nghiên cứu xây dựng ngân hàng giống virus porcine circovirus type2 (pcv2) phân lập được sản xuất vacxin phòng bệnh còi cọc ở lợn con

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - NGUYỄN THỊ CƯƠNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG NGÂN HÀNG GIỐNG VIRUS PORCINE CIRCOVIRUS TYPE2 (PCV2) PHÂN LẬP ĐƯỢC SẢN XUẤT VACXIN PHÒNG BỆNH CÒI CỌC Ở LỢN CON LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - NGUYỄN THỊ CƯƠNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG NGÂN HÀNG GIỐNG VIRUS PORCINE CIRCOVIRUS TYP2 (PCV2) PHÂN LẬP ĐƯỢC SẢN XUẤT VACXIN PHÒNG BỆNH CÒI CỌC Ở LỢN CON CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y MÃ SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ VĂN PHAN TS HUỲNH THỊ MỸ LỆ HÀ NỘI, 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tôi, phần kết đề tài KC04.22/11-15 TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ chủ trì Kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn cám ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2014 Tác giả luận văn Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập thực đề tài, nỗ lực thân nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ tập thể cá nhân Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội (nay Học viện Nông nghiệp Việt Nam), Ban quản lý đào tạo, Ban chủ nhiệm khoa Thú y tạo điều kiện cho thời gian học tập làm luận văn tốt nghiệp; Đặc biệt, bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Lê Văn Phan TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ - giảng viên Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam dành nhiều thời gian dẫn giúp đỡ tận tình để hoàn thành luận văn tốt nghiệp; Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tận tình thầy cô Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành công việc trình thực tập mình; Tôi xin chân thành cám ơn Công ty cổ phần phát triển Công nghệ Nông thôn tạo điều kiện để hoàn thành thí nghiệm liên quan đến nội dung đề tài; Tôi biết ơn tới gia đình, bạn bè, người động viên, giúp đỡ suốt trình học tập trường trình thực đề tài Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2014 Tác giả luận văn Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu PCV2 bệnh PCV2 gây 1.1.1 Một vài nét PCV2 1.1.2 Bệnh PCV2 gây 10 1.1.3 Triệu chứng bệnh tích 16 1.1.4 Chẩn đoán 20 1.1.5 Phòng bệnh 22 1.1.6 Điều trị 24 CHƯƠNG NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.2 Địa điểm nghiên cứu 25 2.3 Nội dung nghiên cứu 25 2.3.1 Giám định độ khiết virus PCV2 phân lập 25 2.3.2 Xác định nồng độ chất bổ sung tối ưu tới nhân lên virus PCV2 nuôi cấy môi trường tế bào PK15 25 2.3.3 Chuẩn độ virus PCV2 phân lập 25 2.4 25 Nguyên liệu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 2.5 Phương pháp nghiên cứu 29 2.5.1 Phương pháp tách, tinh ADN tổng số 29 2.5.2 Phương pháp nested PCR chẩn đoán PCV2 29 2.5.3 Phương pháp nested PCR xác định genotype PCV2 31 2.5.4 Phương pháp xác định virus tạp nhiễm 33 2.5.5 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang phát PCV2 thảm tế bào sau gây nhiễm: 36 2.5.6 Phương pháp tối ưu nồng độ chất bổ sung vào môi trường PK15 nuôi cấy virus PCV2 38 2.5.7 Phương pháp real-time PCR 39 2.5.8 Phương pháp cấy chuyển virus 40 2.5.9 Phương pháp thu hoạch lưu giữ PCV2 phân lập 41 2.4.10 Xác định TCID50 PCV2 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Kết lựa chọn mẫu virus PCV2 phân lập 43 3.2 Kết giám định độ khiết virus PCV2 phân lập 44 3.2.1 Kết chẩn đoán virus PCV2 phân lập 44 3.2.2 Kết kiểm tra độ khiết PCV2 phân lập với số virú Mycoplasma 3.3 53 Kết xác định nồng độ chất bổ sung tối ưu tới nhân lên virus PCV2 nuôi cấy môi trường tế bào PK15 64 3.3.1 Kết xác định nồng độ tối ưu D-glucosamine 64 3.3.2 Kết xác định nồng độ tối ưu Chloroquine diphosphate 66 3.4 Kết chuẩn độ virus PCV2 phân lập 69 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72 Kết luận 72 Đề nghị 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 74 Page iv DANH MỤC BẢNG Thứ tự Tên bảng Trang Bảng 1.1 Tỷ lệ lưu hành PCVAD Mỹ (đơn vị tính %) Bảng 1.2 Số liệu ca bệnh liên quan đến PCV2 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi dùng chẩn đoán PCV2 26 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi dùng định lượng PCV2 27 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi dùng để xác định virus Mycoplasma 28 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR chẩn đoán PCV2 31 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR định genotype PCV2 32 Bảng 2.6 Thành phần chu trình nhiệt phản ứng sinh tổng hợp cDNA 34 Bảng 2.7 Sơ đồ thí nghiệm tối ưu hóa nồng độ phản ứng PCR 34 Bảng 2.8 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 35 Bảng 2.9 Chu trình nhiệt ba giai đoạn phản ứng real-time PCR 39 Bảng 2.10 Chu trình nhiệt hai giai đoạn phản ứng real-time PCR* 40 Bảng 3.1 Nguồn mẫu để làm giống sản xuất vacxin PCV2 43 Bảng 3.2 Kết nested PCR chẩn đoán khẳng định PCV2 phân lập 46 Bảng 3.3 Kết kiểm tra độ khiết PCV2 phân lập với CSFV, PRRSV PPV 56 Bảng 3.4 Kết kiểm tra độ khiết PCV2 phân lập với PEDV, TGEV MHP 59 Bảng 3.5 Kết kiểm tra độ khiết chủng PCV2 phân lập 64 Bảng 3.6 Mức độ tổn thương tế bào PK15 nồng độ Dglucosamine 66 Bảng 3.7 Mức độ tổn thương tế bào PK15 nồng độ CQ 66 Bảng 3.8 Hiệu giá TCID50 chủng virus phân lập 70 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC HÌNH Thứ tự Tên hình Trang Hình 2.1 Sơ đồ vị trí mồi sản phẩm nested PCR 30 Hình 2.2 Sơ đồ pha loãng kháng thể đa dòng kháng PCV2 37 Hình 3.1 Hình ảnh tế bào PK15 sau gây nhiễm 96 (100X) 44 Hình 3.2 Kết tối ưu hóa phản ứng nested PCR 45 Hình 3.3 Kết nested PCR vòng chẩn đoán PCV2 phân lập 46 Hình 3.4 Kết nested PCR vòng chẩn đoán PCV2 phân lập 47 Hình 3.5 Kết IFA phát PCV2 mẫu phân lập được, sử dụng kháng thể đơn dòng 48 Hình 3.6 Kết tối ưu độ pha loãng kháng thể đa dòng kháng PCV2 49 Hình 3.7 Kết IFA phát PCV2 mẫu phân lập được, sử dụng kháng thể đa dòng đặc hiệu 50 Hình 3.8 Trình tự mồi đặc hiệu genotype PCV2a PCV2b 51 Hình 3.9 So sánh tương đồng trình tự mồi giám định genotype PCV2b với chủng PCV2 lưu hành Việt Nam 52 Hình 3.10 Kết nested PCR giám định genotype chủng PCV2 phân lập 53 Hình 3.11 Kết PCR phát CSFV mẫu PCV2 phân lập 54 Hình 3.12 Kết PCR phát PRRSV mẫu PCV2 phân lập 55 Hình 3.13 Kết PCR phát PPV mẫu PCV2 phân lập 55 Hình 3.14 Kết PCR phát PEDV mẫu PCV2 phân lập 57 Hình 3.15 Kết PCR phát TGEV mẫu PCV2 phân lập 58 Hình 3.16 Kết PCR phát MHP mẫu PCV2 phân lập 59 Hình 3.17 Kết PCR phát PRV mẫu PCV2 phân lập 60 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi Hình 3.18 Kết PCR phát PAdV mẫu PCV2 phân lập 61 Hình 3.19 Kết PCR phát PCV1 mẫu PCV2 phân lập 62 Hình 3.20 Kết PCR phát nhân lên PCV1 mẫu phân lập 63 Hình 3.21 Tổn thương tế bào nồng độ D-glucosamine khác 65 Hình 3.22 Tổn thương tế bào nồng độ CQ khác 67 Hình 3.23 Kết so sánh ảnh hưởng chất bổ sung tới lượng PCV2 68 Hình 3.24 Kết xác định TCID50 chủng phân lập 03, đời 25 (100X) 71 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Axit Deoxyribose Nucleic ELISA : Enzym Linked Immunosorbent Assay ORF : Open Reading Frame PBS : Phosphate – Buffered - Saline PCR : Polymerase Chain Reaction PCV : Porcine CircoVirus PCV1 : Porcine CircoVirus type PCV2 : Porcine CircoVirus type PCVAD : Porcine CircoVirus Associated Disease PDNS : Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome PK15 : Pig Kidney 15 PMWS : Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome PNP : Proliferating Necrotizing Pneumonia PRDC : Porcine Respiratory Disease Complex PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome TAE buffer : Tris-Acetate Etilendiamin Tetraaxetic Axit buffer cDNA : complementary Deoxyribose Nucleic Acid PAdV : Porcine Adenovirus PBS : Phosphate – Buffered - Saline PRV : porcine Pseudorabies Virus Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii Hình 3.20 Kết PCR phát nhân lên PCV1 mẫu phân lập Kết PCR (trình bày hình 3.20) cho thấy vạch nội đối chứng có 07/07 Điều chứng tỏ trình tách ARN, sinh tổng hợp cDNA PCR hoạt động tốt Trong 07 mẫu kiểm tra, phát mẫu phân lập số số dương tính với PCV1 Từ kết trình bày hình 3.19 3.20, kết luận rằng: có 05 tổng số 07 mẫu phân lập đạt độ khiết để tiếp tục thực thí nghiệm 3.2.2.4 Tóm tắt kết kiểm tra độ khiết PCV2 phân lập Kết kiểm tra khiết 07 chủng PCV2 phân lập với 08 loại virus 01 loại vi khuẩn có khả tạp nhiễm trình bày tóm tắt bảng 3.5 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 63 Bảng 3.5 Kết kiểm tra độ khiết chủng PCV2 phân lập Ký hiệu chủng số CSFV PRRSV PPV - - - - - - - - - - MHP PRV PAdV PCV1 - - - - + - - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - PEDV TGEV Kết bảng 3.5 cho thấy, chủng PCV2 phân lập không tạp nhiễm với 09 loại mầm bệnh kiểm tra Phát 02 mẫu phân lập tạp nhiễm với PCV1 3.3 Kết xác định nồng độ chất bổ sung tối ưu tới nhân lên virus PCV2 nuôi cấy môi trường tế bào PK15 Nội dung tiến hành nhằm lựa chọn chất bổ sung tối ưu vào môi trường tế bào PK15 nuôi cấy virus PCV2 giúp nâng cao hiệu giá virus 3.3.1 Kết xác định nồng độ tối ưu D-glucosamine Hình 3.21 trình bày kết theo dõi biến đổi tế bào PK15 nồng độ D-glucosamine khác Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 Hình 3.21 Tổn thương tế bào nồng độ D-glucosamine khác Như vậy, tổn thương tế bào PK15 chưa quan sát thời điểm sau thêm D-glucosamine (ở nồng độ ≤ 500 mM) So sánh thời điểm 12 24 sau bổ sung cho thấy tiến triển tổn thương tế bào nồng độ bổ sung 500 mM đến 62,5 mM Kết theo dõi trình bày bảng 3.6 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 Bảng 3.6 Mức độ tổn thương tế bào PK15 nồng độ D-glucosamine [D-glucosamine] mM * Tổn thương tế bào (sau 12 giờ) 1.000 ++ 500 ++ 250 ++ 125 ++ 62,5 + 31,25 - 15,63 - 7,81 - Ghi chú: * nồng độ D-glu hiểu nồng độ cuối cùng/ giếng Từ kết hình 3.21 bảng 3.6, xác định nồng độ D-glucosamine nhỏ 62,5 mM không ảnh hưởng tới phát triển tế bào PK15 dùng nghiên cứu 3.3.2 Kết xác định nồng độ tối ưu Chloroquine diphosphate Bảng 3.7 trình bày kết theo dõi biến đổi tế bào PK15 nồng độ bổ sung Chloroquine diphosphate (CQ) khác Bảng 3.7 Mức độ tổn thương tế bào PK15 nồng độ CQ Nồng độ cuối [µM] Tổn thương tế bào (sau 12 giờ) 1.000 ++ 500 ++ 250 + 125 + 62,5 - 31,25 - 15,63 - 7,81 - Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66 Hình 3.22 trình bày kết theo tổn thương tế bào PK15 nồng độ CQ khác Hình 3.22 Tổn thương tế bào nồng độ CQ khác Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 Kết hình 3.22 cho thấy nồng độ CQ ≤ 500 µM tổn thương tế bào PK15 không quan sát thời điểm sau bổ sung So sánh thời điểm 12 24 sau bổ sung cho thấy tiến triển tổn thương tế bào nồng độ bổ sung 500 µM đến 125 µM Từ kết hình 3.22 bảng 3.7, xác định nồng độ CQ nhỏ 125 µM không ảnh hưởng tới phát triển tế bào PK15 dùng nghiên cứu Trên sở tham khảo tài liệu kết trình bày, để đánh giá ảnh hưởng nồng độ chất bổ sung tới nhân lên PCV2, gây nhiễm virus với có mặt IFN- gamma nồng độ 500U/ml, D-glu nồng độ 100 mM, CQ nồng độ 31, 25 mM Chai đối chứng gồm virus gây nhiễm Hình 3.23 trình bày kết real-time PCR mẫu virus độ pha loãng 10-2 Hình 3.23 Kết so sánh ảnh hưởng chất bổ sung tới lượng PCV2 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 Kết hình cho thấy, mẫu xét nghiệm có giá trị Ct < 35, đánh giá dương tính với PCV2 Giá trị Ct xác định cho IFN-gamma cao (19,73); giá trị Ct xác định cho D-glu CQ 21,94 22,14 Trong đó, giá trị Ct mẫu không xử lý chất bổ sung có giá trị thấp khoảng chu kỳ (23,29) Như vậy, chất bổ sung nồng độ lựa chọn làm tăng tổng lượng PCV2 nhân lên tế bào PK15 so với đối chứng virus không xử lý Cũng nghiên cứu vấn đề này, Misinzo cs (2008) cho biết tế bào PK15 xử lý với interferon-gamma (IFN-γ) số hoạt chất có khả kích thích nhân lên PCV2, ammonium chloride nhân lên virus tăng 445±39%; IFN-γ tăng 1721±283%; chloroquine diphosphate tăng 1037±121%; chloroquine diphosphate + IFN-γ tăng 2199±255%; monensin tăng 950±178% monesin + IFN-γ tăng 1948±60% 3.4 Kết chuẩn độ virus PCV2 phân lập Chúng xác định hiệu giá 05 chủng PCV2 phân lập được, đạt tiêu chuẩn khiết, đời khác Kết xác định hiệu giá virus qua đời trình bày bảng 3.8 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 69 Bảng 3.8 Hiệu giá TCID50 chủng virus phân lập Chủng Lần cấy Số giếng dương tính/ tổng số giếng gây TCID50/ nhiễm độ pha loãng phân chuyển lập (đời) 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 11 4/4 2/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 2,00 14 4/4 4/4 4/4 4/4 1/4 0/4 0/4 4,75 18 4/4 4/4 4/4 4/4 2/4 0/4 0/4 5,00 25 4/4 4/4 4/4 4/4 2/4 3/4 0/4 5,75 11 4/4 4/4 2/4 1/4 0/4 0/4 0/4 3,25 20 4/4 4/4 4/4 4/4 3/4 1/4 0/4 5,50 08 4/4 3/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 2,50 10 4/4 4/4 3/4 0/4 0/4 0/4 0/4 3,25 11 4/4 4/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 2,75 07 4/4 4/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 2,75 08 4/4 4/4 2/4 0/4 0/4 0/4 0/4 3,00 11 4/4 4/4 3/4 1/4 0/4 0/4 0/4 3,50 12 4/4 4/4 2/4 1/4 0/4 0/4 0/4 3,25 07 4/4 4/4 2/4 2/4 0/4 0/4 0/4 3,50 14 4/4 4/4 4/4 1/4 0/4 0/4 0/4 3,75 16 4/4 4/4 4/4 3/4 3/4 1/4 0/4 5,25 03 04 05 06 07 0,1ml Kết cho thấy, 10-6 độ pha loãng virus lớn phát thấy tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu Hiệu giá qua lần tiếp đời 05 chủng virus nghiên cứu dao động từ 102,00 TCID50/ 0,1 ml đến 105,75 TCID50/ 0,1 ml So sánh lần tiếp đời, nhận thấy chủng phân lập số 03, 04 07 có tăng hiệu giá Trong đó, chủng phân lập số 05 06, tăng hiệu giá chưa rõ ràng đời khảo sát nghiên cứu Hình 3.24 minh họa kết IFA xác định hiệu giá TCID50 cho chủng phân lập số 03, lần tiếp đời 25 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 70 Hình 3.24 Kết xác định TCID50 chủng phân lập 03, đời 25 (100X) Như vậy, với điều kiện chất bổ trợ dòng tế bào PK15 sử dụng nghiên cứu này, xác định 03 chủng PCV2 phân lập có hiệu giá ≥ 105,00 TCID50/ 0,1 ml chủng số 03 (105,75, đời 25), chủng số 04 (105,50, đời 20) chủng số 07 (105,25, đời 16) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết trình bày, có số kết luận sau: - Đã lựa chọn 07 mẫu virus phân lập làm nguồn mẫu nghiên cứu lựa chọn chủng để sản xuất vacxin phòng bệnh PCV2 + Sử dụng phương pháp nested PCR miễn dịch huỳnh quang khẳng định có mặt PCV2 7/7 mẫu phân lập + Các chủng virus phân lập thuộc genotype PCV2b - Kết kiểm tra độ khiết với số mầm bệnh thường lưu hành gây bệnh lợn cho thấy: + 100% mẫu âm tính với CSFV, PRRSV, PPV, PEDV, TGEV, MHP, PRV PadV + Có mẫu tạp nhiễm PCV1 - Đã xác định nồng độ cuối chất bổ sung tối ưu không ảnh hưởng tới phát triển tế bào PK15 là: (i) D-glu ≤ 62,5 mM; (ii) CQ ≤ 62,5 µM + Bổ sung IFN-gamma (500 U/ml), D-glu (100 mM) CQ (31,25 µM) làm tăng tổng lượng PCV2 nhân lên tế bào PK15 so với đối chứng - Hiệu giá qua lần tiếp đời 05 chủng virus đạt độ khiết nghiên cứu dao động từ 102,00 TCID50/ 0,1 ml đến 105,75 TCID50/ 0,1 ml + Đã xác định 03 chủng PCV2 phân lập có hiệu giá ≥ 105,00 TCID50/ 0,1 ml là: Chủng phân lập số 03: 105,75 TCID50/ 0,1 ml đời 25 Chủng phân lập số 04: 105,50 TCID50/ 0,1 ml đời 20 Chủng phân lập số 07: 105,25 TCID50/ 0,1 ml đời 16 - Toàn chủng phân lập sử dụng cho bước nghiên cứu để sản xuất vacxin phòng bệnh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 Đề nghị Trên sở kết nghiên cứu tạo ngân hàng giống virus PCV2 cần tiếp tục nghiên cứu đặc tính sinh học virus để sử dụng làm giống gốc sản xuất vacxin phòng bệnh còi cọc cho lợn Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Huỳnh Thị Mỹ Lệ cs (2012) tr.8 2.Huỳnh Thị Mỹ Lệ cs, 2009, tr.8 3.Huỳnh Thị Mỹ Lệ cs (2013), tr.20 4.Nguyễn Thị Thu Hồng, Phan Hoàng Dũng, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Hà, Chris Morrissy (2006) Bước đầu khảo sát tình hình nhiễm PCV2 đàn heo nuôi số tỉnh thành phía Nam Khoa học kỹ thuật thú y, tập XIII, số 3, tr 67- 69 5.Nguyễn Thị Thu Hồng, Lê Thị Thu Phương, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Hà, Nguyễn Ngọc Hải, Chris J Morrissy, Darren Schfer (2008) Phân tích di truyền circovirus lợn typ (PCV2) lợn khu vực Nam Bộ Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XV, số 2, tr – 12 6.Nguyễn Thị Thu Hồng, Lê Thị Thu Phương, Đặng Hùng, Nguyễn Ngọc Hải, Chris J Morrissy (2010) Khảo sát đáp ứng kháng thể sau tiêm phòng vacxin dịch tả heo heo nhiễm circovirus heo typ (PCV2) Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XVII, số 6, tr 11 – 16 7.Nguyễn Viết Không cs, tr.19 8.Lam Thu Huong and Duong Chi Mai (2006) Detection of porcine circovirus from lesions of postweaning-pig with wasting disease at some farms in Ho Chi Minh city and some adjacent provinces Proceedings of international workshop on Biotechnology in agriculture, Ho Chi Minh city Vietnam, pp 65 – 67 9.Lê tiến Dũng (2006) ,tr.19 10 An, D.J., Roh, I.S., Song, D.S., Park, C.K and Park, B.K (2007) Phylogenetic characterization of porcine circovirus type in PMWS and PDNS Korean pigs between 1999 and 2006 Virus Research 129(2), pp.115-122 11 Arm strong and Bishop, 2004 , pp.7 12 Chae JS and Choi KS (2010) Genetic diversity of porcine circovirus type from pigs in Republic of Korea Research in Veterinary Science 88, pp 333-338 13 Chen Q.X, J.X Ye, J.Y Zhou, T.F Chen, H.G Shen and S.B Shang (2007) Serological survey of serum antibodies against porcine circovirus type (PCV2) in swine, chicken, duck, goat and cattle from Zhejiang province, China Revue Méd Vét.158, 8-9, 458-462 14 Chiarelli-Neto O, Yotoko KS, Vidigal PM, Silva FM, Castro LA, Fietto JL, Silva Jr A and Almeida MR (2009) Classification and putative origins of Brazilian porcine circovirus inferred through phylogenetic and phylogeographical approaches Virus Research 140, pp 57-63 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 74 15 Dupont cs, 2009, pp.16-17 16 Fenaux cs (2002), pp.21 17 Ferreira D, Sansot B, Laval A (2001) Attempt to use serotherapy to control mortality of in PMWS Proc ssDNA Viruses Plants, Birds, Pigs and Primates (ESVV), p 144 18 Francisco de Grau, PCV2 research update review, http://www.gov.mb.ca/agriculture/live stock/pork/pdf/swineseminar2009/bab23s02.pdf, accessed 4/4/2012, pp 27-34 19 Gagnon CA, Trembley D, Tijssen P, Venne MH, Houde A and Elahi SM (2007) The emergence of porcine circovirus 2b genotype (PCV-2b) in swine in Canada Canadian Veterinary Journal 48, pp 811-819 20 Gagnon CA, Music N, Fontain G, Tremblay D and Harel J (2010) Emergnece of a new type of porcine circovirus in swine (PCV): A type and type recombinant Veterinary Microbiology 144, pp 18-23 21 Gerber cs, 2011- pp.17 22 Gilpin cs, 2003 - pp 20 23 Gillespie J., T Opriessnig, X.J Meng, K Pelzer, and V Buechner-Maxwell (2009) Porcine circovirus type and porcine circovirus-associated disease J Vet Intern Med 23, pp 1151-1163 24 Grasland cs, 2005, pp.21 25 Hamel AL, Lin LL and Nayar GP (1998) Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pig Journal of Virology 72, pp 5262-5267 26 Hinton David, Intimate Relationships between Host and Pathogen & a Close-up on Asia, 1stAPVS, Seoul (Korea), September 2003 27 Jaganathan, S., Toung, O., Yee, P., Yew, T., Yoon, C and Keong, L., (2011) Genetic characterization of Porcine circovirus found in Malaysia Virology Journal 8(1), 437 28 Jantafong, T., Boonsoongnern, A., Poolperm, P., Urairong, K., Lekcharoensuk, C and Lekcharoensuk, P (2011) Genetic characterization of porcine circovirus type in piglets from PMWS-affected and -negative farms in Thailand Virology Journal 8(1), 88 29 Kun Yang, Wentao Li, Huihui Niu, Weidong Yan, Xiaoli Liu, Yang Wang, Shuang Cheng, Xugang Ku, Quigai He (2012) Efficacy of single dose of an inactivated porcine circovirus type (PCV2) whole-virus vaccine with oil adjuvant in piglets Acta Veterinaria Scandinavica 54:67, doi: 10.1186/1751-0147-54-67 30 Larochelle R, Magar R, D’Allaire S (2002) Genetic characterization and phylogenetic analysis of porcine circovirus type (PCV2) strains from cases presenting variuos Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 75 clinical condition Virus Res 90, pp 101-112 31 Llorenҫ Grau-Roma, Lorenzo Fraile, Joaquim Segalés (2010) Recent advances in epidemiology, diagnosis and control of diseases caused by porcine circovirus type The Veterinary Journal , doi: 10.1016/j.tvjl.2010.01.018 32 Maria Fort de Puig, 2009 ,13-16 33 Misinzo G., Delputte P.L., Lefebvre D.J., Nauwynch H.J (2008) Increased yield of porcine circovirus-2 by a combined treatment of PK-15 cells with interferongamma and inhibitor of endosomal-lysosomal system acidification Arch Virol 153, 337-342 DOI10.1007/s00705-007-1092-0 34 Muhling J, Raye WS, Buddle JR and Wilcox (2006) Genetic characterisation of Australian strains of porcine circovirus type and Australian Veterinary Journal 84: 421-425; discussion 416 35 McKeown N.E., T Opriessnig, P Thomas, D.K Guenette, F Elvinger, M Fenaux, P.G Halbur, and X.J Meng (2005) Effects of porcine circovirus type (PCV2) maternal antibodies on experimental infection of piglets with PCV2 Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Vol 12, No 11, pp 1347-1351 36 Neumann EJ, Dobbinson SS, Welch EB and Morris RS (2007) Descriptive summary of an outbreak of porcine postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in New Zealand New Zealand Veterinary Journal 55: 346-352 37 O'Dea MA, Kabay MJ, Carr J, Wilcox GE, Richards RB (2011) Porcine circovirusassociated disease in weaner pigs in Western Australia Aust Vet J 2011 Apr;89(4):122-30 doi: 10.1111/j.1751-0813.2010.00680.x 38 Olvera, A., Cortey, M and Segales, J (2007) Molecular evolution of porcine circovirus type genomes: phylogeny and clonality Virology 357(2), 175-85 39 Okuda cs, 2003, pp 22 40 Opriessnig, T., McKeown, N.E., Harmon, K.L., Meng, X.J., Halbur, P.G., (2006) Porcine circovirus type infection decreases the efficacy of a modified live porcine repro-ductive and respiratory syndrome virus vaccine Clin Vaccine Immunol 13 (8), 923–929 41 Opriessnig Tanja, Xiang-Jin Meng, Patrick G Halbur, (2007) Porcine circovirus type 2-associated disease: Update on current terminology, clinical manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies J Vet Invest 19, pp 591-615 42 Pallares cs (2002), pp.22 43 Rodriguez – Alrioja cộng sự, 2003, pp.10 44 Rovira A., Balasch M., Segales J., Garcia L., Planaduran J., Rosell C., Ellerbrok H., Mankertz A., Domingo M., (2002) Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 76 circovirus J Virol 76, pp 3232-3239 45 Shen cs, 2010 , pp.17 46 Segalés J., Olvera A., Grau-Roma L., Charreyre C., Nauwynck H., Larsen L., Dupont K., McCullough K., Ellis J., Krakowka S., Mankertz A., Fredholm M., Fossum C., Timmusk S., Stockhofe-Zurwieden N., Beattie V., Armstrong D., Grassland B., Baekbo P., and Allan G (2008) PCV-2 genotype definition and nomenclature Veterinary Record 162, 867-868 47 Segalés, J., Allan, G.M and Domingo, M (2005) Porcine circovirus diseases Animal Health Research Reviews 6(02), 119-142 48 Segalés Joaquim (2011) Porcine circovirus type (PCV2) infections: Clinical signs, pathology and laboratory diagnosis Virus Res (2011), doi:10.1016/j.virusres.2011.10.007 49 Takahagi Yoichi, Y Nishiyama, Shinji Toki, Taro Yonekita, Fumiki Morimatsu, Hiroshi Murakami (2008) Genotypic Change of Porcine Circovirus Type on Japanese Pig Farms as Revealed by Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis J Vet Med Sci 70, 603-606 50 Tischer I, Peters D, Rasch R, Pociuli S (1987) Replication of porcine circovirus: induction by glucosamine and cell cycle dependence Arch Virol 96, pp 39-57 51 Tomas Cs, 2008, pp.23 52 Vincent cs, 2003 ,pp 21 53 Wang, F., Guo, X., Ge, X., Wang, Z., Chen, Y., Cha, Z and Yang, H., (2009) Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type Virus Research 145(1), 151-156 54 http://www.thepigsite.com Whole Herds PCV2 vaccination the Way forward, accessed 17 april 2012 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 77 [...]... một đề tài nghiên cứu sản xuất vacxin phòng bệnh PMWS do PCV2 gây ra sử dụng chủng virus vacxin từ chính những chủng virus phân lập được ngoài thực địa tại Việt Nam Vì vậy, việc nghiên cứu đề tài Nghiên cứu xây dựng ngân hàng giống Virus Porcine circovirus typ2 (PCV2) phân lập được sản xuất vacxin phòng bệnh còi cọc ở lợn con để tạo ra ngân hàng giống virus PCV2 đang lưu hành gây bệnh ở đàn lợn nuôi... virus đã phát hiện được từ động vật như porcine circovirus type 1 và 2 (circovirus ở lợn) , canary circovirus (circovirus ở chim hoàng yến), bovine circovirus (circovirus ở bò), goose circovirus (circovirus ở ngỗng), ostrich circovirus (circovirus ở đà điểu), raven circovirus (circovirus ở quạ) và human circovirus (circovirus gây hội chứng mệt mỏi mạn tính ở người) Các chủng PCV2 phân lập được trên thế giới... lập thuần khiết để làm giống sản xuất vacxin phòng bệnh còi cọc ở lợn con sau cai sữa * Ý nghĩa khoa học của đề tài: - Đây là nghiên cứu đầu tiên nhằm tạo ra chủng PCV2 đủ tiêu chuẩn làm giống gốc để sản xuất vacxin phòng bệnh ở Việt Nam - Nguồn dữ liệu của đề tài rất có ý nghĩa, là tiền đề khoa học trong việc triển khai các nghiên cứu tiếp theo, đặc biệt để sản xuất vacxin phòng PCVAD * Ý nghĩa thực... là những nghiên cứu bước đầu, phục vụ cho những nghiên cứu kế tiếp về vacxin phòng bệnh còi cọc ở lợn sau cai sữa * Mục đích của đề tài Tạo ra ngân hàng giống virus PCV2 đang lưu hành gây bệnh ở đàn lợn nuôi tại Việt Nam phục vụ cho những nghiên cứu kế tiếp về vacxin phòng bệnh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 * Yêu cầu Lựa chọn được chủng PCV2 phân lập thuần... khi thử nghiệm vacxin vô hoạt PCV2 cho lợn con 28 ngày tuổi cho thấy tỷ lệ lợn có bệnh tích đã giảm rõ rệt so với lợn không tiêm vacxin Hiện nay có vacxin vô hoạt phòng bệnh do PCV2 gây ra, dùng cho lợn nái và lợn hậu bị giúp giảm tỷ lệ mắc PMWS; lợn con bú sữa đầu có kháng thể thụ động giúp phòng bệnh Ngoài ra còn có nhiều nghiên cứu sản xuất vacxin tái tổ hợp, vacxin ADN giúp phòng bệnh do PCV2 gây... quả nghiên cứu giúp sản xuất được vacxin phòng PCVAD có hiệu quả, hạn chế dịch bệnh gây ra cho đàn lợn nuôi tại Việt Nam Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về PCV2 và bệnh do PCV2 gây ra Porcine circovirus (PCV) thuộc họ Circoviridae, bao gồm Porcine circovirus type 1 (PCV1) và Porcine circovirus type 2 (PCV2) PCV1 được. .. circoviridae gồm 3 giống, được xác định là nguyên nhân gây một số bệnh ở gia súc và gia cầm: - Giống Anellovirus: gồm một số circovirus của người như Transfusion Transmitted Virus hay Torque teno virus (TTV) Virus này được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 tại Nhật Bản và thường phân lập được từ bệnh nhân mắc bệnh gan; tuy nhiên chúng không được coi là nguyên nhân gây bệnh Một số nghiên cứu gần đây cho... phân lập ở đàn lợn nuôi tại Việt Nam 2.2 Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành tại bộ môn Vi sinh vật – truyền nhiễm, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; cùng với sự giúp đỡ của phòng thí nghiệm Nghiên cứu và phát triển, công ty Cổ phần Công nghệ phát triển nông thôn (RTD) 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Giám định độ thuần khiết của virus PCV2 phân lập được + Chẩn đoán PCV2 phân lập được. .. tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nhiễm Porcine circovirus 2 (PCV2) ở lợn đến đáp ứng miễn dịch tiêm phòng vacxin dịch tả lợn và biện pháp khắc phục Kết quả bước đầu cho thấy đã xác định và phân lập được PCV2 ở đàn lợn nuôi tại một số tỉnh như Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13 Hà Nội, Bắc Giang, Hà Nam, Phú Thọ (tài liệu chưa công bố, 2012) Nghiên cứu của Huỳnh... chứng còi cọc ở lợn sau cai sữa (postweaning multisystemic wasting syndrome – PMWS); Hội chứng viêm da và viêm thận (porcine dermatitis and nephropathy syndrome – PDNS); Hội chứng viêm đường hô hấp (porcine respiratory diseases complex) và Hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn (porcine reproductive disorders); gây tác động lớn tới sức sản xuất của đàn lợn Trong số các bệnh do circovirus gây ra, PMWS được ... Ging Circovirus: gm cỏc virus ó phỏt hin c t ng vt nh porcine circovirus type v (circovirus ln), canary circovirus (circovirus chim hong yn), bovine circovirus (circovirus bũ), goose circovirus. .. circovirus (circovirus bũ), goose circovirus (circovirus ngng), ostrich circovirus (circovirus iu), raven circovirus (circovirus qu) v human circovirus (circovirus gõy hi chng mt mi mn tớnh ngi)... Polymerase Chain Reaction PCV : Porcine CircoVirus PCV1 : Porcine CircoVirus type PCV2 : Porcine CircoVirus type PCVAD : Porcine CircoVirus Associated Disease PDNS : Porcine Dermatitis and Nephropathy