Nghiên cứu phân lập các hoạt chất tritecpen glycoside từ lá cây mâm sôi (rubus alceafolius poir)

Các phương pháp chiết mẫu thực vật 1.3.1 Đặc điểm chung của chiết Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hoà tan trong một pha lỏng vào

Mở đầu

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm mưa

nhiều, độ ẩm cao khoảng trên 80%, thích hợp cho sự phát triển của thực vật

Thêm vào đó, 3/4 diện tích nước ta là đồi núi nên thảm thực vật ở Việt Nam vô

cùng phong phú và đa dạng với khoảng 12000 loài thực vật[1] Nguồn thực vật

phong phú này không những đáp ứng nhu cầu về lương thực, thực phẩm cho

con người, mà nhiều loài trong số đó còn được sử dụng trong y học cổ truyền

Các phương thuốc y học cổ truyền đã thể hiện những mặt mạnh là ít độc tính

và ít tác dụng phụ nên được người dân sử dụng tương đối rộng rãi

Cùng với sự phát triển của xã hội thì nhu cầu của con người ngày càng

cao Con người ngày càng quan tâm đến nhiều lĩnh vực của cuộc sống đặc biệt

là chăm sóc sức khỏe, làm đẹp… Vì vậy việc nghiên cứu, tìm kiếm các chất

có hoạt tính sinh học có vai trò rất quan trọng Nó thúc đẩy sự phát triển của

ngành y dược và nhiều lĩnh vực hoá học khác, góp phần nâng cao chất lượng

cuộc sống của con người

Cõy Mõm xụi phõn bố tương đối rộng rói ở khắp cỏc tỉnh vựng nỳi thấp,

trung du và đồng bằng Cõy Mõm xụi cú nhiều bộ phận (rễ, lỏ, quả, cành…)

được sử dụng trong nhiều bài thuốc chữa bệnh Cõy cú hoạt tớnh sinh học cao,

chứa nhiều thành phần húa học và cú nhiều tỏc dụng dược lý, trong dõn gian

được dựng để làm thuốc thanh nhiệt, kớch thớch tiờu húa , tiêu viêm… Việc

nghiờn cứu khảo sỏt về thành phần húa học và tỏc dụng dược lý của cây Mâm

xôi ở Việt Nam đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chỳng một cỏch hợp lý

và cú hiệu quả Vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu phân lập

các hợp chất tritecpen glycoside từ lá cây Mâm xôi”

Nhiệm vụ của khúa luận:

- Phõn lập một số hợp chất tritecpen glycoside từ cõy Mõn xụi

- Xỏc định cấu trỳc húa học của cỏc hợp chất đó phõn lập

Chương 1 Tổng Quan

1.1 Tổng quan về cây Mâm xôi

1.1.1 Thực vật học

Cây Mâm xôi hay còn được gọi là đùm đũm có tên khoa học là Rubus

alceaefolius Poir., thuộc họ Hoa hồng - Rosaceae Đây là loài cây bụi nhỏ,

thân leo có gai to và dẹt Cành mọc vươn dài, có nhiều lông Lá đơn, mọc so

le, hình bầu dục, hình trứng hoặc gần tròn, chia thùy nông, không đều, gân

chân vịt, mép khía răng, mặt trên màu lục sẫm phủ lông lởm chởm, mặt dưới

có nhiều lông mềm, mịn màu trắng xỉn; cuống lá dài cũng có gai; lá kèm sớm

rụng Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùm ngắn; lá bắc giống lá

kèm, hoa màu trắng; cánh hoa 5, mỏng hình tròn, nhị rất nhiều thường dài

bằng cánh hoa, chỉ nhị dẹt, lá noãn nhiều Quả hình cầu, gồm nhiều quả hạch

tụ họp lại như dáng mâm xôi, khi chín màu đỏ tươi, ăn được Cây ra hoa tháng

2-3, quả tháng 5-7 [1, 2]

Hỡnh 1.1 : Cây Mâm xôi Rubus alceaefolius Poir

1.1.2 Phân bố, sinh thái

Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự [1], trên thế giới chi Rubus có khoảng

hơn 400 loài, hầu hết là cây bụi, mọc thẳng hay bụi trườn, phân bố chủ yếu ở

vùng ôn đới, cận nhiệt đới và cả ở vùng nhiệt đới Bắc bán cầu Một vài loài

được trồng lấy quả ở Việt Nam, chi này có 51 loài, 7 thứ, trong đó Mâm xôi

là loài phân bố tương đối rộng rãi ở khắp các tỉnh vùng núi thấp, trung du và

đồng bằng Cây ưa sáng và ẩm, thường mọc trùm lên các cây bụi và cây leo

khác ở ven rừng ẩm, rừng núi đá vôi, đồi, nhất là trong các trảng cây bụi ưa

sáng trên đất sau nương rẫy ở vùng đồng bằng, Mâm xôi mọc lẫn trong các

lùm bụi quanh làng, hai bên đường đi Cây này sinh trưởng, phát triển nhanh

Những cây ít bị chặt phá ra hoa quả nhiều hàng năm Cây có khả năng tái sinh

mạnh sau khi bị chặt phá

1.1.3 Công dụng

Lá, cành và rễ cây Mâm xôi có vị ngọt nhạt, tính bình, có tác dụng

thanh nhiệt, tán ứ, tiêu viêm, chỉ huyết, kích thích tiêu hóa, giúp ăn ngon

miệng Cành lá phơi khô, nấu nước uống thay chè, dùng cho phụ nữ sau khi đẻ

mất sức và những người ăn không tiêu, đầy bụng Ngoài ra cành và lá Mâm

xôi còn được dùng phối hợp với Mộc thông, Ô rô để chữa viêm tuyến vú, viêm

gan cấp và mạn tính Quả có vị ngọt, tính bình, được dùng thay vị Phúc bồn tử

trong y học cổ truyền, có tác dụng bổ gan thận, giữ tinh khí, làm tráng dương,

mạnh sức Quả được dùng chữa thận hư, liệt dương, di tinh, đái són, đái buốt

[1, 2]

ở ấn Độ người ta dùng quả Mâm xôi làm thuốc chữa bệnh đái dầm của

trẻ em Nước sắc lá và vỏ thân được dùng làm thuốc điều kinh, chữa tiêu chảy

ở Trung Quốc, Mâm xôi được sử dụng trong y học cổ truyền để chữa

albumin niệu, viêm tuyến vú và viêm gan mạn tính ở một số vùng của

Trung Quốc, nó còn được sử dụng để chữa một số bệnh ung thư nhất định

Theo kết quả nghiên cứu của Cui C -B và cộng sự, rễ Mâm xôi thể hiện hoạt

tính ức chế mạnh chu kỳ tế bào ở pha G0/G1 của dòng tế bào tsFT210 (Chu kỳ

tế bào, con đường duy nhất để tế bào sinh sôi, là một quá trình sinh học được

kiểm soát chặt chẽ và thực tế ung thư là sự tăng sinh vô hạn độ không mong

muốn của các tế bào ung thư với sự thoái hóa của chu kỳ tế bào Do đó, các

chất ức chế chu kỳ tế bào có khả tiềm tàng trong điều trị ung thư) [7]

1.1.4 Thành phần hoá học

Theo các sách về cây thuốc Việt Nam [1, 2], quả Mâm xôi chứa các axit

hữu cơ (chủ yếu là axit citric, malic, salycilic), đường, pectin Lá chứa tanin

Tuy nhiên, hiện nay còn rất ít công trình nghiên cứu được công bố về loài R

alceaefolius

Từ cây R alceaefolius mọc ở Trung Quốc, năm 1998 Gan L và các

đồng nghiệp đã phân lập được: axit corosolic (1), axit tormentic (2),

niga-inchigoside F1 (3), trachelosperoside E-1 (4) và suavissimoside R1 (5) [8]

Năm 2000, Gan L và các đồng nghiệp lại công bố phân lập của alcesefoliside

(6), hyperoside (7), vomifoliol (8), β-sitosterol (9), daucosterol (10) và

dotriacontyl alcohol (11) [9] Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Cui C -B đã

công bố sự phân lập của rubuphenol (12), sanguiin H-2 ethyl ester (13), axit

ellagic (14), ethyl gallate (15), 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose

(16) và 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose (17) [7]

Cấu trúc của một số hợp chất đã được phân lập từ loài R

alceaefolius.được dẫn ra sau đây:

Các hợp chất đã được phân lập từ cây Rubus alceaefolius

HO

HO

O OH

Hình 1.1.4.1 Axit corosolic

HO HO

O OH OH

HO

O

OH

OH OH

OH OH

OH OH

OH OH OH OH

HO

O O

OH OH

OH OH

Hình 1.1.4.7. Hyperoside

O

OH OH

Hình 1.1.4.8. Vomifoliol

O

O O OH

O O

HO OH

HO OH OH

Hình 1.1.4.12. Rubuphenol

O O

H O

OH

OH HO O

OH HO HO

O O

O O

HO OH

Hình 1.1.4.15. Ethyl gallate

O GO

OG OG RO

GO

OH

OH

OH C

1.2 Giới thiệu về lớp chất Tritecpen [3, 4, 5]

1.2.1 Giới thiệu chung

Tecpen thường gặp trong giới thực vật, nhất là trong tinh dầu thảo mộc

(các tinh dầu thông, sả, cam, hoa hồng…)

Tecpen là các hidrocacbon đa số không no mạch hở hay mạch vòng, có

công thức chung là (C5H8)n (n≥2)

Tecpen được tạo thành do isopren kết hợp với nhau theo kiểu “đầu nối với

đuôi”

C5H8,Isopren C10H16, Oximen C10H16, Silvestren

Các dẫn xuất chứa oxi của tecpen (ancol, andehit, xeton, este…) được gọi là

tecpenoit Tecpenoit cũng rất phổ biến trong các loại tinh dầu thảo mộc

Mentol Xitronelal Tuion

(Tinh dầu bạc hà) (Tinh dầu sả) (Từ dầu Thiya occidentalis)

Căn cứ vào số đơn vị isopren hợp thành mà người ta phân loại tecpen thành

các monotecpen C10, sesquitecpen C15, ditecpen C20, sestertecpen C25, tritecpen

C30, tetratecpen C40 và polytecpen

Dựa vào số vòng của cấu trúc, người ta chia monotecpen thành ba nhóm:

monotecpen không vòng (Axiclic monotecpen), monotecpen một vòng

(Monoxiclic monotecpen), monotecpen hai vòng (Bixiclic monotecpen)

Trong mỗi nhóm, các monotecpen có thể là các hidrocacbon không no hoặc

có thêm các nhóm chức ancol, andehit, xeton

Camphen β-Tecpinen

(Trong tinh dầu long não) (Từ dầu thông)

Đitecpen có mạch hở và mạch vòng, quan trọng nhất là hai ancol

đitecpen: phitol (C20H39OH) và retinol (C20H29OH) Phitol ở dạng este tạo

thành một nhánh của clorophin có trong chất diệp lục của cây xanh Retinol

hay là vitamin A có trong lòng đỏ trứng, dầu gan cá…

CH2OH

CH2OH

Phitol Retinol (vitamin A)

Các tritecpen phân bố rộng rãi trong giới thực vật, cho đến những năm

bảy mươi có khoảng 500 hợp chất tritecpen được xác định cấu trúc Một số

tritecpen có tác dụng sinh lý, dược lý như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng

viêm và kháng một số dạng ung thư, ngoài ra còn có tác dụng lên hệ thần kinh

trung ương, điều hoà nội tiết, hạ cholesterol máu và chống xơ vữa động mạch

Hợp chất squalen với cấu hình trans là chất tiền thân sinh học của tất cả

các tritecpen

Sự đóng vòng của squalen theo các cách khác nhau tạo nên sự đa dạng

của các hợp chất tritecpen

1.2.2 Các nhóm Tritecpen

1.2.2.1 Sự đóng vòng của squalenoxit trong chuỗi thuyền - ghế - thuyền -

ghế

Sự đóng vòng của squalenoxit trong chuỗi thuyền - ghế - thuyền - ghế

dẫn đến sự hình thành cation cầu nối

Cation này biến đổi tiếp tạo thành các hợp chất khác nhau, sau đây là

một số hợp chất tiêu biểu:

1.2.2.2 Sự đóng vòng của squalen epoxit trong chuỗi ghế - ghế - ghế -

thuyền

Đóng vòng của squalen epoxit trong chuỗi ghế - ghế - ghế - thuyền tạo

ra cation

Từ cation này có thể tạo ra các

tritecpen 4 vòng xuất hiện trong nhựa

dammar là các chất dammarendiol I

hay dammarendiol II (đồng phân

epime ở vị trí C20)

H OH

1.2.2.3 Sự đóng vòng của squalen trong các chuỗi ghế - ghế - ghế - ghế -

ghế, ghế- ghế - ghế - ghế - thuyền, ghế - thuyền - ghế - ghế - thuyền

Sự đóng vòng của squalen theo cấu dạng ghế - ghế - ghế - ghế - ghế dẫn

tới các cation trung gian từ đó hình thành các diplopten, tetrahymanol và các

tritecpen năm vòng

H H

OH

Đóng vòng theo cấu dạng ghế- ghế - ghế - ghế - thuyền của squalen dẫn

tới sự hình thành của moretenol và các hợp chất liên quan qua cation trung

gian như hình vẽ sau:

HO

Morotenol

Cation trung gian

Đóng vòng theo cấu dạng ghế- ghế - ghế - ghế - thuyền của squalen kết hợp

chuyển vị tạo ra các hợp chất như neomotinol và fernen

HO

H

Một đại diện quan trọng cho nhóm các tritecpen dẫn ra từ cấu dạng ghế -

thuyền - ghế - ghế - thuyền là Arborinol

H

Arborinol

1.2.2.4 Sự đóng vòng của squalen một cách đồng thời từ hai đầu

Một nhóm nhỏ tritecpen là sản phẩm của sự oxi hoá đồng thời từ hai đầu

của phân tử squalen Các hợp chất tiêu biểu của nhóm này là onocerin và

tritecpen 5 vòng thuộc khung serraten với chất đại diện là serratendiol

OH H

H

HO

OH H H

1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật

1.3.1 Đặc điểm chung của chiết

Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình

chuyển một chất hoà tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hoà

tan với nó

Mục đích của chiết:

+ Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn

dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ

của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu

+ Ngoài ra còn dựng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân

ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp.Thường dùng

trong phân tách các hợp chất tự nhiên

1.3.2 Cơ sở của quá trình chiết

Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không

hoà tan lẫn với nhau Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các

chất trong các pha lỏng

Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst:

KA = CA/CB

CA, CB: nồng độ các chất hoà tan trong chất lỏng A, B

không hoà tan lẫn vào nhau

1.3.3 Quá trình chiết

1.3.3.1 Chọn dung môi chiết

Thông thường các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực

khác nhau.Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm

Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn

thận

Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá

thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng

với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy

Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước

khi sử dụng Nếu chúng có lẫn cấc chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu

quả và chất lượng của quá trình chiết Thường có một số chất dẻo lẫn trong

dung môi như các điankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat

Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong

khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa

Methanol và chloroform thường chứa đioctylphtalat [đi-(2-

etylhexyl)phtalat hoặc bis-2- etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết

quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính

trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chlorofrom,

metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong

quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…

Những tạp chất của chloroform như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng

với một vài hợp chất như các ankaloit tạo muối bậc bốn và những sản phẩm

khác Tương tự như vậy sự có mặt của lượng nhỏ axit clohidric (HCl) cũng có

thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất

khác Vì chloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được

thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt lạ phòng độc

Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chloroform

Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các

hidrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ

thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu

được lượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại khả năng phân cực của

Chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol

hoà tan phân lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân

cực trung bình và thấp Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị

hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính

tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng

methanol trong suốt quá trình chiết Thí dụ trechlonolide A thu được từ

Trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân

huỷ 1-hydroxytropcocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được

chiết trong methanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà

thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol

Đietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ

nổ, peroxit của đietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp chất không

có khả năng tạo Cholesterol như các carotenoid Tiếp đến là axeton cũng có

thể tạo thành axetonit nếu 1,2 – cis- diol có mặt trong môi trường axit Qúa

trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân

tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo

thành những sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong

cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá

trình chiết tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành

chất mong muốn

Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cắt quay ở nhiệt độ không

quá 30-400C, với một hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi

nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời

gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để

điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dung môi

có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn Trước đây,

máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng

bằng thuỷ tinh

Thông thường quá chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp

chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ

rồi chất chiết được lấy ra Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện

qua ba lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị

nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau

Như vậy tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi

cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao

Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các

hợp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết

1.4 Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ

Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và

hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp

chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký [3]

Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất

hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh

Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất

của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…) Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác

nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc

theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá

trình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ

chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn

với pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình

sắc ký

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai

pha động và pha tĩnh ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ

thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc

với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng

nhiệt Langmuir:

n b C n

b C





 n- lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n-lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó

b- hằng số

C – nồng độ của chất bị hấp phụ

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái

khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa

vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhón lớn:

sắc ký khí và sắc ký lỏng Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra

thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:

1.4.3.1 Sắc ký cột (CC)

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm

các loại Silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,

ODS, Dianion… Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh

hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất hấp phụ hết

sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hoặc khả năng tách của chất hấp

phụ Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng

tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng

nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường

không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi

đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao

(HPLC)

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất

quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu

cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc ký, tỷ lệ giữa

quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là

Rf, với mỗi một chất sẽ có Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà

ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ

cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỉ lệ này

thấp (từ 1/5 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số

tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong

khoảng 1/20  1/30 Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan

trọng Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên

cột bằng các phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì

phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu

tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi

chạy cột với lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp

vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất

hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột

đến khi cột trong suốt

- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi

chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần vào cột đến khi

đủ lượng cần thiết

Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có

bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột

không được nứt, gãy, dò

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc

độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảy

quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.4.3.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định

hướng cho sắc ký cột SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn Silica

gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu

chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng Silica

gel dày hơn) , có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc ký,

người ta có thể cạo riêng phần Silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ

bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện

chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng

lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%

1.5 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu

cơ [3]

Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các

phương pháp phổ kết hợp Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà

người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể nào Cấu trúc càng phức tạp thì yêu

cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, để xác

định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các

phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, kết hợp với các phương

pháp sắc ký so sánh…

1.5.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)

Phổ hồng ngoại được xác định dựa vào sự khác nhau về dao động của

các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi

kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Do đó dựa

vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp

chất, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl

là 3300  3450 cm-1

, của nhóm cácbonyl C=O trong khoảng 1700  1750

cm-1…

1.5.2 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion

trong phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho

các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế

phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học các hợp chất Hiện nay có rất

nhiều loại phổ khối lượng, những phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây:

- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionizatoin mass spectroscopy) dựa vào sự

phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau,

phổ biến là 70 eV

- Phổ ESI-MS (Electron spray Ionizatoin mass spectroscop) gọi là phổ

phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượmg bắn phá thấp hơn

nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các

pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ

- Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá

nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó

phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử

- Phổ khối lượng phân giải cao ( High resolution mass spectroscopy) cho

phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao

- Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc

ký kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc ký khí – khối phổ), LC-MS (

sắc ký lỏng – khối phổ) Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu

khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong

ngành dược)

1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy, NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu

hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một

chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của

hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và

cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác

dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng

độ chuyển dịch hoá học (chemical shift) Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn

được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin

coupling)

1.5.3.1 Phổ 1 H - NMR:

Trong phổ 1H – NMR, độ chuyển dịch hoá học (δ) của các proton được

xác định trong thang ppm từ 0  14 ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của

nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần Dựa vào những đặc trưng

của độ chuyển dịch hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu

trúc hóa học của hợp chất

1.5.3.2 Phổ 13 C - NMR:

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng

hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau Thang đo của

phổ 13C – NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0  230 ppm

1.5.3.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer):

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau Trên

phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất Tín hiệu của CH và CH3

nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350 Trên phổ DEPT

900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH

1.5.3.4 Phổ 2D-NMR:

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của

các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật chủ

yếu thường được sử dụng như sau:

- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tương tác

trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này Trên phổ,

một trục là phổ 1 H - NMR còn trục kia là 13 C - NMR Các tương tác HQMC

nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ

- Phổ 1H - 1H COSY (HOMOCOSY) (1H - 1H Chemical Shift Correlation

Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các

proton đính với cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các phần của phân tử

được ghép nối lại với nhau

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu

diễn tương tác xa trong không gian phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ

này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu

trúc

- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn

các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết

mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian Dựa vào kết quả phổ

này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử

Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE

Differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử Bằng việc đưa vào

một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các

proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng

hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn Ngoài ra, còn sử

dụng phổ X-RAY (Nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu trúc không gian của

toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể Nhưng phạm vi sử

dụng của nó hạn chế vì yêu cầu cần tiên quyết của phương pháp này là cần

phải có đơn tinh thể Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp

chất hữu cơ

Như trên đã đề cập ngoài việc sử dụng các loại phổ người ta còn sử

dụng kết hợp với các chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích

so sánh kết hợp khác