microbiuret:
Dụng cụ: Ống nghiệm, bình định mức, ống đông, micropipet các loại, vật liệu thông thường của phòng thí nghiệm.
Hóa chất: BSA (Bovine serum albumin), TCA (tricloroacetic acid), CuSO4.5H2O và NaOH, đệm phosphate pH = 7.2.
Thiết bị: Máy đo UV-mini1240, máy vortex.
Thực hiện:
Dung dịch pha cơ chất (dung dịch A)
- Dung dịch A: Acetic acid 0,04M (2,32 ml pha thành 1000 ml), phosphoric acid 0,04M, boric acid 0,04M.
- Dung dịch B: 8g NaOH hòa tan trong nước cất và thêm nước đến 1000 ml. - Pha đệm pH 7,2: Lấy 100 ml dung dịch A và 55 ml dung dịch B, đo và điều chỉnh pH (bằng NaOH hoặc HCl), thêm nước cất lên 200 ml.
Dung dịch pha enzyme bromelain (dung dịch B):
- Pha dung dịch muối sinh lý bằng cách dùng dung dịch đệm pH 7,2 ở trên (dung dịch A), có nồng độ NaCl 0,9%.
- Dùng dung dịch này đi pha vào enzyme bột khô với thể tích V thích hợp, để đi xác định nồng độ protein của enzyme; và dùng để đi phản ứng với cơ chất (ví dụ BSA, … ) trong phép đo hoạt tính của enzyme.
- Dùng dung dịch này để pha với cơ chất (BSA) để dựng đường chuẩn.
Dung dịch thuốc thử microbiuret:
- Dung dịch A: Pha 40g NaOH bằng 100 mL H2O - Dung dịch B: 400 mg CuSO4 bằng 40 mL H2O
- Cho dung dịch B vào dung dịch A và thêm H2O đủ 150 mL tổng cộng, khuấy đều cho đến khi tan hết.
- Ghi nhãn, dung dịch thuốc thử được giữ trong chai sẫm màu và được bảo quản lạnh ở 4 ºC.
Dung dịch để pha BSA để dựng đường chuẩn:
- Dùng hỗn hợp B pha với TCA (tricloroacetic acid) có nồng độ 5%. (gọi tắt là dung dịch C)
- Pha dung dịch chuẩn BSA 1 mg/mL, bỏ 100 mg bột BSA vào trong 80 mL dung dịch dung dịch C, khuấy nhẹ tránh tạo bọt. Sau đó định lượng đến 100 mL. Bảo quản ở 4 °C.
- Dung dịch protein chuẩn này dùng để dựng đường chuẩn.
Bảng 2.2 Dựng đường chuẩn nồng độ BSA bằng phương pháp microbiuret
Ống C (mg/ml) mL "dd B" mL (BSA, 1mg/ml) mL Microbiuret mg protein A325 0 0,0 2,0 0,0 1,0 1 0,01 1,97 0,03 1,0 2 0,02 1,94 0,06 1,0 3 0,04 1,88 0,12 1,0 4 0,08 1,76 0,24 1,0 5 0,16 1,52 0,48 1,0 6 0,32 1,04 0,96 1,0 7 0,667 0 2 1,0
Sau đó vortex đồng hóa mẫu, các ống được ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Rồi mang đi đo OD ở bước sóng 325 nm.
- Xử lý mẫu:
Enzyme bromelain được hòa tan bằng được hoà tan bằng dung dịch B, lấy thể tích phù hợp + dung dịch C sao cho tổng là 2 mL. Thêm 1 mL thuốc thử microbiuret
sao cho tổng là 3 mL. Rồi Sau đó bố trí cho dịch lần lượt vào ống nghiệm tương tự như xây dựng đường chuẩn. Thay BSA bằng enzyme bromelain. Sau đó mang đi phân tích hàm lượng protein bằng thiết bị đo UV-vis minil1240.
- Tính kết quả:
Kết quả đo được tính tương ứng với giá trị y (OD 325 nm), dựa vào phương trình đường chuẩn tính ra được hàm lượng protein có trong 1 ml dịch.
Trong đó:
V: Thể tích mẫu sau khi pha loãng (ml) C: Hàm lượng protein trong 1ml (mg/ml) M: Khối lượng mẫu mang đi ủ (gam) Mc: Độ ẩm của mẫu mang đi phân tích (%) - Phương pháp xử lý số liệu:
Các số liệu được xử lý theo phần mềm excel 2010 của hãng Microsoft, mỗi thí nghiêm bố trí song song 3 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình cộng 3 lần thí nghiệm.