tieu luan hoạt tính kháng oxy hóa

Trong đề tài này, nghiên cứu được tiến hành chủ yếu dựa trên hoạt tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng để từ đó xác định được giá trị nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt k

KHOA: SAU ĐẠI HỌC



BÀI TIỂU LUẬN

KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHẾT SINH HỌC TỪ CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG

GVHD: TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo

TS Nguyễn Thế Hân Nhóm thực hiện: Nhóm 2 Lớp: CHTP2015

Nha Trang, tháng 10 năm 2015

DANH SÁCH HỌC VIÊN THỰC HIỆN TIỂU LUẬN

1 Nguyễn Trọng Hoành Phong 57CH057

2 Nguyễn Lê Thùy Linh

3 Nguyễn Thị Thanh Nguyệt

4 Nguyễn Thế Nguyên

MỤC LỤC

Ngày nay, ngành bào chế dược phẩm đã góp phần sản xuất ra hơn hàng trăm loại kháng sinh có mặt trên thị trường đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cho người, động vật (Nguyễn Thị Thanh và Hồ Huỳnh Quang Trí, 1995) Tuy kháng sinh tổng hợp có nhiều ưu điểm nhưng

nhược điểm của kháng sinh tổng hợp cũng không nhỏ như dễ lờn thuốc, phụ thuộc vào thuốc, nhiều tác dụng phụ không mong muốn khác (Ngô Thế Hùng, 1985) Bên cạnh đó,

sự phát triển của khoa học ngày nay đã giúp các nhà khoa học phát hiện ra nhiều tác dụng phụ có hại của kháng sinh tổng hợp hóa học Từ đó, con người muốn trở lại với tự nhiên,

để phát hiện và sử dụng các cây cỏ có nguồn gốc tự nhiên Hiện nay, xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu tự nhiên đang được ưa chuộng vì tính an toàn, có thể sử dụng lâu dài, hạn chế tác dụng phụ khi sử dụng thuốc tổng hợp hóa học: hạn chế hiện tượng lờn thuốc, kháng kháng sinh (Hoàng Hiệp, 2011) Các dược liệu có công dụng

trị liệu như Actiso (Cynara scolymus), Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr), Vọng

cách (Premma integrifolia L.), Nhân trần (Adenosma glutinosum), Diệp hạ châu đắng

(Phyllanthus amarus Schum et Thonn.,) Trong đó, cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) chứa nhiều chất chống oxy hóa thuộc nhóm xanthones có tác dụng ức chế mạnh

quá trình peroxyd hóa lipid ở tế bào gan, do đó hạn chế hiện tượng viêm và hoại tử gan, bảo vệ và phục hồi tế bào gan (Hoàng Hiệp 2011) Ngoài ra, Diệp hạ châu đắng

(Phyllanthus amarus) có tác dụng kháng khuẩn trên nhiều loại vi khuẩn (Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Shigella flexerneri, Shigella shiga, Bacillus subtilis,…)

(Akinjogunla và ctv, 2010; ETTA và ctv, 2011), chống nhiễm trùng máu

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Giới thiệu về cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)

1.1 Vị trí phân loại

Theo Đỗ Huy Bích và ctv (2004), Phyllanthus thuộc họ thầu dầu Tên khoa học:

Phyllanthus amarus Tên thường gọi: cây chó đẻ, diệp hạ châu, rút đất, cam kiềm, trân

châu thảo, diệp hòe thái, lào nha châu

mùa hoa: tháng 4 – 6, mùa quả: tháng 7 – 9 Chi Phyllanthus L có nhiều loài phân bố

chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở Việt Nam, chi này có khoảng 40 loài, trong

đó đáng chú ý là hai loài P urinaria và P amarus có hình dáng gần giống nhau nhưng P amarus thân có màu xanh, quả nang nhẵn, có tên gọi là Diệp hạ châu đắng, còn P urinaria thân có màu đỏ, quả nang có gai, có tên gọi là diệp hạ châu ngọt hay cây chó đẻ

răng cưa.Cả hai loài này mọc rải rác ở khắp nơi, phân bố khắp các vùng nhiệt đới Ở Việt Nam, cây mọc hoang trên đất ẩm, ở khắp các địa phương trừ vùng núi cao, lạnh Diệp hạ châu đắng là cây ưa ẩm, ưa sáng và hơi chịu bóng, thường mọc lẫn trong các bầu cỏ, ruộng cao, nương rẫy và vườn nhà, Cây non mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh vào mùa hè và tàn lụi vào giữa mùa thu nên cây thường được thu hái vào cuối mùa

hè vì trong thời gian này cây đã sinh trưởng, phát triển đầy đủ và chứa lượng hoạt chất cao nhất (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)

Hình 1 Cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)

(a)Cây Diệp hạ châu đắng, (b) Quả, (c) Thân, (d) Rễ

1.3 Tính chất

Vị đắng, tính lạnh, lợi tiểu, tiêu độc, tán ứ, thông huyết và sát trùng (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004) Bộ phận dùng là toàn cây, rửa sạch dùng tươi hay phơi sấy khô

1.4 Thành phần hóa học

Theo Đỗ Huy Bích và ctv (2004), Phyllanthus chứa nhiều chất thuộc các nhóm hóa học:

- Triterpen (Stigmasterol, stigmasterol – 3 – 0 – beta glucosid, beta – sitosterol, beta –

sitosterol glucosid, lup – 20 – en – 3 beta – ol), flavonoid (Kaempferol, quercetin, rutin), tanin (Acid elagic, acid 3, 3’, 4 – tri – methyl elagic, acid galic), phenol, acid hữu cơ (Acid succinic, acid ferulic, acid dotriacontanoic), lignan (Phyllanthin, Hypophyllanthin)

- Các thành phần khác: N - octadecan, acid dehydrochebulic methyl ester, triaontanolphylanthurinol acton

Lá diệp hạ châu đắng chứa chất đắng không có quinin hoặc alkaloid, lá khô chứa các chất đắng Hypophyllanthin (0,05 %) và Phyllanthin (0,35 %), các chất này gây độc đối với cá và ếch Trong cây có niranthin, nirtetralin, phylteralin, quercetin, niruroidin, isobubialin, epibubialin, isoquercitrin, astragalin, rutin và các acid hữu cơ (ascorbic, geraniinic, amariinic, phenolic và repandusinic)

1.4.1 Phyllanthin

Công thức hóa học: C24H34O6

Trọng lượng phân tử: 418,52316 g/mol

Hình 2 Cấu trúc của Phyllanthin

(Vandana và ctv, 2008)Phyllanthin cho tinh thể hình kim khi kết tinh trong dầu hỏa, tan nhiều trong hexan, etylacetat, methanol, sắc ký lớp mỏng trên bản silicagel 60 F254 Merck, dung môi động

hexan – etylacetat (2:1) hiện màu bằng H2SO4 10 % trong methanol khi hơ nóng hiện rõ một vết tròn có màu xanh dương nhạt, Rf = 0,35 (Nguyễn Thanh Hồng và ctv, 2002).

1.4.2 Hypophyllanthin

Công thức hóa học: C24H30O7

Trọng lượng phân tử: 430,4908 g/mol

Hình 3 Cấu trúc của Hypophyllanthin

(Vandana và ctv, 2008)

Hypophyllanthin kết tinh trong dầu hỏa hoặc hexan được tinh thể hình kim dài, tan nhiều trong hexan, etylacetat Sắc ký lớp mỏng trên bản silicagel 60 F254 Merck, dung môi động hexan – etylacetat (2:1) hiện màu bằng H2SO4 10 % trong methanol, khi hơ nóng hiện rõ một vết tròn, có màu xanh dương đậm Rf = 0,4 (Nguyễn Thanh Hồng và ctv, 2002)

1.5 Tác dụng dược lý

Diệp hạ châu đắng đã được chứng minh có rất nhiều tác dụng dược lý Theo Đỗ Huy Bích và ctv (2004), Diệp hạ châu đắng có tác dụng trong điều trị tiêu chảy và rối loạn tiêu hóa do làm giảm nhu động ruột, có tác dụng lợi tiểu và điều trị bệnh tiết niệu, giúp hạ đường huyết (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004) Bên cạnh đó, Diệp hạ châu đắng còn được sử

dụng trong điều trị tiêu chảy và rối loạn tiêu hóa do làm giảm nhu động ruột, có tác dụng lợi tiểu và điều trị bệnh tiết niệu, giúp hạ đường huyết

Nước sắc của Diệp hạ châu đắng có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn Gram âm và

Gram dương như Escherichia coli (Akinjogunla và ctv, 2010), Staphylococcus aureus (ETTA và ctv, 2011) , Salmonella typhi (Flora và Folasade, 2008), Shigella flexerneri, Shigella shiga, Baccillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp (Adegoke và ctv, 2010) Chất kháng khuẩn tan nhiều trong ether dầu hỏa, ether ethylic, methanol

(Nguyễn Thị Hồng và ctv, 2002) Phân đoạn chiết với butanol có hoạt tính bảo vệ gan cao nhất, liều uống 50 mg/kg P có tác dụng bảo vệ 35 – 85 %, phân đoạn chiết với nước có tác dụng bảo vệ gan nhẹ 20 – 40 %

Từ Tích Tổ (2008) cho rằng trong Diệp hạ châu đắng có các thành phần: flavonoid, alkaloid và các hợp chất phyllanthin, hypophyllathin, niranthin, phylteralin có tác dụng ức chế mạnh virus gây viêm gan (HBV) Diệp hạ châu đắng ức chế virus viên gan thông qua việc ức chế enzyme DNA polymerase của HBV từ đó ức chế sự sao chép tế bào của virus viêm gan, làm cho virus không nhân lên được và bị đào thải do không bám vào được DNA, làm giảm hoạt độ của HBsAg và anti-HBs, giúp phục hồi enzyme transminase từ

50 – 97 %, Bilirubin trở về bình thường (trích dẫn bởi Trần Thị Nhã Thi, 2011) Bên cạnh

đó, Phyllanthin và Hypophyllanthin còn có tác dụng bảo vệ tế bào gan chuột cống chống tính độc hại tế bào gây bởi carbon tetrachlorid và galactosamin Triterpentriacontanol trong Diệp hạ châu đắng có tác dụng bảo vệ gan chống lại tính độc hại tế bào gây bởi galactosamin Acid galic chứa trong cây có tác dụng kháng khuẩn yếu nhưng phenolic và flavonoid có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm mạnh hơn (Đỗ Huy Bích và ctv 2004).Vậy, diệp hạ châu đắng có tác dụng dược lý trên hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu, hệ sinh dục… nhưng tác động rõ rệt nhất là trên gan Trong đề tài này, nghiên cứu được tiến hành chủ yếu dựa trên hoạt tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng để từ đó xác định được giá trị nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của cao thô đã điều chế được

2 Sơ lược về chiết suất các hợp chất thiên nhiên

Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), chiết suất là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu Phương pháp cổ điển li trích một hợp chất thiên nhiên là dùng một dãy dung môi bắt đầu từ không phân cực đến phân cực mạnh để li trích, phân đoạn các hợp chất ra khỏi hợp chất thiên nhiên Cách li trích thông dụng là li trích nóng bằng máy li trích liên tục hoặc li trích hồi lưu Sau mỗi lần li trích với một loại dung môi cần làm khô hợp chất thiên nhiên rồi mới tiếp tục li trích với loại dung môi tiếp theo Mỗi phân đoạn li trích, cất thu hồi dung môi và tiến hành phân tích riêng

Nguyên tắc chiết suất: phương pháp chiết xuất là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và cách chiết Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn li trích

Dung môi để chiết suất các hợp chất: tính trung tính, không độc, không quá dễ gây cháy, hòa tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi tách chiết dung môi đó có thể được loại

bỏ dễ dàng, cần tránh các dung môi độc như benzen hoặc dễ cháy như dietyl eter do có nhiệt độ sôi thấp Người ta thường sử dụng các dung môi không hòa tan trong nước như hydrocacbon (hexan, toluen), alcol (butanol), ceton (metyl etyl ceton), acetat (etyl, butyl) Các dung môi này tương đối rẻ tiền, có bán sẵn, độ nhớt thấp, tỉ trọng tương đối cao so với nước

Các phương pháp chiết suất hợp chất thiên nhiên: có hai phương pháp thường sử dụng

để chiết suất là chiết ở nhiệt độ thường (chiết lạnh) và chiết nóng, mỗi phương pháp chiết

có dung môi và thiết bị chiết khác nhau Phương pháp chiết lạnh là phương pháp chiết ở nhiệt độ phòng (27 – 30 oC) trong thời gian 10 – 15 ngày và được áp dụng với đa số dược liệu Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, không cần máy móc phức tạp và thường được dùng trong điều chế cao thô do hạn chế được tác dụng của nhiệt độ tới hoạt chất trong dược liệu Khác với phương pháp chiết lạnh, phương pháp chiết nóng là phương pháp chiết ở nhiệt độ 60 – 100 oC trong thời gian 7 – 10 ngày và thường áp dụng cho các

dược liệu có cấu tạo rắn chắc, khó chiết xuất và có khả năng chịu nhiệt (Phạm Ngọc Bùng

và Nguyễn Thị Nga, 2004)

Chiết suất hợp chất trong Diệp hạ châu đắng: khi cần chiết lấy toàn bộ hoạt chất trong Diệp hạ châu đắng thì dạng thuốc điều chế thích hợp là cao thô Cao thô có đặc điểm là đã loại bỏ được một phần hoặc hoàn toàn các tạp chất (chất béo, nhựa, protein…) và tỷ lệ hoạt chất trong cao thô có thể bằng (cao lỏng) hoặc thường cao hơn (cao đặc, cao khô) tỷ

lệ hoạt chất trong Diệp hạ châu đắng (Phạm Ngọc Bùng và ctv, 2004)

3 Sơ lược về các nhóm vi khuẩn liên quan đến nghiên cứu

3.1 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là vi khuẩn hình cầu, Gram dương, kị khí tuỳ tiện, không di

động, không sinh bào tử và có vỏ nhầy Theo hội nghị quốc tế về xếp loại Micrococcus thì

giống Staphylococcus bao gồm 3 loài Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis

và Staphylococcus saphilophyticus Staphylococcus aureus nuôi cấy trên môi trường

thạch trong điều kiện kỵ khí, nhiệt độ thích hợp 37 oC, chịu được nhiệt độ từ 4 – 40 oC, ở môi trường lỏng, sau khi nuôi cấy 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ,

tạo mùi thối và có nhiều hạt lắng xuống đáy Trong môi trường đặc, S aureus tạo khuẩn

lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh có màu vàng, có thể phát triển tốt ở môi trường tổng

hợp đặc biệt đặc biệt ở môi trường thạch máu hoặc huyết thanh Staphylococcus aureus sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu, indol (+), NH3 (+), thủy phân gelatine (+), đông huyết tương (Wladimir và ctv, 2000; Nguyễn Thị Chính và Trương Thị

Hòa, 2005) Staphylococcus aureus kháng với penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được men penicillinase, kháng MRSA (Methicillin resistant Staphylococcus aureus) do tạo ra một loại protein gắn vào thụ thể hoạt động của methicillin, tỉ lệ S aureus kháng methicillin lên trên 50 % S aureus kháng thuốc cao với penicillin (89,4 %) (Frank và

Henry, 2009), tertracycline (82,4 %), trimethoprin + sulfamethazin (80,6 %), chloramphe – nicol (64,8 %), erythomycin (38,4 %) và methicillin (25,9 %) Các chủng

Staphyloccoccus aureus có tỷ lệ đề kháng cao với ampicillin, co-trimoxazol,

erythromycin, lincomycin (từ 50 – 80 %) và những kháng sinh có hoạt lực mạnh như ceftriazon, ciprofloxacin thì bắt đầu bị vi khuẩn này kháng lại (Nguyễn Bữu Châu, 2007)

Staphylococcus aureus gây bệnh đi kèm với các triệu chứng sốt, nổi ban, nôn ói, tiêu

chảy, hạ huyết áp, tiến triển nhanh suy đa cơ quan, luôn có biểu hiện ở gan với các triệu chứng vàng da, tăng men gan (Phạm Thị Thu Thủy, 2005)

NaCl 0,5 %, pepton 1 %, cao nấm 1 %, cao thịt 0,3 %, agar 0,7 %, pH = 7, nhiệt độ 30 –

39 oC, nhưng phát triển tốt ở 37 oC (Trần Thị Ánh Nguyệt, 2010) Các đặc tính sinh hóa

của Bacillus subtilis: hoạt tính catalase, phản ứng Methyl Red (+), phản ứng Voges

Proskauer (+), khử Nitrate (+), phân giải tinh bột (+), có khả năng tiết cellulase, amylase,

và caseinase Bacillus subtilis được ứng dụng trong việc sử dụng để sản xuất probiotic vì

chúng có thể tiết ra các enzyme ngoại bào giúp cải thiện tiêu hóa, ứng dụng trong xử lý nước thải, sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống, công nghệ lên men, sinh học phân

tử, y – dược học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm, thu hồi bạc từ các phế liệu (Ngô

Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà, 2009) Bacillus subtilis có khả năng kháng kanamycin,

phleomycin (Zofia, 2004), streptomycin, ampicillin, penicillin, erythromycin, amoxycillin, bacitracin (Hemalatha và Shanthi, 2010)

3.3 Streptococcus pyogenes

Streptococcus pyogenes (vi khuẩn liên cầu nhóm A) thuộc giống Streptococcus, dựa vào giải mã trình tự protein M, Streptococcus pyogenes phân loại hơn 100 loài Streptococcus pyogenes là vi khuẩn Gram dương, không di động, kích thước 0,6 – 1 µm,

vi khuẩn yếm khí tùy nghi, phát triển trong môi trường chứa máu, có khả năng làm tan huyết, phát triển tốt trong điều kiện môi trường 37 – 39 oC Streptococcus pyogenes được

nuôi cấy trong môi trường thạch có chứa máu, ủ qua đêm ở 37 oC vi khuẩn phát triển sẽ

làm tan huyết tạo vòng trong suốt xung quanh (Tara, 2010) Streptococcus pyogenes

kháng macrolid, sulfornamid, streptogramin B với tỷ lệ 70 %; clindamycin (58 %) và

erythromycin (56 %) (Nevial, 2009) Streptococcus pyogenes là một trong số các chủng vi

khuẩn gây bệnh trên người: ban đỏ, viêm Amidan, bệnh chốc lở, viêm quầng, sốt thấp khớp, gây bệnh ở phụ nữ thời kỳ sinh (Tara, 2010)

3.4 Salmonella typhimurium

Salmonella typhimurium là một trong số các serotype thuộc giống Salmonella Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, được Salmon và Smith tìm ra năm 1885, lấy tên Salmon đặt tên cho vi khuẩn Salmonella typhimurium là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí

tuỳ nghi, có tiêm mao di động, không tạo bào tử, có kích thước khoảng 2 – 3 × 0,4 – 0,6

μm (Võ Thị Hoàng Mi, 2005) Salmonella typhimurium phát triển tốt ở nhiệt độ 6 – 42 oC, nhiệt độ thích hợp 35 – 37 oC, pH = 6 – 9, thích hợp nhất ở pH = 7,2 và được nuôi cấy dễ

dàng trong môi trường dinh dưỡng đơn giản, đầy đủ chất dinh dưỡng Salmonella typhimurium kháng các loại kháng sinh với tỉ lệ cao trên 50 % đối với: tetracycline (84,7

%), sulfonamide (88,1 %), chloramfenicol (83 %), ampicilline (86,4 %), streptomycine

(91,5 %) (Phùng Quốc Chương, 2002; Sisak và ctv, 2006) Salmonella typhimurium gây

các bệnh liên quan đến gan viêm gan cấp tính, gan to nhẹ, Bilirubin tăng nhẹ đến trung bình (16 % các trường hợp), men gan tăng trong 60 % các trường hợp (Nguyễn Thị Nguyệt và ctv, 2010)

3.5 Shigella flexerneri

Shigella flexerneri thuộc giống Shigella, họ Enterobacteriaceae, dựa vào đặc điểm kháng nguyên thân O và các đặc tính sinh hóa người ta chia Shigella flexerneri ra làm 4

nhóm chính: A, B, C, D; ngoài ra còn có kháng nguyên K; mỗi nhóm có nhiều kiểu huyết

thanh Shigella flexerneri có dạng hình que thẳng dài, kích thước từ 1 – 3 µm, không có

lông, không di động, không sinh bào tử, Gram âm, vi khuẩn hiếu kị khí tùy tiện nhưng

phát triển rất tốt trong điều kiện kị khí Shigella flexerneri được nuôi cấy trong điều kiện

hiếu khí hoặc kị khí, có thể phát triển trong điều kiện nhiệt độ từ 8 – 40 oC, pH = 6 – 8,8

và phát triển tốt nhất trong điều kiện 37 oC, pH = 7 – 8 Shigella flexerneri gây nhiễm

trùng đường ruột dẫn đến viêm gan ứ mật, các biến đổi mô học ở gan bao gồm: thấm nhiễm tế bào đa nhân ở cửa gan và xung quanh bị hoại tử và ứ mật (Phạm Thị Thu Thủy,

2005) Shigella flexerneri có khả năng kháng nalidixic acid (59,6 %), tetracycline (78%),

ampicillin (74%), cotrimoxazole (71 %), và chloramphenicol (69 %) (Oelia và ctv, 2005)

4 Sơ lược về sắc ký

4.1 Đại cương về sắc ký

Sắc ký là phương pháp vật lý dùng để tách hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: pha tĩnh và pha động) Việc tách hai pha nào đó

ra riêng có đạt kết quả tốt hay không là tùy thuộc vào hệ số phân chia Bất kỳ một hợp chất nào khi đặt vào một hệ thống gồm có hai pha, lúc đạt đến trạng thái cân bằng hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỉ lệ nồng độ nhất định, tỉ lệ này thay đổi tùy thuộc vào các tính chất động học của hợp chất và cả hai pha Cũng tương tự một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất khác nhau khi được đặt vào hệ thống có hai pha, mỗi loại hợp chất sẽ có ái lực riêng của nó đối với mỗi pha, vì thế sẽ có tương tác mạnh/ yếu khác nhau đối với pha tĩnh Kết quả là mỗi loại hợp chất sẽ di chuyển ngang pha tĩnh với vận tốc khác nhau, nhờ vậy kỹ thuật sắc ký có thể tách riêng các loại hợp chất (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

4.2 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC- Hight-Performance Liquid Chromatography)

Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007): sắc lý lỏng cao áp, hay sắc ký lỏng hiệu quả cao (HPLC- Hight-Performance Liquid Chromatography) HPLC là chữ viết tắt của bốn chữ cái đầu bằng tiếng anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight – Performance Liquid Chromatography) mà trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) HPLC phát triển rất nhanh từ năm 1969 HPLC có khả năng phân tách các hợp chất đặc thù như: các hợp chất cao phân tử và ion, các hợp chất tự nhiên không bền, các hợp chất kém bền nhiệt, các hợp chất dễ nổ

Khái niệm: HPLC là một phương pháp phân tách trong đó pha động là chất lỏng, pha tĩnh là chất rắn được chứa trong một cột, chất rắn này đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi

bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử).

Các bộ phận của máy HPLC:

Bình chứa dung môi giải ly cột: hệ dung môi giải ly cột được hút ra từ hai bình chứa dung môi Bình được làm bằng chất liệu trơ, thường là bằng thủy tinh Bình luôn luôn có một cái nắp bảo vệ để chống không cho bụi rơi vào trong bình, nắp có lỗ hở để bình luôn thông với khí trời Trong bình, có một ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc ký, ở đầu này có gắn một nút lọc bằng kim loại với mục đích lọc dung môi và cũng để giữ ống luôn

ở dưới mặt thoáng của chất lỏng Các nhà sản xuất có những bình chuyên dùng để cho nút lọc bằng kim loại nói trên lọt vào một lỗ giếng, bảo đảm đầu ống luôn chạm sát đáy bình,

có thể sử dụng đến giọt dung môi cuối cùng trong bình Trước khi lắp một bình dung môi vào vị trí hoạt động, cần phải loại bỏ phần không khí đã hoà tan vào dung môi trước đó, gọi là khử bọt khí (degassing), bởi vì nếu còn lẫn những bọt không khí vào trong luồng dung môi đi vào máy sẽ làm cho máy bơm và đầu dò hoạt động kém hiệu quả

Dung môi dùng cho HPLC: máy HPLC thường sử dụng hồn hợp hai loại dung môi, tuy vậy cũng có những nghiên cứu sử dụng bốn loại dung môi, trong trường hợp này, cần có thêm thiết bị phụ trợ thích hợp có bán sẵn Tỉ lệ của mỗi dung môi trong hỗn hợp được điều khiển bằng hệ thống điều khiển Máy bơm hút hai dung môi trong hai bình đưa vào hộp phối trộn Tất cả các dung môi phải có độ tinh khiết cao đạt tiêu chuẩn HPLC không

có lẫn bụi bẩn, trước khi gắn vào máy HPLC dung môi phải được khử không khí

Máy bơm: loại máy bơm của HPLC là loại bơm đặt biệt với áp suất rất cao lên đến

7000 psi (48,3 MPa) Bơm được cấu tạo bằng chất liệu để chịu đựng được dung môi hữu cơ

Cột sắc kí: cột HPLC được làm bằng thép không gỉ, thường dài 10 – 25 cm và có đường kính bên trong 2,1 – 4,6 mm cột được nhồi thật chặt bởi những hạt nhỏ

Bộ phận trích mẫu vào máy: máy HPLC có hệ thống trích mẫu đặc biệt: ống chứa mẫu giúp định hướng dòng chảy của pha động chỉ có thể đi trên một trong hai con đường khác nhau Mẫu khảo sát được tiêm vào máy nhờ một kim tiêm

Các phương pháp nâng cao độ phân giải trong HPLC: tăng chiều dài của cột, giảm đường kính của cột, giảm lưu lượng pha động, pha tĩnh (vật liệu nhồi cột) đồng nhất

giảm thể tích bơm mẫu, lựa chọn pha tĩnh sạch hơn, lựa chọn pha động tinh khiết hơn, sử dụng áp suất ổn định hơn

5 Sơ lược về các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn

Một số phương pháp thường được sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn của một

số hợp chất như: phương pháp khuếch tán trên thạch (Antibiotic Disc Diffusion Method)

và phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng Trong đó phương pháp khuếch tán trên thạch thông dụng hơn (Attur và ctv, 2005)

5.1 Phương pháp khuếch tán trên thạch

Nguyên tắc: hợp chất có tính kháng khuẩn được tẩm vào các đĩa giấy (ϕ = 2 mm) tiệt trùng với hàm lượng nhất định Khi đĩa giấy được đặt lên bề mặt môi trường thạch đĩa đặc biệt, hợp chất có tính kháng khuẩn sẽ khuếch tán ra xung quanh và ngăn cản không cho vi sinh vật mọc lên, tạo nên vòng vô khuẩn (trong trường hợp vi sinh vật bị tác động bởi hợp chất có tính kháng khuẩn được thử) (Attur và ctv, 2005) Phương pháp sử dụng môi trường mà hầu hết các vi sinh vật phát triển được và hợp chất có tính kháng khuẩn có thể

dễ dàng khuếch tán ra môi trường: Mueller Hinton Agar (John và ctv, 2011), Tryticase – Soy – Agar (Nguyễn Ngọc Hải và Nguyễn Thị Kim Loan, 2009), Nutrient Agar (Flora và Folasade, 2008) Đánh giá kết quả dựa trên việc đo đường kính vòng vô khuẩn (phạm vi

vi khuẩn không mọc được xung quanh đĩa tẩm giấy có chứa hợp chất kháng khuẩn) xuất hiện trên đĩa

5.2 Phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng

Van nhiều cổng

Hình 4 Sơ đồ mô tả tổng quát các bộ phận của máy HPLC

Hệ thống điều khiển

Bình chứa dung môi

Van 2 cổng

Máy bơm

Hộp trộn dung môi

Cột bảo vệ

Cột sắc ký

Theo Adegoke và ctv (2010): phương pháp này được sử dụng để xác định sự nhạy cảm của vi sinh vật đối với các loại hợp chất có tính kháng khuẩn, bên cạnh đó giúp xác định được giá trị MIC, MBC của một hợp chất có tính kháng khuẩn đối với từng loại vi khuẩn Môi trường sử dụng: môi trường canh dinh dưỡng Nutrient Broth (Adegoke và ctv, 2010) hoặc môi trường Brain Heat Infusion (Rashmi, 2012) Kết quả được đánh giá dựa trên sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường Ghi nhân độ pha loãng hợp chất kháng khuẩn cao nhất mà ở đó vi khuẩn không mọc để xác định giá trị MIC.

5.3 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)

MIC – nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ tối thiểu có thể ức chế 99 % sự phát triển của một loại vi khuẩn nhất định trong điều kiện nuôi cấy ở 37 oC trong 24 giờ (Ansari và ctv, 2011; Chen, 2011) MBC – nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là nồng độ tối thiểu có thể diệt 99,9 % vi khuẩn (Ansari và ctv, 2011; Chen, 2011)

Trong đề tài này, phương pháp pha loãng trong môi trường MHA, BHI trên microplate

96 giếng (Chen, 2011) được sử dụng để xác định MIC và MBC của cao thô Diệp hạ châu đắng trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm

PHẦN 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Vi khuẩn dùng trong thí nghiệm

Các chủng vi khuẩn thuộc bộ sưu tập vi khuẩn của Mỹ ATCC (American Type Culture Collection) được mua và bảo quản tại Bệnh xá Thú Y – trường Đại học Nông Lâm – Thành phố Hồ Chí Minh

(1)Staphylococcus aureus ATCC

(2)Bacillus subtilis ATCC

(3)Streptococcus pyogenes ATCC

(4)Salmonella typhimurium ATCC

(5)Shigella flexerneri ATCC

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng

Điều chế dịch chiết: dung môi có thể là cồn methanol hoặc ethanol 80 – 100 % Tuy nhiên, cồn methanol được sử dụng thường xuyên hơn vì nó được xem là dung môi vạn năng, nó hòa tan được các chất không phân cực và có khả năng tạo liên kết hydro với các nhóm phân cực (Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985) Ngoài ra, cồn methanol rẻ hơn cồn ethanol, nhiệt độ sôi của cồn methanol (65 oC) thấp hơn cồn ethanol (78 oC) nên dịch chiết cồn methanol khi cô quay sẽ bay hơi nhanh hơn cồn ethanol và thu được cao thô toàn phần chứa hầu hết hợp chất của Diệp hạ châu đắng Chính vì những lý do trên, chúng tôi sử dụng cồn methanol để chiết xuất Diệp hạ châu đắng Bên cạnh những ưu điểm trên, methanol lại có nhược điểm là gây ngộ độc khi ăn phải với hàm lượng nhất định hoặc hàm lượng rất ít trong thời gian dài nên để tránh tình trạng này tiến hành cô quay cao đến khi đặc cứng và để cao ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 ngày để loại hết hoàn toàn dung môi methanol (Trần Thị Nhã Thi, 2011)

Đối tượng khảo sát: Diệp hạ châu đắng được thu vào buổi sáng từ 7 – 9 giờ, không thu cây còn non hay quá già vì cây non hay quá già lượng hoạt chất chứa trong cây ít làm ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất và hiệu quả điều trị Sau khi thu mẫu, loại sạch đất, những dược liệu bị sâu, nấm ký sinh và những tạp chất khác, cuối cùng đem điều chế thành cao đặc diệp hạ châu đắng Bộ phận dùng: rễ, thân và lá để thực hiện tách chiết được sấy khô

Phương pháp điều chế: mẫu tươi toàn cây Diệp hạ châu đắng (rễ, thân và lá) sau khi thu hái, làm sạch, chọn lọc, rồi cắt nhỏ và đem sấy ở 55 oC đến khi trọng lượng không thay đổi Sau đó đem nghiền nhỏ rồi ngâm trong cồn methanol 99,5 % trong thời gian 72 giờ, lọc lấy dịch chiết và tiếp tục ngâm chiết với methanol trong 48 giờ tiếp theo và lọc lấy dịch chiết 24 giờ/ lần/ lọc Các dịch chiết sau khi lọc được trữ lạnh ở 0 – 4 oC Loại dung môi trong dịch chiết bằng máy cô quay cho đến khi đạt độ cắn, cuối cùng thu được