nghiên cứu khả năng sử dụng cám gạo thủy phân trong nuôi cấy nấm men yarrowia lipolytica po1g

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG CÁM GẠO THỦY PHÂN TRONG NUÔI CẤY NẤM MEN YARROWIA LIPOLYTICA PO1G CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS Hồ Quốc Phong Ngô Tường Vi MSSV: 2096802 Ngành: Công Nghệ Hóa Học - Khóa 35 Tháng 5/2013 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc KHOA CÔNG NGHỆ Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2013 PHIẾU ĐỀ NGHỊ ĐỀ TÀI TỐT NGHIỆP CHO SINH VIÊN NĂM HỌC: 2012 – 2013 Họ tên cán hƣớng dẫn: TS Hồ Quốc Phong Tên đề tài: Nghiên cứu khả sử dụng cám gạo thủy phân nuôi cấy nấm men Yarrowia lipolytica Po1g Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Công nghệ Hoá học, Khoa Công nghệ, Trƣờng Đại Học Cần Thơ Sinh viên thực hiện: Ngô Tƣờng Vi MSSV: 2096802 Mục đích đề tài: Khảo sát khả sử dụng cám gạo thủy phân nuôi cấy Y lipolytica Po1g để sản xuất chất béo phục vụ cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học Nội dung Phần I: Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến trình thủy phân cám gạo (nồng độ, tỉ lệ, thời gian, nhiệt độ) Phần II: Nuôi cấy nấm men Yarrowia lipolytica Po1g + Khảo sát ảnh hƣởng thời gian lên phát triển sinh khối nấm men + Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ đƣờng đến phát triển nấm men + Phân tích thành phần acid béo từ lipid thu đƣợc Các yêu cầu hỗ trợ: kinh phí, hoá chất dụng cụ thí nghiệm Kinh phí dự trù thực đề tài (dự trù chi tiết đính kèm): 1.000.000 đồng DUYỆT CỦA BỘ MÔN CÁN BỘ RA ĐỀ TÀI DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG THI & XÉT TỐT NGHIỆP PHIẾU NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN - PHIẾU NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN - LỜI CẢM ƠN Luận văn tốt nghiệp đánh dấu kiến thức, kĩ sinh viên trƣớc tốt nghiệp Chính tầm quan trọng mà suốt trình làm luận văn gặp nhiều áp lực trở ngại Nhƣng giúp đỡ, ủng hộ thầy cô, gia đình, bạn bè, hoàn thành đƣợc luận văn Xin cảm ơn quí Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Hóa học, Khoa Công nghệ, Đại học Cần Thơ dạy, nhƣ tạo điều kiện cho hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Hồ Quốc Phong, Phó Trƣởng Bộ môn Công nghệ hóa học, Khoa Công nghệ, Đại học Cần Thơ Thầy cho hội nghiên cứu khoa học, đặc biệt gợi ý đề tài luận văn cho Không vậy, Thầy nhiệt tình hƣớng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm cho suốt trình làm luận văn Xin cảm ơn TS Huỳnh Liên Hƣơng, Trƣởng PTN Công nghệ Hóa học tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn kiến thức chuyên môn cho suốt thời gian nghiên cứu Đồng gửi lời cảm ơn đến ThS Nguyễn Thị Vân, Trƣởng PTN Sinh Kỹ thuật môi trƣờng, Khoa Môi trƣờng Tài nguyên thiên dẫn, hỗ trợ thiết bị hóa chất vi sinh giúp hoàn thành đề tài cách thuận lợi Tôi cảm thấy vui mừng bên cạnh có ngƣời bạn quan tâm, động viên lúc thất bại Xin cảm ơn học viên Cao học: Lê Trang Nguyên Thƣ, Trƣơng Thị Cẩm Tú, bạn PTN Công nghệ Hóa học Đặc biệt, cảm ơn bạn Võ Trƣờng Giang chia sẻ kinh nghiệm, kiến thức giúp hoàn thành tốt luận văn Cảm ơn Cha Mẹ bên con, cổ vũ, động viên lúc khó khăn Xin cảm ơn tất ngƣời! Sinh viên Ngô Tƣờng Vi SVTH: Ngô Tƣờng Vi i TÓM TẮT Mục đích nghiên cứu đánh giá khả sản xuất dầu từ Yarrowia lipolytica Po1g phát triển môi trƣờng Cám gạo tách béo (CGTB) thủy phân CGTB đƣợc cung cấp từ nhà máy, sau thủy phân với acid nồng độ khác (0 - 5% w/w), thời gian phản ứng (2 - h), nhiệt độ phản ứng (60 - 90 °C) tỉ lệ DDA/CGTB khảo sát 5, 8, 10, 15 mL/g Kết cho thấy nồng độ đƣờng tổng (NĐĐT) tăng tỉ lệ thuận với nồng độ acid, thời gian, nhiệt độ thủy phân Điều kiện tối ƣu khảo sát đƣợc cho nồng độ đƣờng tổng tối đa acid sulfuric 4% 90 °C h, tỉ lệ DDA/CGTB mL/g NĐĐT từ trình thủy phân cám gạo tách béo đạt đƣợc 57.43 ± 1.10 g/L Sản phẩm cám gạo tách béo thủy phân sau đƣợc khử độc Ca(OH)2 để giảm chất ức chế nhƣ 5-hydroxy methylfurfural (HMF) furfural, tăng tiềm nuôi cấy Y lipolytica Po1g Hơn trình khử độc vôi hóa không gây ảnh hƣởng nhiều đến hàm lƣợng đƣờng tổng Điều kiện tối ƣu trình nuôi cấy: thời gian nuôi cấy ngày, nồng độ đƣờng môi trƣờng nuôi cấy 30 g/L Khối lƣợng sinh khối thu đƣợc từ tế bào nấm Y lipolytica nuôi cấy môi trƣờng cám gạo tách béo thủy phân đạt 15.32 g/L Hàm lƣợng chất béo tƣơng ứng nuôi cấy nấm men môi trƣờng cám gạo tách béo với nồng độ 30 g/L 24.59% (88.64% lipid trung hòa) Vì chất béo từ tế bào nấm Y lipolytica Po1g đƣợc sử dụng làm nguyên liệu tổng hợp biodiesel SVTH: Ngô Tƣờng Vi ii MỤC LỤC MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THỊ vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix CHƢƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu giới hạn đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN 2.1 Cám gạo 2.2 Tổng quan lilpid 2.2.1 Glyceride 2.2.2 Phospholipid 2.2.3 Steride sterol 2.2.4 Sáp 2.3 Vi sinh vật cho dầu 10 2.3.1 Vi tảo 10 2.3.2 Nấm men 10 2.3.3 Nấm men Yarrowia lipolytica 11 2.4 Phƣơng pháp thủy phân 13 2.4.1 Thủy phân acid loãng 13 2.4.2 Thủy phân enzyme 14 SVTH: Ngô Tƣờng Vi iii MỤC LỤC 2.5 Phƣơng pháp khử độc 15 2.5.1 Phƣơng pháp sinh học 15 2.5.2 Khử độc phƣơng pháp vật lí 16 2.5.3 Phƣơng pháp hóa học 16 2.6 Phƣơng pháp trích ly chất béo 17 2.6.1 Trích ly Soxhlet 17 2.6.2 Trích ly dung môi 18 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Phƣơng tiện 19 3.1.1 Hóa chất 19 3.1.2 Dụng cụ thiết bị 19 3.2 Nội dung nghiên cứu 20 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.3.1 Thủy phân cám gạo tách béo 21 3.3.2 Khử độc 21 3.3.3 Nuôi cấy nấm men Y lipolytica Po1g 22 3.3.4 Trích ly chất béo 23 3.3.5 Khử sáp gum 23 3.3.6 Phƣơng pháp phân tích 23 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Ảnh hƣởng nồng độ dung dịch acid H2SO4 đến nồng độ đƣờng tổng 25 4.2 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến nồng độ đƣờng tổng 26 4.3 Ảnh hƣởng tỉ lệ DDA/CGTB thủy phân đến nồng độ đƣờng tổng 27 4.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ thủy phân đến nồng độ đƣờng tổng 29 SVTH: Ngô Tƣờng Vi iv MỤC LỤC 4.5 Ảnh hƣởng hợp chất ức chế đến nồng độ đƣờng 30 4.6 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến sinh trƣởng Y lipolytica 32 4.7 Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng đến sinh trƣởng Y lipolytica 32 4.8 Thành phần lipid tích lũy 33 CHƢƠNG KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Hạn chế 35 5.3 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 SVTH: Ngô Tƣờng Vi v MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Một số loài vi sinh vật cho dầu 10 Bảng 2.2: Một số chủng nấm men có khả tích lũy dầu 11 Bảng 2.3: Hàm lƣợng thành phần chất béo sinh khối số loại nấm men 12 Bảng 4.1: Điều kiện tối ƣu cho giai đoạn thủy phân CGTB 30 Bảng 4.2: Thành phần mạch carbon cấu trúc nên chất béo nấm men 34 SVTH: Ngô Tƣờng Vi vi CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nồng độ đường tổng, g/L 70 60 50 40 30 20 10 60 70 80 90 Nhiệt độ thủy phân, °C Hình 4.8 Ảnh hƣởng nhiệt độ thủy phân đến nồng độ đƣờng tổng Sau trình khảo sát điều kiện tối ƣu trình thủy phân CGTB đƣợc ghi lại bảng sau: Bảng 4.1: Điều kiện tối ƣu cho giai đoạn thủy phân CGTB Yếu tố Nồng độ acid, % (w/w) Thời gian thủy phân, h Tỉ lệ DDA/CGTB, mL/g Nhiệt độ thủy phân, °C Gía trị tối ƣu 4% 6h mL/g 90 °C 4.5 Ảnh hƣởng hợp chất ức chế đến nồng độ đƣờng Quá trình khử độc tính chất ức chế gây suy giảm nồng độ đƣờng CGTB thủy phân Cụ thể, trƣớc khử độc nồng độ đƣờng tổng đạt đƣợc khoảng 57.11 g/L; sau giảm 50.29 g/L (Hình 4.6) Nồng độ đƣờng có thay đổi đáng kể với giá trị p < 0.005 (Phụ lục 3) Nồng độ đƣờng tổng giảm có hình thành phức glucose xylose với Ca 2+ dung dịch base SVTH: Ngô Tƣờng Vi 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 4.9 Sản phẩm CGTB thủy phân sau trƣớc khử độc Nồng đồ đường tổng, g/L 60 50 40 30 20 10 Trước khử độc Sau khử độc Hình 4.10 Ảnh hƣởng chất ức chế đến nồng độ đƣờng tổng SVTH: Ngô Tƣờng Vi 31 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.6 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến sinh trƣởng Y lipolytica Nấm men tăng trƣởng tốt từ ngày đến ngày với giá trị đo đƣợc 6.3 g/L lên 15.32 g/L Ở ngày thứ sinh khối đạt giá trị cực đại Sinh khối bắt đầu giảm từ ngày thứ 5, thứ (12.05 g/L 6.58 g/L) điều giải thích nguồn dinh dƣỡng bị cạn kiệt, không đủ đáp ứng cho nhu cầu sinh trƣởng tế bào nấm men Bên cạnh đó, nồng độ đƣờng hầu nhƣ giảm tuyến tính qua ngày nuôi cấy từ 20.96 g/L ngày thứ xuống 1.71 g/L ngày cuối Nồng độ sinh khối, g/L Lượng đường lại, g/L 25 20 12 15 10 - Lượng đườang lại, g/L Nồng độ sinh khối, g/L 16 Thời gian nuôi cấy, ngày Hình 4.11 Sự ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 4.7 Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng đến sinh trƣởng Y lipolytica Hình 4.9 khảo sát ảnh hƣởng nồng độ đƣờng đến khối lƣợng sinh khối hàm lƣợng lipid tích lũy đƣợc Ta thấy, nồng độ sinh khối đạt cao 14.28 g/L 30 g/L, lipid tích lũy đạt 24.59% Sinh khối đạt đƣợc 20 g/L 40 g/L 12.27 g/L 12.26 g/L Ở 20 g/L, với nồng độ đƣờng chƣa đủ đáp ứng cho sinh trƣởng tế bào nấm men nên khối lƣợng sinh khối thấp, lipid tích lũy đạt 21.01% Ở 40 g/L, nồng độ đƣờng cao, nồng độ chất tan đạt cao, áp suất thẩm thấu tế bào lớn, nấm men bị phá vỡ trạng thái bình thƣờng, tế bào nấm bị ức chế dẫn đến hàm lƣợng lipid đạt thấp 22.1% SVTH: Ngô Tƣờng Vi 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nồng độ sinh khối, g/L Hàm lượng dầu, % Nồng độ sinh khối, g/L Hàm lượng dầu, % 30 25 20 15 10 20 30 40 Nồng độ đường nuôi cấy, g/L Hình 4.12 Sự ảnh hƣởng nồng độ đƣờng đến nồng độ sinh khối hàm lƣợng lipid tích lũy Y lipolytica Qua kết khảo sát giai đoạn nuôi cấy, nồng độ sinh khối hàm lƣợng dầu tích lũy tế bào nấm men Y lipolytica Pog đạt tối ƣu 14.52 ± 0.33 g/L 24.59% nuôi ngày, nồng độ đƣờng 30 g/L 4.8 Thành phần lipid tích lũy Chất béo sau trích ly đƣợc loại bỏ sáp gum phƣơng pháp kết tủa acetone lạnh Thành phần acid béo thu đƣợc: 55.71% sáp gum, acid béo trung tính đạt 44.29% Phần acdi béo trung tính đƣợc phân tích GC, kết đạt ta thấy thành phần chiếm tỉ lệ cao Acid oleic (C18:1) acid palmitic (C16:0) 48.19% 16.27% Kế đến palmitoleic acid (10.42%); eicosenoic acid (5.56%); arachidic acid (5.24%); acid stearic (5.11%) số thành phần khác (Bảng 4.2), (Hình 4.10) 88.64% thành phần mạch carbon phân tích đƣợc từ C16 đến C18, acid béo chủ yếu bão hòa không bão hòa đơn Điều cho thấy chất béo từ nấm men Y lipolytica Po1g nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất biodiesel SVTH: Ngô Tƣờng Vi 33 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng 4.2: Thành phần mạch carbon cấu trúc nên chất béo nấm men % khối lƣợng Thành phần Acid Palmitoleic C16:1 10.42 Acid Palmitic C16:0 16.27 Acid Oleic C18:1 48.19 Acid Stearic C18:0 5.11 Acid Eicosenoic C20:1 5.56 Acid Arachidic C20:0 5.24 Thành phần khác uV(x10,000) 5.0 Chromatogram 11.36 uV(x10,000) Chromatogram 4.5 1.25 4.0 1.00 3.5 0.75 3.0 0.50 2.5 0.25 2.0 0.00 1.5 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 1.0 0.5 0.0 -0.5 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 Hình 4.13 Sắc kí đồ thành phần acid béo tế bào nấm Y lipolytica đƣợc nuôi cấy môi trƣờng thủy phân CGTB SVTH: Ngô Tƣờng Vi 34 CHƢƠNG KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình thủy phân CGTB: nồng độ acid, thời gian, nhiệt độ, tỉ lệ dung dịch thủy phân/nguyên liệu đƣợc khảo sát với kết đạt đƣợc: - Nồng độ acid: 4% (w/w) - Thời gian: h - Nhiệt độ: 90 °C - Tỉ lệ dung dịch thủy phân/nguyên liệu: Nồng độ đƣờng tổng thu đƣợc cao (57.11 ± 1.101 g/L) Có thể nói CGTB nguồn nguyên liệu lignocellulose tiềm năng, đƣợc sử dụng sản xuất lipid Sản xuất lipid từ vi sinh vật, làm giảm chi phí sản xuất dầu nguyên liệu 5.2 Hạn chế - Chƣa phân tích số hóa lý lipid thu đƣợc - Chƣa xác định thành phần đƣờng sản phẩm thủy phân CGTB - Chƣa xác định đƣợc thành phần, hàm lƣợng chất ức chế sản phẩm thủy phân trƣớc sau khử độc - Hàm lƣợng lipid thu đƣợc thấp 5.3 Kiến nghị Cần phân tích thêm thành phần đƣờng chất ức chế sản phẩm thủy phân Tiếp tục nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến tích lũy lipid (khảo sát hàm lƣợng nitrogen, pH, nhiệt độ,…) mà đề tài chƣa thực đƣợc Tận dụng xác sinh khối để giảm chi phí trình sản xuất lipid, thực Hóa học Xanh 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Murugesan, A., et al (2009), "Production and analysis of bio-diesel from nonedible oils—A review", Renewable and Sustainable Energy Reviews, 13, 825834 [2] Haas, M., Scott, K., Marmer, W., and Foglia, T (2004), "In situ alkaline transesterification: An effective method for the production of fatty acid esters from vegetable oils", Journal of the American Oil Chemists' Society, 81, 83-89 [3] Dorado, M P., Cruz, F., Palomar, J M., and López, F J (2006), "An approach to the economics of two vegetable oil-based biofuels in Spain", Renewable Energy, 31, 1231-1237 [4] Haas, M J., McAloon, A J., Yee, W C., and Foglia, T A (2006), "A process model to estimate biodiesel production costs", Bioresource Technology, 97, 671-678 [5] Bozbas, K (2008), "Biodiesel as an alternative motor fuel: Production and policies in the European Union", Renewable and Sustainable Energy Reviews, 12, 542552 [6] Li, Q., Du, W., and Liu, D (2008), "Perspectives of microbial oils for biodiesel production", Applied Microbiology and Biotechnology, 80, 749-756 [7] Beopoulos, A., et al (2009), "Yarrowia lipolytica as a model for bio-oil production", Progress in Lipid Research, 48, 375-387 [8] Tanaka, T., et al (2006), "Production of d-lactic acid from defatted rice bran by simultaneous saccharification and fermentation", Bioresource Technology, 97, 211-217 [9] Nicolosi, R J., Austrian, L M., and Hegsted, D M (1991), "Rice bran oil lowers serum total and low density lipoprotein cholesterol and apo B levels in nonhuman primates", Atherosclerosis, 88, 133-142 [10] Shin, T S., Godber, J S., Martin, D E., and Wells, J H (1997), "Hydrolytic stability and changes in E vitamers and oryzanol of extruded rice bran during storage", Journal of food science, 62, 704-708 [11] Phƣơng, P Q M (2012), "Tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học không ion từ dầu dừa-ứng dụng bảo quản nông sản" [12] Meng, X., et al (2009), "Biodiesel production from oleaginous microorganisms", Renewable Energy, 34, 1-5 [13] Metting, B., and Pyne, J W (1986), "Biologically active compounds from microalgae", Enzyme and Microbial Technology, 8, 386-394 [14] Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., and Isambert, A (2006), "Commercial applications of microalgae", Journal of Bioscience and Bioengineering, 101, 87-96 SVTH: Ngô Tƣờng Vi 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO [15] Ratledge, C (2008), "Microbial lipids", in Biotechnology Set, Wiley-VCH Verlag GmbH, pp 133-197 [16] Ageitos, J M., Vallejo, J A., Crespo, P V., and Villa, T G (2011), "Oily yeasts as oleaginous cell factories", Applied Microbiology and Biotechnology, 90, 1219-1227 [17] M.A.Z Coelho, P.F.F Amaral, and Belo2, I (2010), "Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse" [18] Papanikolaou, S., and Aggelis, G (2002), "Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture", Bioresource Technology, 82, 43-49 [19] Tsigie, Y A., Wang, C Y., Truong, C T., and Ju, Y H (2011), "Lipid production from Yarrowia lipolytica Po1g grown in sugarcane bagasse hydrolysate", Bioresource Technology, 102, 9216-9222 [20] Barth, G., and Gaillardin, C (1996), "Yarrowia lipolytica", in Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Springer Berlin Heidelberg, pp 313-388 [21] Taherzadeh, M J., and Karimi, K (2007), "Enzyme-based hydrolysis process for ethanol from lignocellulosic materials - A review", BioResources, 2, 707-738 [22] Mussatto, S I., and Roberto, I C (2004), "Alternatives for detoxification of diluted-acid lignocellulosic hydrolyzates for use in fermentative processes: a review", Bioresource Technology, 93, 1-10 [23] Palmqvist, E., and Hagerdal, B H (2000), "Fermentation of lignocellulosic hydrolysates I: inhibition and detoxification", Bioresource Technology, 74, 1724 [24] Zhu, L Y., Zong, M H., and Wu, H (2008), "Efficient lipid production with Trichosporon fermentans and its use for biodiesel preparation", Bioresource Technology, 99(16), 7881-7885 [25] Millati, R., Niklasson, C., and Taherzadeh, M J (2002), "Effect of pH, time and temperature of overliming on detoxification of dilute-acid hydrolyzates for fermentation by Saccharomyces cerevisiae", Process Biochemistry, 38, 515522 [26] Vandana, V., Karuna, M S L., Vijayalakshmi, P., and Prasad, R B N (2001), "A simple method to enrich phospholipid content in commercial soybean lecithin", Journal of the American Oil Chemists' Society, 78, 555-556 [27] Rajam, L., Soban Kumar, D R., Sundaresan, A., and Arumughan, C (2005), "A novel process for physically refining rice bran oil through simultaneous degumming and dewaxing", Journal of the American Oil Chemists' Society, 82, 213-220 [28] Miller, G L (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar", Analytical Chemistry, 31, 426-428 SVTH: Ngô Tƣờng Vi 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO [29] Marsden, W L., Gray, P P., and Nippard, G J (1982), "Evaluation of the DNS method for analysing lignocellulosic hydrolysates ", J Chem Tech Biolechnol, 32, 1016-1022 [30] Tsigie, Y A., et al (2012), "Oil production from Yarrowia lipolytica Po1g using rice bran hydrolysate", J Biomed Biotechnol, 2012, 1-10 SVTH: Ngô Tƣờng Vi 38 PHỤ LỤC ĐƢỜNG CHUẨN CỦA NỒNG ĐỘ ĐƢỜNG KHỬ Đƣờng chuẩn D-glucose bƣớc sóng 575 nm y = 0.612x + 0.015 R² = 0.999 y: giá trị mật độ quang (OD) đo từ máy UV-VIS x: nồng độ D-glucose 3.5 y = 0.612x + 0.015 R² = 0.999 Mật độ quang 2.5 1.5 0.5 0 Nồng độ đường (g/l) Đƣờng chuẩn D-glucose bƣớc sóng 575 nm 39 PHỤ LỤC PHỤ LỤC ĐƢỜNG CHUẨN SINH KHỐI Đƣờng chuẩn sinh khối bƣớc sóng 600 nm R2 =0.9957 y = 0.3262x + 0.0145 y: giá trị mật độ quang (OD) đo từ máy UV-VIS x: sinh khối, mg/ mL 0.8 y = 0.3262x + 0.0145 R² = 0.9957 Độ hấp thu 600nm 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 1.4 1.6 1.8 Sinh khối, mg/ ml Đƣờng chuẩn sinh khối bƣớc sóng 600 nm SVTH: Ngô Tƣờng Vi 40 PHỤ LỤC PHỤ LỤC SẮC KÝ KHÍ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN LIPID uV(x10,000) 5.0 Chromatogram uV(x10,000) Chromatogram 4.5 1.25 4.0 1.00 3.5 0.75 3.0 0.50 2.5 0.25 2.0 0.00 1.5 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 1.0 0.5 0.0 -0.5 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 Sắc kí đồ thành phần acid béo tế bào nấm Y lipolytica đƣợc nuôi cấy môi trƣờng thủy phân CGTB SVTH: Ngô Tƣờng Vi 41 Bảng số liệu GC tƣơng ứng Peak# 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Ret.Time 0.985 1.107 1.183 1.311 1.416 1.614 2.157 2.249 2.589 2.714 2.980 4.292 4.828 6.049 6.138 6.381 7.245 7.365 7.859 8.368 8.504 8.969 9.425 9.538 10.444 11.487 Area 146830035.5 46992.3 81606.9 7217.4 6976.8 2703.4 1304.4 1688.3 1889.8 2152.5 4471.0 3425.9 1116.6 4511.9 1463.6 1298.1 10831.3 16900.0 4297.2 50066.2 5309.4 1741.7 3538.0 5445.4 1223.1 5772.4 Height 75303530.3 13988.9 42474.0 2271.9 3303.7 411.4 357.5 281.3 364.3 492.1 1904.9 295.1 272.0 1086.6 610.7 613.6 4584.3 7540.4 1319.5 13730.8 1174.2 678.8 1332.9 1904.3 460.9 2329.9 Separation F 0.000 0.000 1.631 1.645 1.324 1.460 1.863 1.078 1.269 1.078 1.154 1.658 1.162 1.318 1.018 1.047 1.160 1.019 1.077 1.074 1.018 1.062 1.057 1.013 1.106 1.110 Final Time 1.081 1.161 1.273 1.393 1.537 1.744 2.192 2.361 2.640 2.785 3.088 4.441 4.976 6.112 6.248 6.449 7.321 7.521 7.920 8.457 8.729 9.072 9.496 9.688 10.496 11.592 Initial Time 0.928 1.081 1.161 1.273 1.393 1.537 2.064 2.192 2.505 2.640 2.953 4.064 4.801 5.952 6.112 6.248 7.192 7.321 7.705 8.241 8.457 8.905 9.377 9.496 10.336 11.416 Area% 99.7667 0.0319 0.0554 0.0049 0.0047 0.0018 0.0009 0.0011 0.0013 0.0015 0.0030 0.0023 0.0008 0.0031 0.0010 0.0009 0.0074 0.0115 0.0029 0.0340 0.0036 0.0012 0.0024 0.0037 0.0008 0.0039 42 PHỤ LỤC 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 SVTH: Ngô Tƣờng Vi 12.246 13.193 14.102 14.734 16.445 17.011 19.424 20.001 20.358 20.724 21.593 1344.6 8434.7 2832.2 5277.8 2311.7 1878.6 29519.6 4411.8 4845.2 3905.7 4619.5 585.7 2626.4 1033.7 1660.6 441.4 390.3 451.0 422.2 179.5 522.1 427.9 1.072 1.084 1.074 1.048 1.124 1.037 1.151 1.031 1.019 1.019 1.044 12.313 13.329 14.193 14.857 16.520 17.096 19.875 20.108 20.608 20.941 21.958 12.185 13.065 14.009 14.633 16.265 16.921 17.945 19.875 20.108 20.608 21.224 0.0009 0.0057 0.0019 0.0036 0.0016 0.0013 0.0201 0.0030 0.0033 0.0027 0.0031 43 PHỤ LỤC GIÁ TRỊ P CHO NỒNG ĐỘ ĐƢỜNG TRƢỚC KHỬ ĐỘC VÀ SAU KHỬ ĐỘC Mean Variance Observations Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T[...]... trình thủy phân cám gạo và nuôi cấy nấm men Y .lipolytica Qua đó đánh giá khả năng sử dụng cám gạo tách béo làm nguồn nguyên liệu để nuôi cấy nấm men sản xuất chất béo Nội dung đề tài gồm hai phần: (i) khảo sát quá trình thủy phân cám gạo tách béo bằng dung dịch H2SO4 loãng, tìm điều kiện phản ứng tối ƣu để thu đƣợc dung dịch thủy phân có nồng độ đƣờng tổng cao nhất; (ii) khảo sát khả năng sử dụng CGTB thủy. .. sàng Thủy phân bằng acid H2SO4 CGTB thủy phân Tế bào nấm men Y .lipolytica Po1g Khử độc bằng Ca(OH)2 Nhân giống sơ bộ trong YPD Lọc Môi trƣờng nuôi cấy Nuôi cấy Nấm men/ môi trƣờng: 1/10 (v/v) Nấm sinh trƣởng trong YPD 24 h Xác định sinh khối và hàm lƣợng lipid Hình 3.1 Quy trình thí nghiệm cơ bản SVTH: Ngô Tƣờng Vi 20 CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Thủy phân. .. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2 Nội dung nghiên cứu Các công việc cơ bản đƣợc mô tả trong (Hình 3.1) CGTB sau khi xử lí đƣợc thủy phân bằng H2SO4 loãng Sản phẩm thủy phân, đƣợc khử độc bằng Ca(OH)2 sau đó tiến hành lọc để tạo thành môi trƣờng nuôi cấy Tế bào nấm men trong môi trƣờng YPDA sẽ đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dung dịch CGTB thủy phân với tỉ lệ 1/10 Sự sinh trƣởng của nấm men đƣợc khảo sát thông... 160 vòng/phút, trong 24 h Nấm men đã nuôi cấy sơ bộ tiếp tục đƣợc nhân rộng trong môi trƣờng CGTB thủy phân với tỷ lệ thể tích 1/10 Quá trình lên men đƣợc tiến hành trong các bình tam giác 500 mL với thể tích môi trƣờng nuôi cấy là 250 mL, nhiệt độ 26 °C và tốc độ lắc 160 vòng/phút Môi trƣờng nuôi cấy bao gồm: sản phẩm CGTB thủy phân, bổ sung 5 g/L peptone Quá trình nuôi cấy nấm men Y lipolytica có... trình nuôi cấy nấm men sẽ khảo sát nhƣ: - Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy - Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng trong môi trƣờng nuôi cấy SVTH: Ngô Tƣờng Vi 2 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1 Cám gạo Hình 2.1 Cám gạo Cám gạo là phụ phẩm chính thu đƣợc từ lúa sau khi xay xát và thƣờng chiếm khoảng 10% trọng lƣợng lúa [8] Cám gạo đƣợc hình thành từ lớp vỏ nội nhũ, mầm phôi của hạt, cũng nhƣ một phần từ tấm (Hình 2.1) Cám gạo. .. trƣờng Trong đó cám gạo đã tách béo có thể là phụ phẩm lignocellulose trong các nhà máy trích ly dầu Sau trích ly dầu, cám gạo tách béo (CGTB) có thể đƣợc xem là nguồn lignocellulose tiềm năng dùng cho quá trình nuôi cấy nấm men sản xuất chất béo 1 CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.2 Mục tiêu và giới hạn của đề tài Mục tiêu của đề tài tìm ra qui trình sử dụng cám gạo đã tách béo làm môi trƣờng nuôi cấy nấm men Trong. .. khuấy trên bếp từ ở 60 °C, lọc lại để loại bỏ hoàn toàn kết tủa CaSO4 Sản phẩm thủy phân đã khử độc đƣợc giữ ở 4 °C cho đến khi cần sử dụng Khử độc bằng Ca(OH)2 Sản phẩm thủy phân Điều chỉnh pH bằng H2SO4 CGTB thủy phân đã khử độc Lọc Hình 3.3 Quy trình khử độc 3.3.3 Nuôi cấy nấm men Y lipolytica Po1g Nấm men Yarrowia lipolytica Po1g từ công ty YEASTERN Biotech Co Ltd, đƣợc cung cấp bởi phòng thí nghiệm... 2.3.3 Nấm men Yarrowia lipolytica Nấm men Yarrowia lipolytica thƣờng đƣợc tìm thấy trong các môi trƣờng giàu chất nền kị nƣớc nhƣ alkane và chất béo (Hình 2.9) Với cơ chế phức tạp và sự đa dạng của hệ gen, Y lipolytica có khả năng tích lũy chất béo trên 50% trong lƣợng khô của tế bào Vì vậy, Y lipolytica đƣợc xem nhƣ là một chủng nấm men có khả năng tích lũy dầu [7] Sự tích lũy lipid của tế bào nấm có... chuyên dụng, thủy phân bằng acid loãng an toàn và đạt đƣợc hiệu quả Bên cạnh đó, thủy phân bằng acid loãng không mất nhiều thời gian nhƣ thủy phân bằng enzyme [21] Vì vậy, thủy phân bằng acid loãng là một phƣơng pháp hiệu quả để thủy phân lignocellulose SVTH: Ngô Tƣờng Vi 13 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN Hình 2.10 Sản phẩm của quá trình thủy phân lignocellulose bằng acid 2.4.2 Thủy phân bằng enzym Bên cạnh thủy phân. .. chế trong môi trƣờng, nguồn nitrogen, nhiệt độ, oxy, thời gian nuôi cấy Trong giới hạn nội dung, đề tài chỉ khảo sát một số yếu quan trọng ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và tích lũy chất béo nhƣ: (i) nồng độ đƣờng tổng của CGTB thủy phân trong môi trƣờng nuôi cấy với khoảng khảo sát từ 20 - 40 g/L; (ii) thời gian nuôi cấy 1 – 6 ngày 3.3.4 Trích ly chất béo (lipid) từ sinh khối nấm men sau nuôi cấy Sau