Dụng cụ: Cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, pipet, bình tam giác, giấy lọc, phễu, máy khuấy từ, ống nghiệm, máy ổn nhiệt, máy đo UV-mini1240.
Hóa chất: Dung dịch BSA 1%, TCA 5%, acetic acid 0,04 M, phosphoric acid 0,04 M, NaOH, CuSO4, (NaCl 0,9%), nước cất.
- Xây dựng đường chuẩn BSA:
Hòa tan 4 mg BSA trong 4 mL nước cất và cho lần lượt các dung dịch vào trong ống nghiệm theo thứ tự như bảng dưới:
- Dung dịch thuốc thử
Dung dịch A: Hòa tan 4 g NaOH trong 10 ml nước cất. Dung dịch B: Hòa tan 40 mg CuSO4 trong 4 ml nước cất.
Trộn dung dịch B vào A, sau đó thêm nước cất rồi định mức lên 15 ml.
Chú ý: Dung dịch thuốc thử được giữ trong chai sẫm màu và được bảo quản lạnh ở 4 ºC. Dựng đường chuẩn nồng độ BSA bằng phương pháp đo ở A280:
Bảng 2.3 Dựng đường chuẩn nồng độ BSA bằng phương pháp A280 Ống C (mg/ml) mL "dd B" mL (BSA, 1mg/ml) mg protein A280 0 0,0 3,0 0,0 1 0,01 2,97 0,03 2 0,02 2,94 0,06 3 0,04 2,88 0,12 4 0,08 2,76 0,24 5 0,16 2,52 0,48 6 0,32 2,04 0,96 7 0,667 1 2 Sau đó vortex đồng hóa mẫu, rồi mang đi đo OD ở bước sóng 280 nm.
- Bước 1: Pha BSA 10 mg/mL bằng dung dịch A và ủ trong bể ổn nhiệt ở 30 0C (chú ý phải tính toán thể tích phù hợp cho nhiều mẫu).
- Bước 2: Cho 0,1 ml enzyme vào mỗi ống phản ứng (phải biết trước nồng độ từ trước). Chú ý enzyme được hoà tan bằng dung dịch B với thể tích phù hợp, rồi đi đo nồng độ. Nếu nồng độ cao, thì pha loãng để đi thuỷ phân.
-.Bước 3: Cho 0,9 ml của BSA (10mg/mL) vào ống "enzyme - cơ chất", ủ 10 phút trong 30 °C.
- Bước 4: Thêm 1 ml 10% TCA (phải chuẩn bị trước) vào ống enzyme - cơ chất và ống đối chứng.
- Bước 5: Cho 0,9 ml của 1% BSA vào ống "đối chứng".
- Bước 6: Lấy ra hết để ở nhiệt độ phòng 20 phút. Rồi lấy cả 2 mẫu mang đi ly tâm ở 8000 x g trong 5 phút. (tách ra 2 tube 1 mL rồi lấy 0,75 mL mỗi ống).
- Bước 7: Lấy dịch nổi 1,5 ml từ trên xuống, cho vào ống 1,5 mL để bảo quản. Nếu chưa sử dụng ngay thì phải dùng parafilm bịt kín đầu tube để không bị bay hơi nước.
Đo nồng độ protein ở bước sóng A280
Điều kiện: Phải biết khối lượng phân tử của protein (KLPT) và thành phần amino acid của protein đó.
- Nồng độ protein được tính theo công thức sau:
Nồng độ (mg/ml) =
Trong đó:
A280: Giá trị OD đo được ở bước sóng 280 nm. KLPT: Khối lượng phân tử của BSA.
b: Bề dày của cuvette, thường là 1 cm.
ε280: Độ hấp thụ mol ở bước sóng 280 nm của protein đã biết, được tính theo công thức: ε 280= (số Trp x 5500) + (số Tyr x1490) + (số Cystine x125),
Trong đó: Trp: Tryptophane, Tyr: tyrosin, Cystine: liên kết của 2 cystein.
- Tiến hành: Lấy 0,5 mL dung dịch thuỷ phân sau khi li tâm cho vào 2,5 mL dung dịch C. Đo ở bước sóng 280 nm, thu được giá trị OD (A280). Tính toán nồng độ theo công thức trên và/hoặc tính theo đường chuẩn.
- Tính hoạt tính enzyme:
Sau khi có kết quả nồng độ của dịch thuỷ phân của 0,5 mL/từng thí nghiệm, ta tính trên lượng BSA (mg) bị dịch thuỷ phân trong 2 mL tổng khi đi phản ứng.