xà lách và cà rốt
Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic có trong cây mầm cà rốt và xà lách 4 ngày tuổi được xử lý với các dung dịch có chứa độc tố ở nồng độ 100 µg microcystin/L được xác định bằng phương pháp sinh trắc nghiệm.
Ly trích và phân lập
Để ly trích và cô lập các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, pH của dịch hòa tan được thay đổi và dùng các dung môi thích hợp như ether trước khi áp dụng phương pháp sắc ký. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật như auxin, cytokinin, gibberellin, aicd abscisic dạng tự do được ly trích và phân đoạn theo Bùi Trang Việt (1992), Ley và cs(1963), Loveys và Van Dijk (1988), Meidner (1984), Yokota và cs (1980).
Nghiền 1g vật liệu tươi, thêm 40 ml methanol 80%, để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau 24h, lọc, rửa bã 2 lần methanol 80%, mỗi lần 20 ml. Cô cạn dịch lỏng dưới quạt. Thêm 5 ml nước cất vào phần cặn. Sơ đồ trích và phân đoạn như hình 2.1
Sắc ký
Sắc ký thực hiện trên bản mỏng silicagel 60 F254, ở nhiệt độ 30o
C. Dung môi là isopropanol : amon hydroxyd : H2O tỷ lệ 10 : 1 : 1 (theo thể tích). Vị trí các chất điều
20
hòa tăng trưởng thực vật trên bản sắc ký được phát hiện nhờ quan sát dưới tia UV ở bước sóng 254 nm [38].
Xác định hoạt tính bằng các sinh trắc nghiệm
Sau sự sắc ký các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được xác định tương ứng với mỗi băng trên bản silicagel nhờ giá trị Rf của mỗi chất chuẩn. Các ô tương ứng với từng mẫu trên mỗi băng được cắt riêng, các hạt silicagel được cô lập và giải hấp bằng dung môi methanol : chloroform: acid acetic với tỷ lệ 80 : 20 : 3 (theo thể tích), cô cạn dưới quạt, để bay hơi dung môi. Sau đó, hòa tan với nước cất dùng trong sinh trắc nghiệm.
22
Sinh trắc nghiệm auxin và acid abscisic
Hoạt tính auxin và acid abscisic được xác định nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa. Hột lúa được cho nẩy mầm trong tối. Sau 80 giờ, diệp tiêu (chưa bị xé) được cô lập được cắt thành đoạn dài 2 mm để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 khúc cắt diệp tiêu. Sự gia tăng chiều dài của diệp tiêu được đo sau 24 giờ, trong tối, nhiệt độ 30 ± 1oC. Hoạt tính của auxin và acid abscisic lần lượt tỉ lệ thuận và nghịch với sự sai biệt chiều dài diệp tiêu so với đối chứng (dung dịch được tạo bằng cách cạo ngâm phần silicagel không có chất trích đi qua) và được tính bằng cách so sánh sai biệt chiều dài của diệp tiêu trong các dịch trích và các dung dịch IAA 1 mg/L và ABA 1 mg/L.
Sinh trắc nghiệm cytokinin
Hoạt tính cytokinin được đo bằng sinh trắc nghiệm tử diệp dưa leo. Hột dưa leo được ngâm 2 giờ, cho nảy mầm sau 24 giờ và khi rễ mầm nhú ra khoảng 2 mm thì tử diệp được cắt ra để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 5 tử diệp. Hoạt tính cytokinin tỉ lệ thuận với sai biệt trọng lượng tươi của tử diệp so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh với dung dịch zeatin 1 mg/L sau 48 giờ chiếu sáng (2000 ± 200 lux), ở nhiệt độ 30 ± 1oC, ẩm độ 65 ± 5%.
Sinh trắc nghiệm gibberellin
Hoạt tính giberellin được đo bằng sinh trắc nghiệm cây mầm xà lách sau 24 giờ cho nảy mầm ở 2000 ± 200 lux, nhiệt độ 30 ± 1oC, ẩm độ 65 ± 5%. Các hột với rễ mầm nhú ra 1mm được chọn để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 cây mầm. Hoạt tính gibberellin tỉ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so với đối chứng sau 72 giờ xử lý, và được tính bằng cách so sánh với dung dịch GA3 10 mg/L.
Sự ly trích, phân đoạn và sinh trắc nghiệm các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được thực hiện trong ba lần riêng biệt. Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật là giá trị trung bình của ba lần lặp lại.
23