Tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa (ananas comosus) bằng phương pháp lọc

Đặc điểm, nguồn gốc và ứng dụng của enzyme bromelain Bromelain có tên gọi khác: Bromelin, Ananase.[7] Tên thương mại: Bromanase Kramer – Novis brormelain 2400 maximum strength Vitaliz

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



LÊ NGỌC HÊN

TÁCH CHIẾT ENZYME BROMELAIN TỪ PHẾ

LIỆU VỎ DỨA (ANANAS COMOSUS) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP LỌC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Bảo

NHA TRANG, 8/2015

LỜI CẢM ƠN

Qua một thời gian được nghiên cứu và thực tập tại phòng thực nghiệm Trường Đại Học Nha Trang, em đã hoàn thành đồ án tốt nghiệp Để hoàn thành đồ án này, ngoài sự nổ lực của bản thân em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến sự giúp đỡ tận tình của quý Thầy Cô cùng bạn bè

Trước hết xin gửi lời cảm ơn Ban lãnh đạo nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Chế biến, cùng thầy cô trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành chương trình học tập và thực hiện tốt công tác tốt nghiệp

Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Thầy giáo hướng dẫn: TS Nguyễn Bảo

đã định hướng, tận tình chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và em cũng xin chân thành cảm ơn Thầy Nguyễn Công Minh, tất cả các Cô phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm, phòng Chế biến thủy sản, phòng Công nghệ cao, Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này

Cuối cùng em xin bày tỏ sự biết ơn đến Cha Mẹ luôn tạo điều kiện, động viên lo lắng và bạn bè đã giúp đỡ em trong thời gian học tập cũng như quá trình thực hiện đồ

án này

Nha Trang, tháng 8 năm2015 Sinh viên thực hiện

Lê Ngọc Hên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về dứa 3

1.2 Tổng quan về enzyme bromelain 4

1.2.1 Khái niệm về enzyme 4

1.2.2 Đặc điểm, nguồn gốc và ứng dụng của enzyme bromelain 5

1.2.3 Tính chất của enzyme broemelain 8

1.3 Các phương pháp tách chiết và tinh sạch của enzyme 18

1.3.1 Tách chiết enzyme bằng phương pháp kết tủa 19

1.3.2 Phương pháp hấp phụ chọn lọc 19

1.3.3 Phương pháp trao đổi ion 20

1.3.4 Phương pháp tách hệ 2 pha nước [5] 20

1.3.5 Phương pháp siêu lọc (Ultrafiltration) 20

1.4 Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme 22

1.4.1 Phương pháp định lượng protein bằng Microbiuret 23

1.4.2 Xác định protein bằng phương pháp A280 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Phương tiện nghiên cứu 25

2.2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Đối tượng chiết rút enzyme bromelain 25

2.2.2 Xác định hàm lượng protein của enzyme bromelain bằng Phương pháp microbiuret: 33

2.2.3 Xác định hoạt tính của enzyme bằng phương pháp A280 35

2.3 Bố trí thí nghiệm 38

2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát chế độ ly tâm cho quá trình lọc 11 µm 38

2.3.2 Thí nghiệm 2: Cut-off từng công đoạn khác nhau để khảo sát sự ảnh hưởng của hoạt tính của enzyme bromelain 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Kết quả khảo sát thông số ly tâm sau công đoạn lọc thô 43

3.2 Hiệu suất thu hồi và định mức sản phẩm 45

3.4 Hàm lượng protein bằng phương pháp microbiuret 46

3.5 Hoạt tính riêng của enzyme bromelain ở từng công đoạn bằng phương pháp A280 48

3.6 Kết quả nghiên cứu cut-off tại các công đoạn ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain 49

3.7 Đề xuất quy trình sản xuất hoàn thiện 49

Quy trình 49

Thuyết mình quy trình 50

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 55

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BSA: Bovine serum albumin

TCA: Tricloroacetic Acid

BAA: Benzyol – L –Arginine Amidez

BAEE: Benzyol – L –Arginine Ethyl Esther

BAEM: Benzyol – L –Arginine Methyl Esther

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Số liệu sản lượng vỏ dứa của các tỉnh thành trên cả nước (2013) 4

Bảng 1.2 Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelain 11

Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải của bromelain 14

Bảng 1.4 Hằng số Michaelis (pH 6,5, 50 ºC) với các cơ chất khác nhau 14

Bảng 2.1 Mối quan hệ giữa áp suất và độ thăng hoa của nước đá 32

Bảng 2.2 Dựng đường chuẩn nồng độ BSA bằng phương pháp microbiuret 34

Bảng 2.3 Dựng đường chuẩn nồng độ BSA bằng phương pháp A280 36

Bảng 2.4 Đánh giá cảm quan của dịch dứa sau ly tâm 40

Bảng 2.5 Miêu tả cảm quan của dịch dứa sau ly tâm 40

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá cảm quan thông số ly tâm sơ bộ 43

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá cảm quan cho thời gian công đoạn ly tâm ở thông số 3000 vòng 44

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quả dứa 3

Hình 1.2 Cấu trúc sợi hydro carbon của enzyme bromelain 10

Hình 1.3 Cấu trúc bậc 1 của bromelain 11

Hình 1.4 Trình tự sắp xếp các amino acid của quả dứa 12

Hình 1.5 So sánh thành phần, chuỗi amino acid của bromelain thân và quả 13

Hình 1.6 Tổng quan về quá trình lọc 21

Hình 2.1 Vỏ dứa 25

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tách chiết enzyme bromelain 26

Hình 2.3 Máy đông khô 29

Hình 2.4 Giản đồ pha của nước 29

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí khảo sát chế độ ly tâm cho quá trình lọc 11 µm 39

Hình 2.6 Sơ đồ khảo sát hoạt tính enzyme bromelain ở từng công đoạn 41

Hình 3.1 Hiệu suất thu hồi hỗn hợp enzyme bromelain qua từng công đoạn của qui trình chiết rút 45

Hình 3.2 Khối lượng riêng của dịch chiết ở từng công đoạn trong quá trình chiết rút hỗn hợp enzyme bromelain 46

Hình 3.3 Đồ thị hàm lượng protein (%) 47

Hình 4.4 Đồ thị hoạt tính riêng của protein enzyme 48

Hình 3.5 Quy trình tách chiết enzyme bromelain từ vỏ dứa 49

LỜI MỞ ĐẦU

Hầu như mọi phản ứng hóa học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme – chất xúc tác sinh học Chính vì vậy, những nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực liên quan khác nhằm tìm ra được những công dụng khác nhau của mỗi enzyme Những nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột

protein thịt bằng enzyme bromelain từ vỏ dứa

Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, đối với một số bệnh, đặc biệt là bệnh mang tính di truyền, có thể do thiếu hay mất hẳn một hoặc số enzyme trong các mô, các điều kiện không bình thường cũng có thể xuất hiện do hoạt tính dư thừa của một số enzyme đặc hiệu Do đó xác định hoạt tính của một số enzyme trong huyết tương, hồng cầu hoặc trong các mô là rất hết sức cần thiết trong việc chẩn đoán bệnh và nó đã trở thành công cụ thực tế không thể thiếu không những trong y học

cả trong công nghệ hóa học, trong chế biến thực phẩm

Hiện tại trên thế giới enzyme được sản xuất từ nguồn động vật đang đối mặt với nhiều vấn đề về đạo đức, tôn giáo, truyền thống văn hóa, phong tục truyền thống của các quốc gia và ngày càng cạn kiệt nguồn nguyên liệu nên việc thực hiện trên nguồn thực vật đang dần được chú trọng hơn Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nghiên liệu rất phong phú, dồi dào (dứa, đu đủ…) Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp chỉ sử dụng một phần của quả dứa, phần còn lại là phụ phẩm Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có thể giảm thiểu chất hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm enzyme bromelain có từ cây dứa Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: Peptidase, amidase, esterase có thể phân

hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng có giá trị kinh tế cao

Từ những lợi ích của enzyme bromelain mang lại, được sự chấp nhận của Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nha Trang và sự hướng dẫn của Thầy

Nguyễn Bảo, em xin tiến hành thực hiện Đồ án tốt nghiệp “Tách chiết enzyme

bromelain từ phế liệu vỏ dứa (Ananas comosus) bằng phương pháp lọc”

Nội dung nghiên cứu

- Đề xuất qui trình tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa

- Khảo sát các thông số kỹ thuật của từng công đoạn

- Đánh giá hiệu suất thu hồi bã qua từng công đoạn

- Đánh giá hàm lượng protein qua từng công đoạn

- Đánh giá hoạt tính của enzyme bromelain qua từng công đoạn

Mục tiêu đề tài:

Nghiên cứu quy trình tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu vỏ dứa (Ananas

comosus) bằng phương pháp lọc, phương pháp mới nhưng vẫn tinh sạch được và cho

sản phẩm enzyme có chất lượng tốt Từ đó có thể áp dụng sản xuất rộng rãi trong thực

tế

Ý nghĩa khoa học:

Góp phần cung cấp thông tin về nghiên cứu tách chiết enzyme bromelain từ phế liệu dứa và enzyme khác (papain từ nhựa đu đủ, ficin từ nhựa sung) bằng phương pháp lọc Cung cấp thêm nguồn enzyme từ thực vật cho thị trường thế giới

Ý nghĩa thực tiễn:

- Năng cao thu nhập cho người nông dân trồng dứa

- Giảm ô nghiễm môi trường, giảm chi phí xử lý rác thải và mang lại nguồn lợi nhuận từ phế liệu dứa cho các nhà máy chế biến đồ hợp dứa

nóng, cảm nắng

Thuộc về họ Dứa (Bromeliaceae), được biết đến nhiều nhất là loài Ananas

comosus, là loại dứa cho quả ăn được Chi này có nguồn gốc từ khu vực Nam Mỹ và

được đưa tới các đảo khu vực Caribe nhờ những thổ dân Anh điêng Carib Năm 1493, Christopher Columbus lần đầu tiên đã nhìn thấy các loại cây của chi này tại Guadeloupe Nó được đưa sang châu Âu và từ đây nó được người Anh và Tây Ban Nha phát tán tới các đảo trên Thái Bình Dương Các cánh đồng trồng dứa thương phẩm được thành lập tại Hawaii, Philippines, Đông Nam Á, Florida và Cuba Dứa đã

trở thành một trong những loại cây ăn trái phổ biến nhất trên thế giới Từ Ananas có

nguồn gốc từ tiếng Guarani để chỉ cây dứa

Tại Việt Nam, dứa được trồng khá phổ biến, phân bố từ Phú Thọ đến Kiên Giang Tiền Giang là tỉnh có sản lượng dứa đứng đầu cả nước Năm 2013, sản lượng

dứa của tỉnh Tiền Giang đạt 233,000 tấn Tiếp theo là Kiên Giang (114,400 tấn), Ninh Bình (48,900 tấn), Thanh Hóa (23,600 tấn), Quảng Nam (22,400 tấn), Nghệ An, Hậu Giang (19,000 tấn) Tổng sản lượng cả nước năm 2013 đạt 585,6 ngàn tấn Nhiều địa phương xây dựng thương hiệu đặc sản quả dứa như dứa Đồng Giao (Tam Điệp - Ninh Bình), hoặc ở Kiên Giang (Khóm Tắc Cậu), Tiền Giang đều có những nhà máy chuyên sản xuất, chế biến các thực phẩm từ quả dứa [13]

Hằng năm tổng sản lượng phế phẩm của vỏ dứa từ các tỉnh là rất lớn, gây ô nhiễm môi trường và hết sức lãng phí Đây cũng là nguồn nguyên liệu dồi dào cho việc tách chiết bromelain tăng giá trị kinh tế

Bảng 1.1 Số liệu sản lượng vỏ dứa của các tỉnh thành trên cả nước (2013)

Nguồn: Thống kê của bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn (2013)

1.2 Tổng quan về enzyme bromelain

1.2.1 Khái niệm về enzyme

1.2.1.1 Khái niệm

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra các quá trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không tồn tại Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp các quy luật phản ứng của rất nhiều các phản ứng hóa học khác nhau Các phản

ứng hóa học phức tạp này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều hòa lẫn nhau

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định Hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn Vì vậy có thể đánh giá hoạt tính của enzyme

bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng

1.2.1.2 Cơ chế tác dụng của enzyme

Bản chất của các phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của enzyme, các cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hóa học của cơ chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản phẩm của phản ứng Dưới tác dụng của enzyme cơ chất có thể thay đổi không chỉ về cấu trúc hóa học mà còn thay đổi tính chất hóa học Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra ở ba giai đoạn:

- Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzyme-cơ chất Phức hệ này thường không bền Phản ứng tạo ra phức hệ enzyme-cơ chất thường xảy ra rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng

- Giai đoạn thứ hai: Khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, cả về mức độ bền vững các liên kết Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm

- Giai đoạn thứ ba: Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng được tạo thành và tách ra khỏi enzyme

Cơ chế xúc tác tổng quát của enzyme như sau:

Ghi chú: E – enzyme; S – cơ chất (substrate); P – sản phẩm (products)

1.2.2 Đặc điểm, nguồn gốc và ứng dụng của enzyme bromelain

Bromelain có tên gọi khác: Bromelin, Ananase.[7]

Tên thương mại: Bromanase (Kramer – Novis) brormelain 2400 maximum

strength (Vitalize Corp)

Là tên gọi chung cho các enzyme phân giải protein được tìm thấy trong các thành

viên khác nhau của gia đình nhà bromeliaceae Bromelain từ dứa (Ananas comosus)

được nghiên cứu nhiều nhất Nồng độ enzyme cao nhất được tìm thấy ở phần thân của cây dứa trưởng thành, cũng hiện diện với số lượng đáng kể trong trái và lá Trước đây, cây dứa thường được sử dụng như một loại cây làm thuốc

Năm 1957, nhà nghiên cứu Heinicke đã nhận thấy trong thân cây dứa có một lượng lớn bromelain và họ bắt đầu tìm cách tách chiết nó và sản xuất thuốc để chữa bệnh Tùy theo nguồn thu nhận mà phân biệt bromelain thân hay bromelain quả Bromelain thân là nhóm enzyme có giá trị kinh tế cao Ở mỗi bộ phận khác nhau trên

thân cây dứa, bromelain có pH tối ưu và cấu tạo khác nhau

Bromelain có vai trò trong y học nên được nghiên cứu rất nhiều Bromelain là enzyme thủy phân protein, nó phân cắt protein trong cơ thể sinh vật Một trong những lợi ích của nó được chú ý đến đó là một chất giúp cho tiêu hóa vì nó hoạt động ở môi trường acid và cả trong môi trường kiềm của ruột non Nó thay thế được cho cả những enzyme tiêu hóa khác như pepsin và trypsin Bromelain có tác dụng kháng viêm, rất có hiệu quả trong chữa trị bệnh viêm khớp do đó các chuyên gia y tế đề nghị sử dụng bromelain làm giảm lượng prostaglandin trong cơ thể gay ra đau, viêm và ngăn cản sự thẩm thấu các chất dinh dưỡng qua mô bằng cách ngăn cản những tiền chất gây viêm Bromelain có ảnh hưởng tích cực trên các prostaglandin hữu dụng Trong một nghiên cứu trên thỏ đưa ra kết quả khẳng định: Bromelain làm giảm phù nề các vết thương tốt hơn khi kết hợp với trypsin và rutin

Bromelain phối hợp với thuốc kháng sinh trong điều trị một số bệnh nhiễm khuẩn sẽ làm tăng hiệu quả kháng sinh, phối hợp với một số thuốc điều trị hen (theophhyllin, ephedrin…) làm tăng tác dụng chống hen Một nghiên cứu trên tạp chí Anh cho biết, qua thử nghiệm trên chuột, các nhà khoa học đã nhận thấy bromelain làm giảm hơn 50% dấu hiệu viêm phổi đối với bệnh hen và liều lượng càng cao thì hiệu quả được cải thiện Bromelain làm tăng hệ miễn dịch giúp người bị ung thư giảm được di căn (200 -300 mg bromelain/kg thể trọng kết hợp với xạ trị hoặc hóa trị) Nó còn có tác dụng chữa đau tim (làm tan máu tụ gây đau tim) Ngoài ra còn rất nhiều ứng

dụng khác trong các ngành công nghiệp như:

- Công nghiệp thực phẩm:

Thủy phân gan bò: Bromelain được ứng dụng để xử lý gan bò nhằm thu dịch thủy phân gan có hàm lượng acid amine cao Gan bò được xử lý bằng chế phẩm bromelain

trong thời gian 10 giờ ở nhiệt độ 55 0C, sau đó xử lý ở 100 0C trong vòng 3-4 phút Dịch thủy phân tách được đem lọc và đông khô Hàm lượng acid amine của chế phẩm

tăng lên gấp 1,5 – 2 lần so với sản phẩm ban đầu (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998)

- Làm đông tụ sữa:

Renin là loại enzyme được sử dụng làm đông sữa truyền thống, enzyme này được thu

từ ngăn thứ 4 của dạ dày bê Tuy nhiên, lượng renin không đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của công nghiệp làm sữa Vì vậy, ngày nay người ta có xu hướng thay thế enzyme renin bằng enzyme thực vật, trong đó bromelain được quan tâm sử dụng nhiều

hơn (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998)

- Trong chế biến bia và nước giải khát:

Trong chế bia và nước giải khát; bromelain được dùng để làm trong bia và nước quả (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998; Quách Đĩnh và ctv, 1996

- Tăng cường sự ổn định protein của các loại bia và ngăn chặn sự hình thành

sương mù trong công nghiệp sản xuất rựu bia.[8]

- Cải thiện độ đàn hồi và tăng mức co giãn của bột, sản xuất bột không gây kích ứng trong công nghiệp nướng

- Thủy phân protein myofibril của thịt, làm tác nhân thủy phân cho thịt gà, sò và mực trong việc làm mềm thịt

- Thủy phân protein cá để tạo ra protein cá thủy phân

- Ức chế sự biến nâu của trái cây và oxy hoá phenol

- Bổ sung vô thức ăn chăn nuôi: Trong việc phân hủy protein trong thức ăn ở động vật nhai lại

- Giảm thời gian làm mềm trong kén ăn, giảm bỏ tạp chất và qui mô của các sợi len, tăng cường tính nhuộm của các sợi protein trong công nghiệp dệt may

- Làm trắng răng: Loại bỏ các vết bẩn, mảng bám, mãnh vụn thức ăn thừa bám trên răng

- Mỹ phẩm: Trị mụn trứng cá, nám, giảm sưng và bầm tím sau khi tiêm

1.2.3 Tính chất của enzyme broemelain

- Protein ức chế chẳng hạn như cystatin

Hỗn hợp tổng thể này của bromelain có xu hướng hoạt động phản ứng trên liên kết có analyl, glycyl và leucyl

Khi tách chiết và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfhydryl của bromelain thì không chỉ phụ thuộc vào phân đoạn mà còn phụ thuộc nhiều yếu tố khác có trong bromelain

Hiện tại người ta ghi nhận được bromelain trong dứa có trọng lượng phân tử

33000 dalton lớn gấp 1.5 lần so với papain

Trọng lượng phân tử của bromelain thân (EC.3.4.22.32- stem bromelain) ở giá trị trung bình (22830,93 dalton), đoạn chính (22816,26 dalton) Nó có tám thành phần cơ bản có hoạt tính thủy phân protein như trên Hai thành phần chính được gọi là F4 (24397 dalton) và F5 (24472 dalton) [7] Phân đoạn có hoạt tính mạnh nhất là F9 (23464 dalton) chiếm khoảng 2 % protein trên tổng số Người ta ước tính rằng khoảng

50 % protein của F4 và F5 là glycosylate, trong khi đó ở F9 không có glycosylate pH tối thích của phân đoạn F4 và F5 là 4,0 đến 4,5 và của F9 thì gần với pH trung tính.[9]

So với bromelain thân thì bromelain quả (EC 3.4.22.33-fruit bromelain) có trọng lượng phân tử nguyên tử (39029,6 dalton), đoạn propepetide (36417,12 dalton), đoạn chín (24880,75 dalton)

Có sự khác nhau giữa các trọng lượng phân tử của bromelain quả và thân như trên là do các PTM của các acid amin thay đổi, dẫn đến trọng lượng phân tử của đoạn

code của mã di truyền thay đổi theo

Dịch chiết được chiết tách từ các thành phần khác nhau trên cây dứa sẽ có hoạt

động sinh lý khác nhau nhưng hoạt tính thủy phân thì giống nhau

Bromelain có thể thấm qua hoàn toàn dạ dày và ruột của động vật Nồng độ cao nhất của bromelain được tìm thấy trong máu sau khi ăn một giờ, tuy nhiên hoạt động thủy phân protein của nó bị bất hoạt nhanh chóng có thể do tác động của các enzyme

nội sinh và yếu tố α-2-macroglobuline của huyết thanh [2]

1.2.3.2 Cấu tạo hóa học

Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain (từ đu đủ), ficin (nhựa sung) ở chỗ nó là glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1 fuctose Sợi hydrate carbon này liên kết hoán vị với sợi polypeptide Trong sợi hydrate này dường như một nữa sợi

không kiên kết đến cơ chế xúc tác phân tử

Người ta đề nghị cấu trúc sợi hydrate carbon của phân tử bromelain như sau:

OH

OH

OH OH OH

OH

OHOH

OH OH

OH OH

NH-CO-CH2-CH

CN

Hình 1.2 Cấu trúc sợi hydro carbon của enzyme bromelain

Khi phân tích thành phần amino acid ở bromelain thân và quả thì tùy vào phương pháp thu nhận và phân tích mà có thành phần amino acid thay đổi khác nhau Thay đổi

trong khoảng 144-321 amino acid và bromelain quả là 161-283 amino acid

Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine là valine và ở đầu carbonhydrate là glycine, còn bromelain quả có amino acid ở đầu amine là alanine

Bảng 1.2 Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelain

1.2.3.3 Cấu trúc không gian của bromelain

Theo Murachi và Busan[10] , cấu trúc bậc 1 của bromelain được sắp xếp amino

acid trong phân tử bromelain như sau:

Hình 1.3 Cấu trúc bậc 1 của bromelain

Bromelain là protein là một trung tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S- Phân tử có dạng hình cầu dó đó có

cách sắp xếp phức tạp, bao gồm 351 amino acid:

Hình 1.4 Trình tự sắp xếp các amino acid của quả dứa

Nhưng trong đó enzyme bromelain chỉ từ amino acid 122 đến 351 Còn lại amino acid 1 đến 24 là các hoạt chất sinh học bắt tính hiệu kết hợp với các propeptide 25 đến

121 ngắt tách protein enzyme bromelain ra ngay tại vị trí đó

Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfulhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite Ngoài ra, trong phân tử còn có các ion Zn2+ có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzyme Ngoài ra nó cũng không có khác biệt lớn về trình tự sắp xếp và thành phần amino acid của bromelain quả Bảng so sánh các thành phần, chuỗi amino acid của

bromelain thân và quả:[10]

Hình 1.5 So sánh thành phần, chuỗi amino acid của bromelain thân và quả

1.2.3.4 Tính riêng biệt

Hai hình thức (A và B) của Bromelain với độ đặc hiệu tương tự đã được phân lập

từ thân dứa [10]

1.2.3.5 Hoạt tính của bromelain

Hoạt tính phân giải

Bromelain có ba hoạt tính khác nhau: Peptidase, amidase và esterase Bromelain thân

có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp như hemoglobin, casein, gelatin, BAA (Benzyol – L –Arginine amidez), BAEE (Benzyol – L –Arginine Ethyl

Ester), BAEM (Benzoyl – L – Arginine Methyl Ester) [2]

Khả năng thủy phân cơ chất tự nhiên của bromelain

Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải của bromelain

Bromelain thân Bromelain trái xanh Bromelain trái chín

Nguồn: [2]

Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao hơn

bormelain trái xanh và bromelain trái chín

Khả năng phân giải cơ chất nhân tạo của bromelain

Bromelain trái xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelain thân và bromelain trái chín

Bảng 1.4 Hằng số Michaelis (pH 6,5, 50 ºC) với các cơ chất khác nhau

Enzyme cơ chất BAA BAEE BAEM

Bromelain thân 1,2*10-3 17*10-1 3,2*10-2

Papain 3,9*10-2 1,89*10-3

Ficin 4,8*10-3 2,5*10-2

Nguồn: [2]

- BAA: Benzyol – L –Arginine amidez

- BAEE: Benzyol – L –Arginine Ethyl Esther

- BAEM: Benzyol – L –Arginine Methyl esther

Theo Murachi et al., (1964) với cơ chất là hemoglobin thì bromelain mạnh gấp 4

lần papain, với casein thì tương đương với cơ chất BAA, BAEE thì kém hơn

Như vậy hằng số xúc tác của bromelain đối với BAEE gấp 140 lần so với BAA, khác

hẳn trường hợp papain và ficin

Ý nghĩa của hằng số Michaelis-Menten: Chính là giá trị nồng độ cơ chất khi tốc

độ phản ứng bằng ½ tốc độ cực đại Km có đơn vị là Molar, đơn vị nồng độ Hằng số Michaelis là hằng số rất quan trọng Nó xác định ái lực của enzyme với cơ chất Km càng nhỏ thì ái lực càng lớn, tốc độ phản ứng càng cao vì thế tốc độ cực đại Vmax đạt

ở giá trị nồng độ cơ chất thấp

Cơ chế tác dụng

Bromelain thủy phân protein, peptide, amit và các este của các axit amin và peptide; vị trí phân cắt ưu tiên là cacbonyl cuối của lysine, alanine, tyrosine và glycine Tài liệu nước ngoài

Đối với hoạt động trên một số chất amino acid Barman thấy [14] [3] [3] Các hoạt động phía sau có thể được phát hiện trong các chế phẩm Bromelain: Amylase, phosphatase, peroxidase, rất không ổn định khi lưu trữ sau này

Theo Doi E et al., (1974) bromelain thô có tác dụng như một carboxyl-peptitase (từ dịch tụy) thủy phân các liên kết peptide tận cùng cạnh nhóm carboxyl tự do của cơ chất, nhất là khi acid amine tận cùng có nhân thơm

Hầu hết các tác giả đều thừa nhận vai trò của nhóm –SH của cystein, nhóm imidazole của histidin và nhóm đi sulfur trong hoạt động thủy phân của bromelain Nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất (nơi cá liên kết peptide bị cắt) Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anino của chất nhận khác Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain Casein và hemoglobin là hai cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và acid amine Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amine và peptide

Ở giai đoạn đầu Zn2+ rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm hoạt động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng kết phối trí bổ sung với các nhóm chức năng của phân tử protein như amine, carboxyl…)

Enzyme – SH + Zn 2+ => enzyme – S – Zn + H+

Do vậy nhóm –SH trong trung tâm hoạt động đã bị ester hoá bởi cơ chất, cấu trúc

không gian được bảo vệ ổn định

1.2.3.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelain

Ảnh hưởng của một số hóa chất và biến đổi cấu trúc của bromelain

Bromelain là một proteinase thiol, nó có chứa trong các trung tâm hoạt động một cysteine phản ứng cao cần thiết cho xúc tác Do đó, các enzyme có thể được kích hoạt bằng cách giảm các hợp chất, ví dụ như cysteine, 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, KCN Mặt khác, bromelain không được phục hồi ức chế bởi các tác nhân alkyl hóa như N-ethylmaleimide (NEM), acid iodoacetic và 1,3-dibromoacetone Ức chế được hồi phục bởi chất vô cơ ion Hg, các hợp chất hữu cơ và Hg tetrathionate.[4]

Giới hạn pH và nhiệt độ hoạt động của bromelain

- PH tối ưu cho hoạt động xúc tác phụ thuộc vào bản chất của chất nền, loại và nồng độ đệm và sự hiện diện hay vắng mặt của một chất khử

- Khoảng pH tối ưu là khoảng 4,5-7,5

- Nhiệt độ tối ưu là 35-45 °C [5]nhiệt độ hoạt động tối đa cho các ứng dụng công nghiệp (thời gian phản ứng ≤4h) là 50 °C [12]

- Thiệt hại gây ra bởi hoạt động lưu trữ hoặc chuẩn bị các điều kiện không thích hợp có thể được bãi bỏ đến một mức độ đáng kể bởi việc bổ sung cysteine

Ảnh hưởng của ion kim loại

- Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme Vì bromelain thuộc nhóm protease cystein, trung tâm hoạt động có nhóm –SH Bromelain bị ức chế bởi các ion hoặc hợp chất có

ái lực mạnh hơn nhóm –SH, các tác nhân oxy hóa, halogen hóa, alkyl hóa như: Iodoacetate, cloacetophenol, H2O2 Các ion kim loại như Fe, Cu, Ag, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử bromelain [2]

1.2.3.7 Độ hòa tan, điểm đẳng điện, dữ liệu quang phổ

Độ hòa tan: Bromelain hòa tan một phần trong nước nhưng không tan hầu hết trong các dung môi hữu cơ

Điểm đẳng điện: 9,55

Dữ liệu quang phổ: E280 (1%, 1cm) = 20,1

1.2.3.8 Nghiên cứu trong và ngoài nước

Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain trong nước

Ở nước ta có nhiều công trình công bố về nghiên cứu sử dụng enzyme bromelain, các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh sạch và khả năng ứng dụng của enzyme này như:

Lê Thị Thanh Mai (1997) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng bromelain cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng aceton hay cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton, cũng như có thể tính sạch bromelain theo phương pháp lọc gel sephadex G75 với hiệu suất cao Nghiên cứu còn cho thấy có thể sử dụng enzyme này để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm.[1] Dương Thị Hương Giang và Lê Thanh Hùng (2002) nghiên cứu điều kiện nhằm

ổn định phương pháp tinh sạch bromelain bằng nước khóm khô cho thấy có thể thu nhận và tinh sạch enzyme bromelain bằng phương pháp sắc ký và trao đổi ion trên cột SP-Streamline XL với hiệu suất cao

Tạp trí khoa học đại học Cần Thơ “trích ly enzyme bromelain từ phế phẩm khóm Cầu – Đúc Hậu Giang”, theo Nguyễn Văn Thành và cộng tác viên (30/10/2013) đã khảo sát các tác nhân ảnh hưởng đến trích ly và bảo quản enzyme bromelain Kết quả nghiên cứu cho thấy trong số những phế phẩm (lá, thân, trái) thân khóm là nguồn cơ chất thích hợp để sản xuất brmelain Chế phẩm enzyme bromelain được kết tủa với amonium sulfate 70%, ở nhiệt độ 28 ºC, cho sản lượng 69,52% protein Bột enzyme thu được bởi sấy chân không 24 giờ, độ ẩm đạt 1,87% và hoạt lực 12,29 (TU/mg) Bột

enzyme thu được nên bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4 ºC ) trong chai thủy tịnh có hoạt lực

ổn định trong 12 tuần

Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain ngoài nước

Theo Salem và ctv (1995) đã sử dụng tỉ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm papain, tripsin , ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (Sardine, Macaroni, Bolti, Bourri và Shark ) Kết quả cho thấy với 0,3% bromelain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (Sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%

Liang và ctv (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain được tăng lên

1.3 Các phương pháp tách chiết và tinh sạch của enzyme

Enzyme có mặt trong tất cả các tế bào, chúng tồn tại ở dạng nội bào hay ngoại bào.Vì vậy vấn đề tách và thuần khiết enzyme là công việc rất khó khăn, đặc biệt đối với các enzyme nội bào Muốn tách enzyme nội bào ra khỏi tế bào thì cần phải phá vỡ cấu trúc tế bào bằng các biện pháp cơ học như: nghiền với cát hoặc tác dụng của máy siêu âm Sau đó dùng nước cất, dung dịch đệm hoặc dung dịch muối trung tính để

chiết enzyme ra

Có nhiều những khó khăn trong tách chiết enzyme ra khỏi tế bào như:

Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác

Do đó, việc tách để thu nhận thành phần này là rất khó Nó là chất hữu cơ không bền, chúng có rất dễ bị biến tính khi bị tác động của các yếu tố bên ngoài Là protein, luôn

đi cùng những loại protein không phải là enzyme nhưng lại có tính chất lý hóa rất giống protein enzyme Do đó, việc tách chiết protein-enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt kết quả tốt và gặp rất nhiều khó khăn

Vì thế để thuần khiết enzyme cần phải tiến hành phối hợp nhiều biện pháp khác nhau như đem dung dịch lọc ly tâm theo tốc độ tăng dần ta sẽ thu được những phần có trọng lượng khác nhau hoặc có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng

của nhiệt độ hay pH môi trường Việc tách enzyme có thể sử dụng nhiều phương pháp sau:

1.3.1 Tách chiết enzyme bằng phương pháp kết tủa

- Tủa bằng dung môi:

Tuỳ theo tính chất của từng loại enzyme sẽ kết tủa tối đa ở nồng độ dung môi nào

đó Các dung môi hữu cơ dùng kết tủa phổ biến là: Aceton, ethanol, izopropionic Các dung môi này có thể gây nên sự vô hoạt enzyme nên quá trình kết tủa này nhất thiết tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp

- Tủa bằng muối trung tính:

Muối trung tính thường là (NH4)2SO4 Ngoài ra NaCl cũng hay dùng kết tủa enzyme Tác dụng kết tủa của các ion, muối tỷ lệ thuận với lực ion của chúng Mỗi loại enzyme sẽ bị kết tủa tối đa ở một nồng độ xác định và tiến hành kết tủa môi trường có pH gần pH điểm đẳng điện của enzyme Các muối vô cơ sau đó có thể loại

bỏ bằng phương pháp thẩm tích hay lọc gel Kết tủa enzyme bằng muối trung tính ít gây giảm hoạt lực của enzyme hơn so với kết tủa bằng dung môi hữu cơ

1.3.2 Phương pháp hấp phụ chọn lọc

Đây là một trong những phương pháp tinh chế enzyme quan trọng và thành công nhất Để thực hiện phương pháp này người ta cho dịch enzyme chảy từ từ qua cột chất hấp phụ Khi đó tùy theo khả năng tương tác của chất hấp phụ với từng loại enzyme, các enzyme khác nhau sẽ được hấp phụ với khả năng khác nhau Sau đó dung dịch đệm thích hợp để triết rút enzyme ra khỏi cột Phương pháp hấp phụ thường được dung để làm đặc dung dịch enzyme

Có thể thực hiện hấp phụ chọn lọc các enzyme theo hai cách:

- Hấp phụ âm tính: Nếu enzyme không được hấp phụ, phương pháp xử lý này có thể xem như là dung chất hấp phụ để tách những hợp chất tạp ra khỏi dung dịch enzyme

- Hấp phụ dương tính: Nếu enzyme được hấp phụ, nó sẽ được tách ra khỏi những cấu tử khác trong dung dịch và sau đó được rửa giải khỏi chất hấp phụ bởi dung dịch đệm pH kiềm hoặc các dung dịch khác có khả năng rửa giải enzyme

1.3.3 Phương pháp trao đổi ion

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự trao đổi ion giữa các enzyme tích điện với các ion của chất nhựa Sau đó cho dung dịch enzyme thả từ từ vào cột chứa các chất nhựa trao đổi ion Khi dung dịch chất điện giải chạy qua cột với nồng độ tăng dần, các ion của dung dịch sẽ đẩy ra khỏi nhựa, các enzyme vừa liên kết với nhựa Lúc đó enzyme nào có ái lực với nhựa kém nhất sẽ bị đẩy ra trước nhất và cuối cùng các enzyme khác nhau sẽ được tách ra khỏi cột theo từng giai đoạn khác nhau Các chất nhựa trao đổi ion là các chất tổng hợp hữu cơ (các loại Dower, Amberlit,

wofatit, permurit hoặc dẫn xuất của xenluloza như DEAE-Sephadex, CM-Sephadex)

1.3.4 Phương pháp tách hệ 2 pha nước

Cơ sở của phương pháp này dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp dung

dịch hai pha không hòa tan vào nhau

Các hệ hai pha đặc trưng bằng cách trộn các hệ 2 pha khác nhau vào với nhau để tạo thành hai pha riêng biệt Hệ dung môi được sử dụng trong phương pháp này có thể

là Polyme/Polyme như: Polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc Polymer/muối như: PEG và potassium phosphate.[6]

Các protein và mãnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì vậy phương pháp này có thể sử dụng cho cả hai trường hợp: Phân tách protein khỏi mãnh vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch protein

Sự phân tách đạt hiệu quả cao tùy thuộc vào các thông số như khối lượng phân

tử, điện tích của khối lượng nghiên cứu, nhiệt độ và khối lượng phân tử của các polyme, nhiệt độ pH, thời gian, lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các loại muối

đa hóa trị như phosphate hoặc sulphate

1.3.5 Phương pháp siêu lọc (Ultrafiltration)

Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để tách phân đoạn các thành phần trong chất lỏng đó Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua Tùy theo kích thước của lỗ trên màng (giá trị loại trừ cut-off) mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ cho nước và những chất có phân tử nhỏ đi qua còn những phân tử lớn

sẽ được giữ lại ở trên màng đó là chất cần sử dụng Dưới đây là hình miêu tả quá trình

lọc trong quy trình công nghệ của đề tài, phương pháp lọc (ULTRAFILTRATION) sử dụng cả ba kích thước lọc khác nhau lần lượt như: Lọc 11 µm, 1,2 µm và màng 10 kDa Sau khi đã qua màng lọc 1,2 µm, thì bước lọc cuối cùng được diễn ra thuận lợi ta thu được enzyme bromelain có kích thước 30 kDa Ở kích thước màng lọc này thì cho nước và các chất có kích thước nhỏ hơn 10 kDa đi qua, còn những phần được giữ lại trên màng là enzyme bromelain

Hình 1.6 Tổng quan về quá trình lọc

Màng siêu lọc có cấu tạo bởi các sợi rỗng, trong mỗi sợi rỗng lại có nhiều lỗ rỗng lại xếp song song và gắn chặt với những lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất thấm qua Các sợi này được chế tạo từ các polyme bền như fluoroplime (Fs: Fluorosurfactant), cenlulose acetate (CA), polysulphone (GR)…tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng loại màng thích hợp Ví dụ: Cô đặc protein (dùng màng FS,

GR); cô đặc enzyme dùng màng (GR)

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc:

Nhiệt độ: phải thực hiện ở nhiệt độ lạnh tránh khả năng kết tủa protein và khi tăng nhiệt độ sẽ làm bít màng Phải thích hợp với từng sản phẩm và loại màng sử dụng

Áp suất: Thường tốc độc của dòng chảy (số lít chất lỏng qua 1 m2 màng trong 1h)

sẽ tăng cùng sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt đến giá trị (vận tốc) cực đại Nếu áp suất tăng lên cao hơn nữa thì dòng chảy sẽ giảm Người ta đề nghị tốc độ dòng chảy nên ở từ 4-5 lít/phút, tương ứng với hiệu suất PI1 – PI2 ở trong khoảng 0,5-3 bar Áp suất dòng vào lớn nhất (PI1 max) là 7 bar (tương đương 102 Psi), áp suất dòng ra nhỏ nhất (PI2 min) là 0,5bar (tương đương 7,25 Psi)

Các kiểu siêu lọc: có ba kiểu hệ thống siêu lọc

- Kiểu một bước (single pas operation)

- Kiểu lô (batch operation): Chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nồng độ dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt như yêu cầu

- Kiểu thể tích không đổi (constan volume operation): Dòng chất lỏng được cấp liên tục để thể tích ở trong chậu chứa không thay đổi và chất lỏng được được tuần hoàn qua màng đến nồng độ dung dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt như yêu cầu

Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc:

- Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể

Đối với enzyme: Enzyme có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính

Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzyme Trong quá trình thực hiện nếu thêm nước vào thì độ tinh sạch enzyme càng cao

Trong quá trình siêu lọc, nhiệt độ 10 – 20 ºC được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng suất cao mà không bị mất hoạt tính enzyme Quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ở nhiệt độ thấp (5 ºC)

Hiện nay, thật sự chưa có một phương pháp chuẩn nào thật sự có hiệu quả trong việc làm sạch enzyme Do đó, việc làm sạch enzyme chỉ thật sự có hiệu quả khi ta biết lựa chọn các phương pháp riêng, kết hợp với nhau, tạo ra hệ thống phương pháp nổi tiếp nhau một cách hoài hòa nhất

1.4 Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme

Người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt độ của enzyme Người ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải xác định gián tiếp qua hoạt độ hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng

Hiện nay được sử dụng nhiều là một trong ba nhóm phương pháp sau để xác định

khả năng xúc tác của enzyme

- Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành sau một thời gian nhất định và lượng enzyme đã xác định trước Phương pháp này được sử dụng rỗng rãi và tương đối chính xác

- Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định

- Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời nhất định sẽ thu được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm

1.4.1 Phương pháp định lượng protein bằng Microbiuret

Tìm hiểu sơ lược về protein

Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là các acid amin Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide) Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein

Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ học, … hay tác nhân hóa học như axit, kiềm mạnh, muối kim loại nặng, … các cấu trúc bậc hai, ba và bậc 4 của protein bị biến đổi nhưng không phá cỡ cấu trúc bậc một của nó, kèm theo đó là sự thay đổi của các tính chất của các protein ban đầu

Protein có tính kỵ nước do các acid amin (aa) trong chuỗi polypeptit của protein hướng ra ngoài các gốc này liên kết với nhau tạo liên kết kị nước

Nguyên lý: Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu++ thành một phức

chất màu tím (phản ứng biuret), màu của phức chất tỷ lệ với số liệu peptid (-CO-NH) của protein và gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và glubulin

1.4.2 Xác định protein bằng phương pháp A280

Nguyên lý: Tiến hành đo lượng sản phẩm được tạo thành sau một thời gian nhất

định và lượng enzyme đã xác định trước Protease khi thủy phân các cơ chất protein

BSA tạo ra các sản phẩm tan trong dung dịch TCA (Tricloacetic acid)

- Hoạt độ enzyme của chế phẩm được biểu diễn bằng “đơn vị hoạt độ proteolytic” Một đơn vị hoạt độ proteolytic (UI) là lượng enzyme mà trong một phút

ở 30 ºC có khả năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong acid tricloacetic cho phản ứng màu với thuốc thử folin-Ciocalteau tương ứng với một µmol

tyrosin

- Hoạt độ riêng của chế phẩm được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt độ proteolytic trên một mg protein của chế phẩm (số UI/mg protein)

- Hiệu suất thu hồi protein là tỷ lệ giữa tổng hoạt tính enzyme thu được sau quá trình tinh sạch và tổng hoạt tính enzyme trong mẫu trước khi đem tinh sạch

- Độ tinh sạch là tỷ lệ giữa hoạt tính riêng của enzyme thu được sau quá trình tinh sạch và hoạt tính riêng của mẫu trước khi đem tinh sạch

- Đơn vị hoạt độ

Khả năng xúc tác của enzyme được xác định thông qua hoạt độ hoạt động của enzyme Hoạt độ hoạt động của enzyme thông qua đơn vị hoạt độ

- Đơn vị quốc tế (UI)

Đơn vị hoạt độ quốc tế là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1 µmol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

1 UI = 1 µmol cơ chất (10-6 mol)/phút

Hoạt độ riêng: Hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme là số đơn vị WI (hoặc một đơn vị Katal) ứng với một militre dung dịch (nếu là dung dịch) hoặc một miligram protein (nếu là bột khô) của chế phẩm enzyme Khi biết được khối lượng phân tử của enzyme ta hoàn toàn có thể tính được hoạt độ riêng của phân tử

Hoạt độ riêng của phân tử: Hoạt độ riêng của phân tử enzyme là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử

enzyme trong một đơn vị thời gian