Nghiên cứu khả năng sử dụng đặc điểm hạt phấn hoa trong kiểm nghiệm dược liệu

Hạt phấn hoa có nhiều đặc điểm độc đáo về hình dạng, kích thước, màu sắc, những đường nét hoa văn tự nhiên tinh tế, đặc sắc trên bề mặt đặc trưng cho mỗi họ, mỗi chi, mỗi loài thực vật..

BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGÔ THỊ MỸ HẰNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG s ử DỤNG

ĐẶC ĐIỂM HẠT PHẤN HOA

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC s ĩ KHOÁ 1999 - 2004)

Người hướng dẫn : TS NGƯYẼN VIÊT t h â n

TS BÀNH NHƯCUƠNG

Thời gian thực hiện : 2- 5/ 2004

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bè bạn đã động viên khích lệ tôi- là chỗ dựa tinh thần cho tôi trong quá trình làm khoá luận tốt nghiệp.

Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2004

Sinh viên

Ngô Thị Mỹ Hằng

M ỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỂ 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Một số nghiên cứu về hạt phấn 3

1.2 Sơ lược về hạt phấn Ì.2.Ỉ Nguồn gốc, sự hình thành hạt phấn 6

1.2.2 Ý nghĩa của hạt phấn 7

1.2.3 Cầu tạo màng hạt phấn 7

1.3 Những đặc điểm nhận dạng hạt phấn cơ b ả n 8

1.3.1 Hình dạng 8

1.3.2 Kích thước 11

1.3.3 Màu sắc 12

1.3.4 Cấu trúc bề mặt 12

1.3.5 Các kiểu miệng, vị trí của miệng 15

1.4 Phương pháp xử lí mẫu phấn hoa và ỉàm tiêu bản hạt phấn 17

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 19

2.1 Nguyên liệu, phương pháp thực nghiệm 19

2.1.1 Nguyên liệ u 19

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm 21

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận x é t 23

2.2.1 Kết quả thực nghiệm 23

1 Kết lu ậ n 40

2 Đề x u ấ t 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Thuốc thảo dược có tác dụng phòng chữa bệnh kỳ diệu, nhất là đối các bệnh "thời đại" thuộc cơ địa, nội tiết, chuyển hoá Do nguồn gốc thảo mộc, thuốc Đông dược thường được cho là lành tính, nên ngày càng được nhiều thầy thuốc và người bệnh lựa chọn Tuy nhiên, cũng vì vậy, về chủ quan, thuốc Đông dược dễ bị "xem nhẹ" về tác dụng phụ, độc tính, đặc biệt là phía người bệnh Đã từng xẩy ra nhiều trường hợp đau lòng do sử dụng nhầm lẫn dược liệu Khách quan, do thuốc Đông dược (dược liệu) phong phú, đa dạng (cả về chủng loại, nguồn gốc, thành phần), vấn đề quản lý, kiểm soát chất lượng khó khăn hơn nhiều so với Tân dược Thực tế, vấn đề chống nhầm lẫn, chống giả mạo đối với thuốc Đông dược, dược liệu chưa được quan tâm đúng mức, chưa được đầu tư khoa học nhiều.

Chính vì vậy, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng thuốc Đông dược thực

sự trở thành vấn đề cấp bách Góp phần vào công tác đó, công trình này nghiên cứu khả năng sử dụng đặc điểm hạt phấn làm tiêu chuẩn nhận dạng, chống nhầm lẫn dược liệu

Bản thân phấn hoa thiên nhiên là vị thuốc do chứa nhiều men sinh học, acid amin và các loại sinh tố cần thiết mà cơ thể con người không thể tự tổng hợp được Trong y học cổ truyền, dân gian, phấn hoa được dùng để chữa đau

Hạt phấn hoa có nhiều đặc điểm độc đáo về hình dạng, kích thước, màu sắc, những đường nét hoa văn tự nhiên tinh tế, đặc sắc trên bề mặt đặc trưng cho mỗi họ, mỗi chi, mỗi loài thực vật có thể khai thác Thêm vào đó, nói chung, hạt phấn hoa có độ bền hoá học, cơ học, nhiệt học cao - ít biến dạng qua chế biến, bảo quản - là đặc điểm nhận dạng ổn định, đầy triển vọng

Đề tài “Nghiên cứu khả năng sử dụng đặc điểm hạt phấn hoa trong kiểm

nghiệm dược liệu” này được tiến hành hướng các mục tiêu:

dùng có hoa, ưu tiên chọn những dược liệu dễ nhầm lẫn, nội dung kiểm nghiệm dựa đặc điểm hạt phấn Kết quả nghiên cứu được hệ thống hoá dưới dạng sơ đồ phân loại

hiển vi tạo nên những bức ảnh có tính khách quan, độ chuẩn xác cao phù hợp với yêu cầu kiểm nghiệm chung của khu vực về kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi

PHẦN 1

TỔNG QUAN

1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN cứu HẠT PHẤN CÂY THUỐC

Từ lâu, đặc điểm phấn hoa đã được sử dụng trong mô tả hình thái và phân loại thực vật Vì còn thiếu tính hệ thống nên chưa được sử dụng trong so sánh, đối chiếu Gần đây, các đặc điểm của phấn hoa đã được đúc kết, phân loại thành các nhóm, mỗi đặc điểm được chỉ tiêu hoá, tạo thành một hệ thống nhất quán Đã có những tài liệu chuyên khảo sâu sắc, toàn diện, có giá trị giáo khoa [16] Nhờ đó, cách mô tả hạt phấn nhất quán, có hệ thống, thuận lợi cho việc đối chiếu, tham khảo, so sánh các loại hạt phấn

Ở nước ta, việc nghiên cứu hạt phấn hoa chưa được quan tâm nhiều Các tài liệu nghiên cứu về hạt phấn hoa chiếm tỉ lệ nhỏ, đặc biệt chưa có những tài liệu có tính hệ thống nghiên cứu về hạt phấn các dược liệu

Trong Dược điển Việt Nam III, trong số 273 chuyên luận dược liệu, có

21 chuyên luận kiểm nghiệm dược liệu bộ phận dùng có hoa Kết quả thống

kê liên quan đến phấn hoa như sau:

- Mô tả hình dạng hạt phấn (không nêu kích thước): 9 chuyên luận

- Chưa đề cập đến hạt phấn trong

Một số nghiên cứu khác [3], [4], [8], [9], [13], [14], [15] đã mô tả hình dạng, kích thước hạt phấn, nhưng chưa nêu con số cụ thể về kích thước hạt phấn và chưa có tính hệ thống

Bảng Ị : Đặc điểm hạt phấn được mô tả trong một số tài liệu

3 lỗ nảy mầm, đường kính khoảng 25 ụm [4], [14]

Hình cầu, hình trái xoan, hình bầu dục,

vỏ ngoài hạt phấn cố gai, đường kính 60-

nhọn, đường kính khoảng 30 ụm [4]

xù xì, rõ 3 lỗ nảy mầm

[3], [4], [14]

[15]

Trên cơ sở những dược liệu đã từng được nghiên cứu về phấn hoa, ngoài hình dạng, kích thước, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu sâu hơn, hệ thống hơn, bổ sung những đặc điểm khác quan sát thấy dưới kính hiển vi thông thường như:

- Những yếu tố chạm trổ (hoa văn) trên bề mặt hạt phấn

- Gai hạt phấn: dạng, chiều cao, khoảng cách giữa các gai, số lượng gai trên vòng tròn xích đạo

- Kích thước hạt phấn - số đo cụ thể

Đồng thời, chúng tôi cũng đã tiến hành nghiên cứu mở rộng phấn hoa của

một số dược liệu bộ phận dùng có hoa khác, ưu tiên lựa chọn các dược liệu dễ nhầm và hệ thống hoá lại, giới thiệu sơ đồ phân loại dựa vào đặc điểm hạt phấn

Trong thực tế sử dụng dược liệu, dễ có sự nhầm lẫn giữa các dược liệu ví

dụ như [10]:

1 - Sài đất -Weddia calendulacea (L.) Less., họ Cúc (Asteraceae) với Sài lan - Tridax procumbens L., họ Cúc (.Asteraceae), Sài gục = Lỗ địa cúc -

Wedelia prostata Hemsl., họ Cúc (Asteraceae).

2 - Mò hoa đỏ - Clerodendron infortunatum L., họ cỏ roi ngựa

(Verbenaceae) với Mò hoa trắng - Clerodendron paniculatum L., họ cỏ roi

ngự* (Verbenaceae), Mò mâm xôi - Clerodendron fragrans Vent., họ cỏ roi ngựa (Verbenaceae).

3 - Hy thiêm - Siegesbeckia orientalỉs L., họ Cúc (Asteraceae) vói cây Cứt lợn - Agératum conyzoides L., họ Cúc (Asteraceae).

Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, so sánh các đặc điểm của hạt phấn hoa của các dược liệu dễ nhầm lẫn trên, nhằm khắc phục tình trạng giả mạo, nhầm

4 - Cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum L.), Cúc hoa Trung quốc

(Chrysanthemum morifolium Ram.), Cải cúc (Chrysanthemum coronarium L.) cùng thuộc họ Cúc (Asteraceae)

gratissimum L.), Húng quế (o bacilicum L.) cùng thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae).

6 - Mò mâm xôi, Mò hoa đỏ, Mò hoa trắng

7 - Hai loài Kim ngân: Kim ngân Lonicera japónica, Kim ngân lẫn - L.

confusa DC., họ Kim ngân (Caprifoliaceae) [1].

Với mong muốn mang lại tầm nhãn quan mới về hạt phấn hoa và giúp cho công tác kiểm nghiệm dược liệu trở nên thuận lợi hơn, chúng tôi đã hệ thống hoá kho tư liệu hình ảnh hạt phấn hoa của 36 dược liệu nghiên cứu thành sơ đồ phân loại

1.2 Sơ LƯỢC VỀ HẠT PHẤN

1.2.1 NGUỒN GỐC, Sự HÌNH THÀNH HẠT PHẤN

Hạt phấn được sinh ra từ những tế bào mẹ hạt phấn nằm trong các ô phấn Tế bào mẹ hạt phấn phân chia hai lần liên tiếp để hình thành một bộ bốn, gồm 4 bào tử nhỏ đơn bội Đó là hạt phấn [7] Đôi khi chỉ một hạt phấn phát triển, ba hạt còn lại tiêu giảm, màng hạt phấn xuất hiện trực tiếp từ màng

của tế bào mẹ sinh bào tử tạo nên kiểu giả (họ Cyperaceae).

Hạt phấn thường tách rời nhau rất sớm và sắp xếp tự do trong khoang của

ô phấn Ở đại đa số thực vật hạt kín, hạt phấn thường gặp dưới dạng đơn độc Một vài trường hợp, các hạt phấn có thể dính liền nhau thành bộ 8, bộ 64

(nhiều đại diện của họ Mimosaceae), hoặc tạo thành khối phấn (họ

Asclepiadaceae, Orchidaceae) [2].

1.2.2 Ý NGHĨA CỦA HẠT PHẤN

Hình thái hạt phấn rất đa dạng, tương đối đặc trưng cho mỗi họ, mỗi chi, mỗi loài thực vật Do cấu trúc màng hạt phấn rất bền vững nên chúng có thể tồn tại dưới dạng hoá thạch

Nghiên cứu, so sánh phấn hoa hoá thạch và phấn hoa hiện đại giúp cho các nhà thực vật xây dựng mối liên hệ giữa thực vật cổ đại với thực vật hiện nay, giúp các nhà khảo cổ xác định các niên đại lịch sử, giúp các nhà địa chất xác định các thời kì địa chất [2]

Trong ngành y dược, phấn hoa vừa được dùng làm thuốc vừa là tác nhân gây dị ứng Trong ngành pháp y, ứng dụng các phương pháp xác định hình thái phấn hoa để phát hiện các vật phẩm gây án có nguồn gốc cây cỏ Mặt khác, nghiên cứu hình thái phấn hoa cũng góp phần đánh giá chất lượng các chế phẩm có chứa phấn hoa như mật ong

Các đặc điểm hình thái hạt phấn hoa được dùng để xác định, phân loại thực vật, kiểm nghiệm dược liệu có hoa

Vì vậy, nghiên cứu và nắm vững hình thái hạt phấn hoa có ý nghĩa rất quan trọng đối với các Dược sĩ đặc biệt là những người làm công tác phân loại thực vật và kiểm nghiệm dược liệu

1.2.3 CẤU TẠO CỦA MÀNG HẠT PHẤN.

Màng hạt phấn ở các cây thực vật hạt kín có 3 lớp chính: lớp màng trong (intin), lớp giữa (exin), lớp màng ngoài (perin) [16]

a Lớp màng trong (intin):

Lớp màng trong được cấu tạo chủ yếu bằng chất pectin và xenluloza Nó tham gia hình thành ống phấn, kém bền vững về mặt hoá học và cơ học, thường dễ bị hoà tan trong kiềm và acid, bị phân huỷ trong quá trình hoá thạch

Theo quan niệm của Reitsma [2], lớp giữa gồm có sexin và nexin

c L('fp màng ngoài (perin):

Lớp màng ngoài là lớp mỏng trong suốt, cấu tạo bằng chất calloza bao phủ hạt phấn, được hình thành từ ngoại sinh chất của hạt phấn, kém bền vững

về mặt hoá học, dễ bị phá huỷ trong khi xử lí, hoá thạch (chỉ còn 30-40 % hạt

phấn hoá thạch còn lại lớp ngoài) [2]

1.3 NHỮNG ĐẶC ĐIỂM NHẬN DẠNG cơ BẢN CỦA HẠT PHẤN■ ■ ■ ■

Hạt phấn có những đặc điểm cơ bản sau:

Hinh dang Mo ta Chi so

Det Det (oblate) P/E = 4/8 - 6/8

Dai Dai (prolate) § II 00 Ov i 00

1.3.2 KÍCH THƯỚC

Kích thước của hạt phấn rất khác nhau giữa các loài cây từ một vài |im

(Myosotis) đến 200 |j.m thậm chí hơn nữa như một số loài của họ Cucurbitaceae, Nyctaginaceae) Các họ nguyên thủy thường có hạt phấn to

hơn, các họ tiến hoá càng cao thì có hạt phấn càng nhỏ hơn Đặc biệt, ở một

số họ tiến hoá cao nhưng kích thước hạt phấn lại lớn như vài chi trong các họ

Nyctaginaceae, Malvaceae, Cucurbitaceae, hoặc ở chi Morinda, hạt phấn rất

to có thể nhìn thấy bằng mắt thường Hạt phấn lớn thường gặp ở thực vật có hoa to Hạt phấn nhỏ chiếm ưu thế ở thực vật có hoa nhỏ và cụm hoa Hoa nhỏ

nên bao phấn cũng nhỏ dẫn đến kích thước hạt phấn cũng nhỏ Kích thước hạt phấn phụ thuộc vào độ dài của khoảng cách mà ống phấn cần phải đi và một

số yếu tố khác như điều kiện sinh lý của quá trình phát triển ống phấn ở phía

trong các mô của nhụy Những loài có vòi nhụy dài, hạt phấn phải lớn để dự trữ nhiều chất dinh dưỡng cho sự phát triển của ống phấn [2]

Dựa vào số đo kích thước trục lớn nhất của hạt phấn để phân chia chúng thành các nhóm [16]:

1.3.3 MÀU SẮC

Hạt phấn có màu sắc rất đa dạng: màu trắng, xanh, xám, da cam, tím, vàng đậm nhạt khác nhau Màu hạt phấn phụ thuộc vào chất cấu tạo màng Thông thường, chất cấu tạo màng là sporopollenin có màu vàng nhạt hoặckhông màu Ở một số thực vật trong màng hạt phấn còn có các sắc tố như anthocyan, carotenoid, anthoxanthine v.v [2]

1.3.4 CẤU TRÚC BỀ MẶT [2]

/ Nhẵn: Bề mặt nhẵn đều, không lồi lõm

2 Lõm: Có yếu tố lõm sâu xuống bề mặt:

Có lỗ nhỏ hoặc chỗ lõm có đường kính nhỏ hơn 1 ụ,m, khoảng cách giữa chúng luôn lớn hơn bề rộng của chúng

T ilia

selago

thành lưới, mắt lưới nhiều cạnh

Dracaena

3 Lồi.

Thường rộng hơn, cao và không thắt ở

gốc, cỡ lớn hơn 1 ỊLim, rctì xa nhau

(đường kính nhỏ hơn khoảng cách giữa chúng)

Plantago Acer

quanh chân và luôn cao hơn 1 |am.

Các mấu lồi kéo dài, chiều dài ít nhất gấp đôi chiều rộng, nối tiếp nhau thành dải đơn hay phân nhánh, chạy song song

Potentilla

Các phần tử chạm trổ dạng gờ sắp xếp thành mạng lưói, bề rộng các mắt lớn hơn 1 ịim, các gờ lổm hơn hoặc bằng bề măt các mắt

Biểu đồ các kiểu chạm trổ khi nhìn bề mặt và trên lát cắt quang học được trình bày theo Hình 2 dưới đây:

Các khu vực nhô lên có màu sáng, các khu vực thấp hơn hoặc các hố thì tối Mỗi kiểu chạm trổ (ví dụ: hột cơm) có thể tạo ra bởi 3 kiểu cấu trúc exin khác nhau Kiểu khác (ví dụ: lỗ) chỉ tạo ra bởi mỗi một kiểu exin

è & Ĩ & ĩ r

a & g &

Nhẵn(Psilate)

Hạt nhỏ (Granulate)

Rugulate

Sọc (vân) (Striate)

Lưóti lồi Reticulate

Hột cơm (Verrucate)

Lỗ(Perforate)

Vd: Nymphoides Vd: Polemonỉum

Vd: Menyanthes Vd: Helianthemum Vd: Helỉanthemum, Gentiana

Vd: Trifolium Vd: Salix

Vd: Plantago Vd: Cyperaceae Vd: Nymphaea Vd: Cerastium

1.3.5 CÁC KIỂU MIỆNG, VỊ TRÍ CỦA MIỆNG

Miệng là đặc điểm quan trọng nhất để nhận biết hạt phấn Miệng là phầnmỏng của exin hoặc vùng exin có cấu tạo đặc biệt là nơi đi ra của ống phấn

Có các dạng miệng sau [2]:

■ Lỗ (porus): là chỗ thủng nhỏ của sexin, có dạng tròn, bầu dục, nhưng không bao giờ trục dài lớn hơn 2 lần trục ngắn

■ Rãnh (colpus) : là chỗ thủng nhỏ dài, hình lòng thuyền với các đầu nhọn,

bờ mép phẳng hoặc có dạng lượn sóng Lỗ tiến hoá hơn rãnh

■ Ồ- ra: là chỗ nứt trên nexin nằm dưới rãnh hoặc lỗ, hình thái giống rãnh hoặc lỗ nhưng khác về nguồn gốc

Hệ thống NPC [16] là hệ thống phân loại hạt phấn dựa vào các tiêu chuẩn:

- (Number): Đặc trưng cho số lượng miệng của hạt phấn.

- p {Position): Vị trí của miệng.

Chỉ số vị trí

(zonotreme).

- c (Characteristic): Đặc điểm của miệng:

-TREME -LEPT -TRICHO- -COLPATE -PORATE -COIP- -POR-

COIPATEHình 1: Hệ thống NPC

1.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ MẪU PHẤN HOA VÀ LÀM TIÊU BẢN HẠT PHẤN [11]

a Phương pháp xử lí mẫu phấn hoa

Phương pháp xử lí mẫu phấn hoa hiện đại của Erdtman, một phương pháp được dùng phổ biến trên thế giới hiện nay

- Pha dung dịch axetolize:

Anhydrit axetic tinh khiết 9 phần

khuấy đều trong khi đun

* Ly tâm trong 5-10 phút, tốc độ 2500 vòng/ phút Gạn lấy cặn Cho vào cặn 10 ml nước cất, lắc đều Ly tâm lại Gạn đổ nước đi Làm hai lần để rửa

* Cho vào cặn này 5 ml dd nước glycerin (tỉ lệ 1/1) Lắc đều, để yên độ

15 phút Ly tâm lại để lấy cặn

Chú ý:

- Có một số phấn hoa không thể áp dụng phương pháp này, vì chúng dễ bị

phá huỷ hoặc ít nhất cũng bị hư hại trong khi xử lí Có thể dùng phương pháp khác như đun nóng trong dung dịch KOH, NaOH loãng (2-5%), hoặc chỉ cần tẩy màu trước khi soi

- Nụ hoặc hoa khô, to, trước khi xử lí cần ngâm trong nước nóng vài giờ Sau đó, tách riêng bao phấn xử lí theo phương pháp nói trên

b Phương pháp làm tiêu bản hạt phấn.

- Lau sạch lá kính, phiến kính Đặt phiến kính lên trên khung có đánh dấu

vị trí cần đặt phấn hoa

- Đốt đỏ que lấy hạt phấn trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội

- Dùng đầu kim lấy một miếng gelatin- glixerin bằng đầu tăm, chấm vào đáy ống li tâm có hạt phấn đã được xử lí Đặt miếng gelatin- glixerin lên chỗ

đã định trên phiến kính

đầu kim ngoáy nhẹ cho hạt phấn phân tán đều trên đó Khi gelatin đang chảy lỏng, đậy ngay lá kính lại (tránh không tạo bọt khí) Đặt một số mảnh vụn parafin lên phiến kính, cạnh mép kính, hơ phiến kính trên đèn cồn cho parafin

đủ chảy ra Khi parafin bắt đầu chảy, hơ nóng nhẹ ngay dưới lá kính, để parafin chảy lỏng trải đều dưới lá kính mà không bị đông giữa chừng Lật ngược ngay tiêu bản úp lên giá gỗ, để nguội Khi phiến kính nguội thì cạo sạch parafin thừa ở quanh mép lá kính bằng lưỡi dao cạo mỏng, lau sạch lại bằng khăn có tẩm xylen

Đuôi công (Plumbaginaceae)

(Asteraceae)

Pery., họ Sim (Myrtaceae)

(Apocynaceae)

(Araliaceae)

(Asteraceae)

(Lamiaceae)

( 27 Lạc tiên1 Passiflora foetida L , họ Lạc tiên