2.2.1. Đối tượng chiết rút enzyme bromelain
Tham khảo từ các tạp chí, nghiên cứu trong và ngoài nước từ trước đến nay như : Tôi đưa ra quy trình tách chiết bromelain từ vỏ dứa dự kiến:
Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tách chiết enzyme bromelain
Thuyết minh quy trình:
Vỏ dứa được gọt ra từ quả dứa thu mua tại chợ Vĩnh Hải – Nha Trang, Khánh Hòa. Được làm sạch, cắt nhỏ rồi ép thu dịch. Để tăng hiệu suất dịch ép, vỏ dứa được làm đông trước khi ép, mục đích làm phá vỡ cấu trúc tế bào của dứa. Sau đó dịch được lần lượt lọc thô qua hai vải lọc có kích thước lỗ lọc khác nhau. Dịch sau lọc thô được mang đi ly tâm, thu dịch loại bỏ những bã chất rắn, thuận lợi cho quá trình tiếp theo.
Bước kế tiếp dịch ly tâm được lọc hút chân không (giảm thời gian lọc) qua giấy lọc kích thước 11 µm. Sau đó lại được lọc qua màng 1,2 µm. Tiếp đến là công đoạn siêu lọc: Dùng micropipet hút 0,04 ml dịch dứa đã được lọc qua màng 1,2 µm và được vortex được đồng nhất mẫu cho vào ống cut off 10 kDa, sau đó đặt vào ống ly tâm oppendoft, cân cho khối lượng mẫu đều nhau, đặt đối trọng các ống với nhau và xoay vai nắp về bên trong, đậy nắp máy ly tâm, chỉnh thông số ly tâm 14000 x g trong 30 phút và vận hành máy. Kết thúc quá trình ly tâm, công đoạn thu dịch cô đặc ta chút ngược các ống cut off cho vào ống oppendof sạch khác đã chuẩn bị sẵn và đặt vào máy như lúc ban đầu, chú ý không đậy nắp và chỉnh thông số 1020 x g trong 2 phút và thu mẫu.
Ở công đoạn siêu lọc này sau khi qua các bước lọc 11 µm và 1,2 µm đã thuận lợi cho quá trình siêu lọc, những chất có kích thước nhỏ hơn 10 kDa và nước được đi qua còn những chất có kích thước lớn hơn 10 kDa thì được giữ lại trên màng, đó chính là hỗn hợp enzyme bromelain.
Dịch cô đặc sau đó được rút ra bằng micropipet 20-200 µl, cho vào tủ đông -40 ºC trước khi dùng khăn giấy 3 lớp buộc chặt miệng ống chứa dịch cô đặc và cho vào sấy đông khô. Kết thúc quá trình đông khô ta thu bột khô lại (bromelain thô) cho vào bao bì PE hoặc lọ thủy tinh, bảo quản -20 ºC.
Vận hành máy đông khô
- Chế độ tự động:
Để chạy chế độ tự động, nhấn nút REFRIGERATION AUTO. Đèn xanh LED ở trên phím sáng và modul lạnh sẽ khởi động. Khi bộ thu đạt -40 ºC, bơm chân không sẽ khởi động. Các đèn chỉ nhiệt độ và độ chân không chỉ nhiệt độ bộ thu và độ chân không của hệ thống. Màn hình LCD chỉ nhiệt độ thực tế của bộ thu. Khi độ chân không của hệ thống trên 5 mBar độ chân không chỉ “Hi”. Ở độ chân không 5 mBar và dưới hơn, màn hình sẽ hiển thị độ chân không thực tế.
Khi độ chân không của hệ thống nhỏ hơn 0,45 và 0,133 mBar, đèn led chân không dưới cùng sẽ nháy. Khi mức chân không trong hệ thống nhỏ hơn 0,133 mBar, đèn led xanh sẽ sáng chỉ mẫu có thể đưa vào hệ thống.
Để chạy chế độ bằng tay, ta nhấn nút REFRIGERATION MAN, sau đó modul lạnh sẽ khởi động, đèn xanh LED ở trên phím sáng. Khi bộ thu đạt -40 ºC, nhấn nút VACUUM, bơm chân không sẽ khởi động. Các đèn chỉ nhiệt độ và độ chân không chỉ nhiệt độ bộ thu và độ chân không của hệ thống. Màn hình LCD chỉ nhiệt độ thực tế của bộ thu. Khi độ chân không của hệ thống trên 5 mBar độ chân không chỉ “Hi”. Ở độ chân không 5 mBar và dưới hơn, màn hình sẽ hiển thị độ chân không thực tế.
Khi độ chân không của hệ thống nhỏ hơn 0,45 và 0,133 mBar, đèn led chân không dưới cùng sẽ nháy. Khi mức chân không trong hệ thống nhỏ hơn 0,133 mBar, đèn led xanh sẽ sáng chỉ mẫu có thể đưa vào hệ thống.
- Làm đông mẫu trước:
Mẫu trước khi đông khô cần làm đông mẫu trước, mẫu bỏ vào bình chứa chỉ khoảng một nửa hoặc một phần ba thể tích của bình chứa. Nhiệt độ làm đông phụ thuộc vào đặc tính của mẫu.
- Gắn mẫu vào hệ thống:
Kết nối mẫu đã làm đông trước và van mẫu trên buồng chứa nhiều cổng có sử dụng một adapter. Xoay van nhựa về phía đóng van mà kết nối vào hệ thống chân không. Rồi mở van để thông hệ thống chân không của máy và bình mẫu.
Trước khi cho thêm mẫu khác vào hệ thống, ta để hệ thống chân không xuống dưới 0,133 mBar. Khi tất cả sương biến mất trên bề mặt của bình chứa của bình chứa mẫu và không nhận thấy dấu hiệu băng nào trên bề mặt của bình chứa là mẫu đã khô hẳn. Để chắc chắn lượng ẩm cuối cùng là thấp nhất ta chạy mẫu thêm vài giờ để mẫu khô hẳn.
Để lấy bình chứa ra sau khi đông khô xong, vặn nút nhựa trên van về vị trí đóng và thông áp cho bình chứa. Với ống Ampul có thể dùng đèn khò lửa hàn lại ống.
- Tắt máy
Sau khi kết thúc đông khô, đầu tiên ta xả chân không của hệ thống bằng cách vặn nút nhựa về vị trí mở thông áp với môi trường chân không. Nhắn nút Vacuum tắt máy bơm. Nhắn tiếp nút Refrigeration switch để tắt hệ thống lạnh, cuối cùng tắt máy.
Rút nút ở đầu ống xả phía cạnh bên phải của máy. Đặt đầu xả vào dụng cụ chứa dung môi hoặc nước tan trong bình thu chạy vào. Bỏ nắp buồng thu và cho đá trong buồn thu chảy ra ngoài. Lau khô buồn thu với giấy thấm. Sau đó rửa lại bằng nước cất và chú ý không cho chất lỏng vào cổng chân không ở phía trên của buồn.
Hình 2.3 Máy đông khô
Nguyên lý của sấy đông khô (thăng hoa):
Theo giản đồ pha của nước, tại điểm ba (Triple Point) nước tồn tại đồng thời ở ba thể: Thể rắn, thể lỏng và thể khí. Nhiệt độ và áp suất của ba điểm tương ứng bằng t = 0,0098 ºC; p= 4,6 mmHg.
Trên giản đồ hình đường BO biểu diễn ranh giới giữa pha rắn và pha hơi. Tương tự như vậy đường OA là ranh giới giữa pha rắn, pha lỏng và cuối cùng đường OK là ranh giới giữa pha lỏng và pha khí. Điểm K gọi là điểm tới hạn, ở đó ẩn nhiệt hóa hơi có thẻ xem như bằng 0.
Nếu ẩm trong vật liệu sấy có trạng thái đóng băng ở điểm F như trên giản đồ, được đốt nóng đẳng áp đến nhiệt độ tD tương ứng với điểm D thì nước ở thể rắn sẽ thực hiện quá trình thăng hoa DE. Cũng trên giản đồ có thể thấy rằng áp suất càng thấp thì nhiệt độ thăng hoa của nước càng bé. Do đó, khi cấp nhiệt cho vật liệu sấy ở áp suất càng thấp thì độ chênh lệch nhiệt độ giữa nguồn nhiệt và vật liệu sấy càng tăng. Đứng về mặt truyền nhiệt thì đây là ưu điểm của sấy thăng hoa so với sấy chân không bình thường.
- Quá trình sấy thăng hoa chia làm 3 giai đoạn:
Giai đoạn làm lạnh:
Trong giai đoạn này nếu vật liệu sấy được làm lạnh từ nhiệt độ môi trường khoảng 20 ºC xuống đến nhiệt độ -10÷-40 ºC. Trên hình 2 nhiệt độ vật liệu sấy biểu diễn bởi đường A. Đồng thời trong giai đoạn này không gian của bình thăng hoa được hút chân không và áp suất trong bình giảm xuống. Do áp suất giảm nên phần áp suất hơi nước trong không gian bình thăng hoa cũng giảm so với phần áp suất hơi nước trong lòng vật liệu sấy. Điều đó dẫn đến hiện tượng thoát ẩm từ vật liệu sấy nhỏ hơn nhiệt độ điểm ba. Áp suất trong bình thăng hoa cùng nhỏ hơn áp suất điểm ba. Theo số liệu thực nghiệm có khoảng 10 ÷ 15% toàn bộ ẩm thoát ra khỏi vật trong giai đoạn này
Giai đoạn thăng hoa:
Trong gia đoạn này, nhờ có dòng nhiệt chủ yếu là bức xạ từ các tấm bức xạ, nước trong vật liệu sấy bắt đầu thăng hoa mảnh liệt. Độ ẩm của vật liệu sấy giảm rất nhanh và gần như tuyến tính.
Như vậy giai đoạn thăng hoa có thể xem là giai đoạn có tốc độ sấy không đổi. Đương nhiên, phần lớn nhiệt lượng vật liệu sấy nhận được trong giai đoạn này hầu như không đổi.
Cuối giai đoạn này nhiệt độ vật liệu sấy mới dần dần tưng từ -10 ÷ -40 ºC lên 0 ºC. Đến đây quá trình thăng hoa kết thúc.
Giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại
Sau giai đoạn thăng hoa, do trạng thái của nước trong vật liệu sấy nằm trên điểm ba nên ẩm trong vật liệu sấy trở về dạng lỏng. Vì khi đó áp suất trong bình thăng hoa vẫn được duy trì bé hơn áp suất khí trời nhờ bơm chân không và vật liệu sấy vẫn tiếp tục được gia nhiệt nên ẩm vẫn không ngừng biến từ dạng lỏng lên dạng hơi và đi vào
không gian bình thăng hoa. Như vậy giai đoạn bốc hơi còn lại chính là quá trình sấy chân không bình thường.
Như vậy, trong sấy thăng hoa mối quan hệ giữa là rất quan trọng. Khi áp suất càng thấp thì nhiệt độ sấy thăng hoa càng giảm, nhưng trong thực tế rất khó đạt được độ chân không thấp, để lựa chọn một chế độ sấy thích hợp, bảng 3.1 sẽ cho ta thấy mối quan hệ giữa áp suất và nhiệt độ thăng hoa của nước đá.
Bảng 2.1 Mối quan hệ giữa áp suất và độ thăng hoa của nước đá Áp suất Nhiệt độ mmHg N/m2 ºC 4,6 613,333 0,0098 1 133,333 -17,5 0,1 13,333 -39,3 0,001 0,133 -57,6
Ưu điểm: Đây là phương pháp cho chất lượng sản phẩm sấy tốt nhất, ít biển đổi thành phần hóa học, giữ lại hương vị ban đầu của nguyên liệu, có độ phục hồi trạng thái cao khi hút ẩm
Nhược điểm: Việc đưa vào ứng dụng rộng rãi trong sấy thực phẩm thì còn hạn chế do tốn nhiều năng lượng, thiết bị đắt tiền, năng suất không cao.
Đến nay mới được ứng dụng để sấy sản phẩm có giá trị kinh tế cao.
Chỉ tiêu theo dõi: - Hiệu suất thu hồi (%).
- Khối lượng bột enzyme bromelain (g).
- Hàm lượng protein (mg) theo phương pháp Microbiuret.
- Hoạt tính riêng của enzyme bromelain (U/g protein). Theo phương pháp A280.
2.2.2. Xác định hàm lượng protein của enzyme bromelain bằng Phương pháp microbiuret: microbiuret:
Dụng cụ: Ống nghiệm, bình định mức, ống đông, micropipet các loại, vật liệu thông thường của phòng thí nghiệm.
Hóa chất: BSA (Bovine serum albumin), TCA (tricloroacetic acid), CuSO4.5H2O và NaOH, đệm phosphate pH = 7.2.
Thiết bị: Máy đo UV-mini1240, máy vortex.
Thực hiện:
Dung dịch pha cơ chất (dung dịch A)
- Dung dịch A: Acetic acid 0,04M (2,32 ml pha thành 1000 ml), phosphoric acid 0,04M, boric acid 0,04M.
- Dung dịch B: 8g NaOH hòa tan trong nước cất và thêm nước đến 1000 ml. - Pha đệm pH 7,2: Lấy 100 ml dung dịch A và 55 ml dung dịch B, đo và điều chỉnh pH (bằng NaOH hoặc HCl), thêm nước cất lên 200 ml.
Dung dịch pha enzyme bromelain (dung dịch B):
- Pha dung dịch muối sinh lý bằng cách dùng dung dịch đệm pH 7,2 ở trên (dung dịch A), có nồng độ NaCl 0,9%.
- Dùng dung dịch này đi pha vào enzyme bột khô với thể tích V thích hợp, để đi xác định nồng độ protein của enzyme; và dùng để đi phản ứng với cơ chất (ví dụ BSA, … ) trong phép đo hoạt tính của enzyme.
- Dùng dung dịch này để pha với cơ chất (BSA) để dựng đường chuẩn.
Dung dịch thuốc thử microbiuret:
- Dung dịch A: Pha 40g NaOH bằng 100 mL H2O - Dung dịch B: 400 mg CuSO4 bằng 40 mL H2O
- Cho dung dịch B vào dung dịch A và thêm H2O đủ 150 mL tổng cộng, khuấy đều cho đến khi tan hết.
- Ghi nhãn, dung dịch thuốc thử được giữ trong chai sẫm màu và được bảo quản lạnh ở 4 ºC.
Dung dịch để pha BSA để dựng đường chuẩn:
- Dùng hỗn hợp B pha với TCA (tricloroacetic acid) có nồng độ 5%. (gọi tắt là dung dịch C)
- Pha dung dịch chuẩn BSA 1 mg/mL, bỏ 100 mg bột BSA vào trong 80 mL dung dịch dung dịch C, khuấy nhẹ tránh tạo bọt. Sau đó định lượng đến 100 mL. Bảo quản ở 4 °C.
- Dung dịch protein chuẩn này dùng để dựng đường chuẩn.
Bảng 2.2 Dựng đường chuẩn nồng độ BSA bằng phương pháp microbiuret
Ống C (mg/ml) mL "dd B" mL (BSA, 1mg/ml) mL Microbiuret mg protein A325 0 0,0 2,0 0,0 1,0 1 0,01 1,97 0,03 1,0 2 0,02 1,94 0,06 1,0 3 0,04 1,88 0,12 1,0 4 0,08 1,76 0,24 1,0 5 0,16 1,52 0,48 1,0 6 0,32 1,04 0,96 1,0 7 0,667 0 2 1,0
Sau đó vortex đồng hóa mẫu, các ống được ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Rồi mang đi đo OD ở bước sóng 325 nm.
- Xử lý mẫu:
Enzyme bromelain được hòa tan bằng được hoà tan bằng dung dịch B, lấy thể tích phù hợp + dung dịch C sao cho tổng là 2 mL. Thêm 1 mL thuốc thử microbiuret
sao cho tổng là 3 mL. Rồi Sau đó bố trí cho dịch lần lượt vào ống nghiệm tương tự như xây dựng đường chuẩn. Thay BSA bằng enzyme bromelain. Sau đó mang đi phân tích hàm lượng protein bằng thiết bị đo UV-vis minil1240.
- Tính kết quả:
Kết quả đo được tính tương ứng với giá trị y (OD 325 nm), dựa vào phương trình đường chuẩn tính ra được hàm lượng protein có trong 1 ml dịch.
Trong đó:
V: Thể tích mẫu sau khi pha loãng (ml) C: Hàm lượng protein trong 1ml (mg/ml) M: Khối lượng mẫu mang đi ủ (gam) Mc: Độ ẩm của mẫu mang đi phân tích (%) - Phương pháp xử lý số liệu:
Các số liệu được xử lý theo phần mềm excel 2010 của hãng Microsoft, mỗi thí nghiêm bố trí song song 3 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình cộng 3 lần thí nghiệm.
2.2.3. Xác định hoạt tính của enzyme bằng phương pháp A280
Dụng cụ: Cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, pipet, bình tam giác, giấy lọc, phễu, máy khuấy từ, ống nghiệm, máy ổn nhiệt, máy đo UV-mini1240.
Hóa chất: Dung dịch BSA 1%, TCA 5%, acetic acid 0,04 M, phosphoric acid 0,04 M, NaOH, CuSO4, (NaCl 0,9%), nước cất.
- Xây dựng đường chuẩn BSA:
Hòa tan 4 mg BSA trong 4 mL nước cất và cho lần lượt các dung dịch vào trong ống nghiệm theo thứ tự như bảng dưới:
- Dung dịch thuốc thử
Dung dịch A: Hòa tan 4 g NaOH trong 10 ml nước cất. Dung dịch B: Hòa tan 40 mg CuSO4 trong 4 ml nước cất.
Trộn dung dịch B vào A, sau đó thêm nước cất rồi định mức lên 15 ml.
Chú ý: Dung dịch thuốc thử được giữ trong chai sẫm màu và được bảo quản lạnh ở 4 ºC. Dựng đường chuẩn nồng độ BSA bằng phương pháp đo ở A280:
Bảng 2.3 Dựng đường chuẩn nồng độ BSA bằng phương pháp A280 Ống C (mg/ml) mL "dd B" mL (BSA, 1mg/ml) mg protein A280 0 0,0 3,0 0,0 1 0,01 2,97 0,03 2 0,02 2,94 0,06 3 0,04 2,88 0,12 4 0,08 2,76 0,24 5 0,16 2,52 0,48 6 0,32 2,04 0,96 7 0,667 1 2 Sau đó vortex đồng hóa mẫu, rồi mang đi đo OD ở bước sóng 280 nm.
- Bước 1: Pha BSA 10 mg/mL bằng dung dịch A và ủ trong bể ổn nhiệt ở 30 0C (chú ý phải tính toán thể tích phù hợp cho nhiều mẫu).
- Bước 2: Cho 0,1 ml enzyme vào mỗi ống phản ứng (phải biết trước nồng độ từ trước). Chú ý enzyme được hoà tan bằng dung dịch B với thể tích phù hợp, rồi đi đo nồng độ. Nếu nồng độ cao, thì pha loãng để đi thuỷ phân.
-.Bước 3: Cho 0,9 ml của BSA (10mg/mL) vào ống "enzyme - cơ chất", ủ 10 phút trong 30 °C.
- Bước 4: Thêm 1 ml 10% TCA (phải chuẩn bị trước) vào ống enzyme - cơ chất và ống đối chứng.
- Bước 5: Cho 0,9 ml của 1% BSA vào ống "đối chứng".