa tan [35] Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ, nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi rễ này Trong

sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp được), acid amin (như arginin), và nhất là các ortho – diphenolic (như acid cafeic, acid chlorogenic) Sự kéo dài tế bào rễ cần nồng độ auxin thấp hơn nhiều so với tế bào thân Ở nồng độ cao, auxin kích thích sự tạo mô sẹo từ các tế bào sống Đặc tính này được áp dụng trong nuôi cấy tế bào [9]

Gibberellin từ phôi cảm ứng sự tổng hợp α-amylase (ở cấp độ phiên mã) trong các lớp aleurone của hột ngũ cốc [20] Gibberellin gỡ bỏ sự ngủ và thúc đẩy sự nảy

mầm của các hột giống ngủ [23], [25]

Ở thuốc lá và rau diếp, gibberellin phá bỏ sự ngủ của hột, thúc đẩy sự vỡ của vỏ

hột và nội nhũ, tăng cường β-glucose trong nội nhũ và chống lại các hoạt động ức chế

của acid abscisic trong hột đang nảy mầm [36], [38]

Gibberellin ảnh hưởng rất rõ rệt lên sự sinh trưởng của các dạng đột biến lùn Ảnh hưởng đặc trưng của gibberellin lên sự ra hoa là kích thích sự sinh trưởng kéo dài

và nhanh chóng của cụm hoa Trong biểu hiện phái tính của hoa, gibberellin ức chế phát triển của hoa cái [10], kích thích sự tạo hoa đực [9]

Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật, gibberellin làm giảm bớt

hoặc ngăn cản sự tạo chồi, rễ bất định và sự phát sinh phôi soma Ở mô sẹo cây thuốc

lá, GA3 đặc biệt có tác dụng làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi khi nó có mặt vào giai đoạn hình thành đỉnh sinh trưởng và cản mạnh hơn khi mẫu cấy được nuôi trong tối Thông thường GA3 có tác dụng cản sự ra rễ và khi xử lý giâm cành với GA3

ở nồng độ cao (1-10 mg/L) ở ngay vị trí đáy cành giâm thì cành này sẽ không tạo được

rễ Ở một số loài thực vật, xử lý GA3 trước khi chuyển cành giâm vào môi trường ra rễ

sẽ làm tăng sự tạo rễ Tác dụng làm tăng sự ra rễ xảy ra một cách mạnh mẽ khi xử lý acid gibberellic ngay khi sự xuất hiện rễ bắt đầu, nhưng chỉ sau một thời gian ngắn sau

đó thì acid gibberellic lại có tác dụng cản

1.4.3 Cytokinin

Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và tự do Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokinin tự do cho cả cơ thể thực vật Từ rễ, cytokinin di chuyển trong mạch mộc để tới chồi [9], khi rễ bị thương thì có một sự phát triển yếu

của nụ vì không tạo đủ cytokinin [7] Ngoài ra, một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh [10]

Cytokinin hoạt động thấp trong giai đoạn đầu của quá trình nảy mầm Cytokinin

khởi động sự kéo dài tế bào trong lá mầm, kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện

có auxin Cytokinin tác động lên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào [9] Có hiệu quả này là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ sự tổng hợp acid nucleic và protein [10], [35] Khi nuôi cấy mô nghèo cytokinin, auxin kích thích sự nhân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân nhưng không có vách [9]

Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực

vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi [10] Cytokinin kích thích sự tăng trưởng lá, sự phân hóa mầm Cytokinin phá vỡ trạng thái ngủ của hột, kích thích hột nảy mầm và làm tăng sự nở hoa, tăng sự tượng hoa

1.4.4 Acid abscisic

Hàm lượng acid abscisic của hột rất thấp trong giai đoạn phát sinh phôi sớm, đạt cực đại tại khoảng thời gian giữa, sau đó giảm dần đến mức thấp nhất khi hột chuẩn bị nảy mầm Các nghiên cứu di truyền trên các thể đột biến thiếu acid abscisic ở

cây Arabidopsis đã chỉ ra rằng, kiểu gen của hợp tử kiểm soát sự tổng hợp acid abscisic trong phôi và nội nhũ đóng vai trò chủ đạo cảm ứng trạng thái ngủ Khi có sự

thấm nước, với hàm lượng acid abscisic thấp thì hột nảy mầm Acid abscisic cản sự

nảy mầm của hột nhưng kích thích sự tăng trưởng của phôi non và tích tụ các chất dự

trữ [11] Acid abscisic kích thích sự rụng nhưng không phải là chủ yếu (so với etylen

và auxin) Acid abscisic đã kích thích sự xuất hiện và nhanh chóng hình thành tầng rời

ở cuống [10]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

+ Dịch chiết vi khuẩn lam có nguồn gốc từ mẫu tạo váng được thu ở hồ Dầu

Tiếng vào tháng 07/2011 (kí hiệu: SCUM);

+ Dịch chiết vi khuẩn lam từ mẫu nuôi Microcystis aeruginosa in vitro(phân lập

từ hồ Dầu Tiếng) (kí hiệu: MAS2);

+ Độc tố microcystin thương phẩm (Abbraxis)

2.1.3 Vật liệu sử dụng cho sinh trắc nghiệm

- Khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) cho các sinh trắc nghiệm auxin và

2.2 Thiết kế thí nghiệm

2.2.1 K hảo sát các biến đổi hình thái của hột trong quá trình nảy mầm

Hột cà rốt hay xà lách được gieo vào đĩa petri (đường kính 10 cm) có chứa 4 lớp

giấy thấm và 10 ml nước cất Thí nghiệm đặt trong tối ở điều kiện nhiệt độ là 25 ±

1oC, độ ẩm khoảng 75% Quan sát các biến đổi hình thái trong quá trình nảy mầm của

hột Cân trọng lượng của hột sau mỗi 2 giờ kể từ lúc bắt đầu thí nghiệm cho đến khi

hột nảy mầm Trọng lượng tươi được xác định bằng cân phân tích với độ chính xác 0,1

mg Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 hột

2.2.2 Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự nảy mầm

Hột cà rốt hay xà lách được gieo vào đĩa petri (đường kính 10 cm) có chứa 4 lớp

giấy thấm và 10 ml dung dịch xử lý khác nhau: nước cất, dịch chiết vi khuẩn lam từ

mẫu tế bào in vitro (MAS2) hay dịch chiết vi khuẩn lam từ mẫu tạo váng (SCUM)

(nồng độ 1, 10 và 100 µg microcystin/L) [15] Thí nghiệm đặt trong tối ở điều kiện nhiệt độ là 25±1oC, độ ẩm 75% Đếm số lượng hột nảy mầm sau 24 giờ đối với hột xà lách, sau 72 giờ đối với hột cà rốt Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 50 hột

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự phát triển của cà rốt và

xà lách

Hột cà rốt hay xà lách sau khi nảy mầm được gieo vào các becher 100ml có chứa

3 lớp giấy lọc trung tính và 3ml dung dịch xử lý khác nhau: nước cất, dịch chiết vi khuẩn lam từ mẫu tế bào in vitro (MAS2) hay dịch chiết vi khuẩn lam từ mẫu tạo váng

(SCUM) (nồng độ 1, 10 và 100 µg microcystin/L), các becher được đậy kín bằng màng bọc thực phẩm và đặt trong phòng tăng trưởng với cường độ ánh sáng 1500±200 lux, nhiệt độ 28±2oC, độ ẩm 75% Mỗi ngày bổ sung 0,5 ml dung dịch xử lý [15] Cân

trọng lượng tươi, đo chiều dài rễ và chiều dài trụ hạ diệp sau 2, 4 và 7 ngày thí nghiệm Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 hột

Đường kính trụ hạ diệp của cây mầm ở ngày 7 sau khi nảy mầm được xác định

bằng cách giải phẫu ngang và quan sát nhờ thước trắc vi dưới kính hiển vi Vị trí lát

cắt trên trụ hạ diệp được xác định cách tử diệp 1mm, thực hiện 5 lát cắt trên mỗi cây

mầm

2.2.4 Đo cường độ hô hấp của cây mầm cà rốt và xà lách

Cường độ hô hấp của cây mầm cà rốt và xà lách ở các thời điểm xử lý khác nhau được đo bằng máy leaflab 2 (Hansetech) với điện cực oxygen Nhiệt độ của hệ

thống được duy trì ổn định ở 25 ± 2oC, trong tối Buồng kín chứa mẫu cây mầm của máy có một lớp đệm vải thấm NaHCO3 để hấp thu CO2 Sai biệt giữa tốc độ hấp thu oxygen ở 3-5 phút đầu tiên biểu thị cường độ hô hấp của cây mầm (µmol O2/ g trọng lượng tươi/ phút)

2.2.5 Đo hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có trong cây mầm

và cs(1963), Loveys và Van Dijk (1988), Meidner (1984), Yokota và cs (1980)

Nghiền 1g vật liệu tươi, thêm 40 ml methanol 80%, để qua đêm ở nhiệt độ phòng Sau 24h, lọc, rửa bã 2 lần methanol 80%, mỗi lần 20 ml Cô cạn dịch lỏng dưới

quạt Thêm 5 ml nước cất vào phần cặn Sơ đồ trích và phân đoạn như hình 2.1

S ắc ký

Sắc ký thực hiện trên bản mỏng silicagel 60 F254, ở nhiệt độ 30o

C Dung môi là isopropanol : amon hydroxyd : H2O tỷ lệ 10 : 1 : 1 (theo thể tích) Vị trí các chất điều

hòa tăng trưởng thực vật trên bản sắc ký được phát hiện nhờ quan sát dưới tia UV ở bước sóng 254 nm [38]

Xác định hoạt tính bằng các sinh trắc nghiệm

Sau sự sắc ký các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được xác định tương ứng

với mỗi băng trên bản silicagel nhờ giá trị Rf của mỗi chất chuẩn Các ô tương ứng với

từng mẫu trên mỗi băng được cắt riêng, các hạt silicagel được cô lập và giải hấp bằng dung môi methanol : chloroform: acid acetic với tỷ lệ 80 : 20 : 3 (theo thể tích), cô cạn dưới quạt, để bay hơi dung môi Sau đó, hòa tan với nước cất dùng trong sinh trắc nghiệm

Sinh tr ắc nghiệm auxin và acid abscisic

Hoạt tính auxin và acid abscisic được xác định nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa Hột lúa được cho nẩy mầm trong tối Sau 80 giờ, diệp tiêu (chưa bị xé) được cô

lập được cắt thành đoạn dài 2 mm để dùng trong sinh trắc nghiệm Mỗi nghiệm thức

gồm 10 khúc cắt diệp tiêu Sự gia tăng chiều dài của diệp tiêu được đo sau 24 giờ, trong tối, nhiệt độ 30 ± 1oC Hoạt tính của auxin và acid abscisic lần lượt tỉ lệ thuận và nghịch với sự sai biệt chiều dài diệp tiêu so với đối chứng (dung dịch được tạo bằng cách cạo ngâm phần silicagel không có chất trích đi qua) và được tính bằng cách so sánh sai biệt chiều dài của diệp tiêu trong các dịch trích và các dung dịch IAA 1 mg/L

và ABA 1 mg/L

Sinh tr ắc nghiệm cytokinin

Hoạt tính cytokinin được đo bằng sinh trắc nghiệm tử diệp dưa leo Hột dưa leo được ngâm 2 giờ, cho nảy mầm sau 24 giờ và khi rễ mầm nhú ra khoảng 2 mm thì tử

diệp được cắt ra để dùng trong sinh trắc nghiệm Mỗi nghiệm thức gồm 5 tử diệp Hoạt tính cytokinin tỉ lệ thuận với sai biệt trọng lượng tươi của tử diệp so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh với dung dịch zeatin 1 mg/L sau 48 giờ chiếu sáng (2000

± 200 lux), ở nhiệt độ 30 ± 1oC, ẩm độ 65 ± 5%

Sinh tr ắc nghiệm gibberellin

Hoạt tính giberellin được đo bằng sinh trắc nghiệm cây mầm xà lách sau 24 giờ cho nảy mầm ở 2000 ± 200 lux, nhiệt độ 30 ± 1oC, ẩm độ 65 ± 5% Các hột với rễ

mầm nhú ra 1mm được chọn để dùng trong sinh trắc nghiệm Mỗi nghiệm thức gồm

10 cây mầm Hoạt tính gibberellin tỉ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so

với đối chứng sau 72 giờ xử lý, và được tính bằng cách so sánh với dung dịch GA3 10 mg/L

Sự ly trích, phân đoạn và sinh trắc nghiệm các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được thực hiện trong ba lần riêng biệt Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật là giá trị trung bình của ba lần lặp lại

2.2.6 Ảnh hưởng của sự phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và độc

tố microcystin trên sự phát triển của cây mầm

Hột cà rốt hay xà lách sau khi nảy mầm được gieo vào các becher 100ml có chứa

3 lớp giấy lọc trung tính và 3ml dung dịch microcystin ở nồng độ 10 µg/L có hay không có bổ sung IAA (0,5 hay 1,0 mg/L) hay zeatin (0,5 hay 1,0 mg/L) Các becher được đậy kín bằng màng bọc thực phẩm và đặt trong phòng tăng trưởng với cường độ ánh sáng 1500±200 lux, nhiệt độ 28±2oC, độ ẩm 75% Mỗi ngày bổ sung 0,5 ml dung

dịch xử lý [15] Cân trọng lượng tươi, đo chiều dài rễ và chiều dài trụ hạ diệp sau 2, 4

và 7 ngày thí nghiệm Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 hột

2.3 Xử lý số liệu

Số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê nhờ phần mềm Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) phiên bản 16.0 và phần mềm Sigmaplot phiên bản 12.0 Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất 0,05 của các giá trị được thể hiện bởi các chữ cái khác nhau kèm theo

2.4 Thời gian và nơi thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh lý thực vật – Đại học Sư phạm TPHCM

Thời gian: từ tháng 03/2013 đến tháng 12/2014

Chương 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

3.1 Kết quả

3.1.1 Các biến đổi hình thái trong quá trình nảy mầm

Quá trình nảy mầm của hột cà rốt diễn ra trong 68 giờ với 3 giai đoạn: thu nước,

nảy mầm và tăng trưởng Giai đoạn thu nước của hột cà rốt diễn ra trong 12 giờ đầu

của sự nảy mầm Giai đoạn này hột thu nước mạnh, phình to, có sự gia tăng rõ rệt về kích thước và trọng lượng tươi so với thời điểm 0 giờ Thời điểm bão hòa nước của hột

cà rốt bắt đầu từ 8 giờ, sự gia tăng trọng lượng tươi của hột không đáng kể, từ thời điểm này này hình thái ngoài không có sự thay đổi rõ rệt Đến thời điểm 48 giờ, hột cà

rốt có sự tăng nhanh về trọng lượng tươi so với giai đoạn trước đó Đến thời điểm 64

giờ, hột có sự thay đổi về hình thái và trọng lượng tươi, vỏ hột bắt đầu nứt ra, đánh dấu

sự nhú ra của rễ mầm Đến thời điểm 68 giờ, rễ mầm đã kéo dài được 1mm đánh dấu

thời điểm kết thúc quá trình nảy mầm (hình 3.1) Sau 2 ngày kể từ lúc nảy mầm, hột cà

rốt tiếp tục gia tăng về trọng lượng tươi, kéo dài rễ khoảng 8 mm Sau 4 ngày nảy

mầm, 2 lá mầm chính thức bung ra khỏi vỏ hột, xuất hiện trụ hạ diệp, sau 7 ngày cây

mầm tiếp tục tăng trưởng rễ mầm, trụ hạ diệp và trọng lượng tươi

Quá trình nảy mầm của hột xà lách diễn ra trong 16 giờ với 3 giai đoạn: thu nước, nảy mầm và tăng trưởng Giai đoạn thu nước của hột xà lách diễn ra trong 4 giờ đầu của sự nảy mầm Giai đoạn này hột thu nước mạnh, phình to, có sự gia tăng rõ rệt

về kích thước và trọng lượng tươi so với thời điểm 0 giờ Trong giai đoạn từ 4 giờ đến

8 giờ thì sự gia tăng trọng lượng tươi hột xà lách hầu như không đáng kể so với thời điểm trước đó, cũng như không có sự thay đổi rõ rệt về hình thái của hột, đây là giai đoạn bão hòa nước của hột xà lách Đến thời điểm 10 giờ thì có sự gia tăng về trọng lượng tươi Vỏ hột bắt đầu nứt ra có sự gia tăng mạnh về trọng lượng tươi vào thời điểm 14 giờ (Hình 3.3), chuẩn bị cho sự nhú ra của rễ mầm (hình 3.2) Đến 16 giờ thì

rễ mầm chính thức nhú ra khỏi hột với chiều dài khoảng 1mm, cũng như gia tăng về

trọng lượng so với thời điểm trước đó, kết thúc quá trình nảy mầm Sau 2 ngày kể từ

lúc nảy mầm, hột xà lách tiếp tục gia tăng về trọng lượng tươi, kéo dài rễ khoảng 7

mm Sau 4 ngày nảy mầm thì 2 lá mầm chính thức bung ra khỏi vỏ hột, xuất hiện trụ

hạ diệp, sau 7 ngày thì cây mầm tiếp tục tăng trưởng rễ mầm, trụ hạ diệp và trọng lượng tươi

Hình 3.1 Các giai đoạn trong quá trình nảy mầm của hột cà rốt (A - 0 giờ; B- 8

giờ; C- 14 giờ; D – 64 giờ; E – 68 giờ; F- 2 ngày sau nảy mầm)

Hình 3.2 Các giai đoạn trong quá trình nảy mầm của hột xà lách (A - 0 giờ; B- 4

giờ; C- 14 giờ; D – 16 giờ; E –2 ngày sau nảy mầm)

Hình 3.3 Sự thay đổi trọng lượng tươi của hột cà rốt và xà lách trong quá trình nảy

mầm

3.1.2 Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự nảy mầm

Trong trường hợp xử lý với dung dịch có chứa độc tố vi khuẩn lam từ mẫu tế bào

in vitro (MAS2) với nồng độ 1, 10, 100 µg microcystin/L ở 2 loại vật liệu cà rốt và xà lách đều làm giảm tỉ lệ nảy mầm của hột Nồng độ microcystin càng cao, tỉ lệ nảy

mầm càng thấp Tỉ lệ nảy mầm của hột cà rốt khi xử lý với nồng độ microcystin 100 µg/L là 59,33% giảm rất mạnh so với đối chứng là 92,67% (bảng 3.1)

Trong trường hợp xử lý với dung dịch chứa độc tố vi khuẩn lam từ mẫu tạo váng (SCUM), ở hột xà lách thì sự ức chế tỉ lệ nảy mầm xảy ra ở nồng độ microcystin là 10

và 100 µg/L Với hột cà rốt thì sự ức chế nảy mầm xảy ra ở cả 3 nồng độ microcystin

là 1, 10 và 100 µg/L, nồng độ microcystin càng cao thì tỉ lệ nảy mầm càng thấp Tỉ lệ

nảy mầm của hột cà rốt khi xử lý với nồng độ microcystin 100 µg/L là 68,67% giảm

mạnh so với đối chứng là 92,67% (bảng 3.1)

B ảng 3.1 Tỉ lệ nảy mầm của hột xà lách và cà rốt (giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn)

Dung dịch xử lý

Hàm lượng microcystin có trong dung dịch xử lý

(µg/L)

Tỉ lệ nảy mầm (%)

Xà lách Cà rốt Đối chứng (nước cất) 0 94,00 ± 1,15e 92,67 ± 1,76e

Dịch chiết mẫu tế bào

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có mức ý nghĩa p=0,05;

số mẫu n=50; xử lý thống kê SPSS dùng: Dunnett và Duncan test

3.1.3 Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự phát triển của cây mầm cà rốt

và xà lách

3.1.3.1 Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự phát triển của rễ mầm

Tất cả các xử lý với độc tố vi khuẩn lam ở các nồng độ thay đổi trên 2 loại vật

liệu cà rốt và xà lách đều ức chế sự kéo dài rễ (hình 3.7; 3.8) Trường hợp cà rốt xử lý

với dịch chiết từ mẫu tạo váng, tại thời điểm ngày 2, chiều dài rễ ở nghiệm thức chứa độc tố đều giảm so với đối chứng (6,48 mm), ngắn nhất là ở nồng độ microcystin 100 µg/L (5,21 mm) (hình 3.4) Trường hợp xử lý với dịch chiết từ mẫu tạo váng, trên xà lách ở thời điểm ngày 7, chiều dài rễ khi xử lý ở nồng độ 100 µg microcystin/L là 17,43 mm giảm rất mạnh so với đối chứng là 28,25 mm (hình 3.5) Trường hợp xà lách xử lý với dịch chiết từ mẫu tế bào in vitro, tại thời điểm ngày 7, chiều dài rễ ở

nồng độ 10 và 100 µg microcystin/L là 24,36 và 23,86 mm giảm mạnh so với đối

chứng là 28,25 mm (hình 3.6)

Hình 3.4 Chiều dài rễ cà rốt sau 2 ngày xử lý với độc tố vi khuẩn lam từ mẫu tạo váng

Hình 3.5 Cây mầm xà lách 7 ngày sau khi xử lý với dịch chiết từ mẫu tạo váng (SCUM)

chứa độc tố ở những nồng độ microcystin khác nhau (A: đối chứng; B – 1 µg/L; C – 10 µg/L;

D – 100 µg/L)