Tác dụng bảo vệ thụ động của kháng thể miễn dịch trong lòng đỏ trứng gà chống lại các vi khuẩn vibrio anguillarum gây nhiễm vào cá ngọt (plecoglossus altivelis)

Tên báo: Tác dụng bảo vệ thụ động kháng thể miễn dịch lòng đỏ trứng gà chống lại vi khuẩn Vibrio anguillarum gây nhiễm vào cá (Plecoglossus altivelis) Đặt vấn đề: Sử dụng globulin miễn dịch lòng đỏ trứng gà (IgY) thu hút nhiều ý phương tiện cho việc kiểm soát bệnh truyền nhiễm gây vi sinh vật Nghiên cứu đánh giá hiệu bảo vệ IgY chống lại nhiễm trùng Vibrio anguillarum gây nhiễm vào cá ngọt( Plecoglossus altivelis) IgY phân lập từ lòng đỏ trứng gà ban đầu chủng ngừa với formalin V anguillarum bất hoạt Tỷ lệ tử vong thấp cá quan sát thấy nhóm điều trị IgY (aVIgY) khángV anguillarum so với người điều trị nước muối sinh lí với nonspecific IgY (nspIgY) Tất nhóm cá điều trị nước muối sinh lí điều chết vòng bảy ngày sau tiêm phòng vi khuẩn.Vi khuẩn máu, gan, lách nhóm cá sử dụng với aVIgY thấp cá sử dụng với nspIgY Điều trị với aVIgY việc giảm hoại tử khối u yếu tố-a (PaTNF-a), interleukin-1b (PaIL-1b), phát triển di -b (PaTGF-b), bạch cầu tế bào có nguồn gốc từ chemotaxin-2 (PaLECT2) cấp tính thận, đầu, lách gan ayu thách thức V anguillarum so với điều trị nspIgY Các hoạt động thực bào đại thực bào V anguillarum diện Specffic IgY cho thấy cao với nonspecific IgY Những kết cho thấy việc tiêm chủng thụ động cách đặt nội khí quản thông qua đường miệng với tác nhân gây bệnh Specific IgY gọi cách điều trị quan trọng V anguillarum nhiễm cá Giới thiệu Ayu (cá ngọt) tên khoa học Plecoglossus altivelis, thành viên Osmeriformes họ Plecoglossidae, loài cá quan trọng nghành nuôi trồng thủy sản Nhật Bản, Trung Quốc Hàn Quốc Bệnh vi khuẩn có nguyên nhân gây thiệt hại ngành công nghiệp châu Á, với Vibrio anguillarum identified tác nhân gây nên mầm bệnh có hại Trong mười năm qua, nuôi trống ayu có triển vọng tăng Trung Quốc, bệnh V anguillarum đặt mối đe dọa nghiêm trọng Thuốc kháng sinh sử dụng rộng rãi để điều trị vi khuẩn gây bệnh lây nhiễm động vật thủy sản nhiều năm Tuy nhiên, kháng sinh lạm dụng góp phần vào việc gia tăng số lượng loài vi khuẩn trở nên đề kháng với thuốc kháng khuẩn, vấn đề nan giải toàn giới Để giảm nguy lạm dụng kháng sinh, số biện pháp thay khám phá áp dụng nuôi trồng thủy sản , bao gồm việc sử dụng kháng sinh pep-IDEs, áp dụng chế phẩm sinh học, immunostimulation , tiêm phòng [11,12], kháng thể lòng đỏ trứng gà mmunoglobulins (IgY) Kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) kháng thể tìm thấy gà với số lượng lớn, tích cực vận chuyển đến trứng cách tương tự chuyển qua thai IgG động vật có vú Như thụ động, không tốn kém, dễ dàng sản xuất kháng thể, IgY thu hút nhiều ý công nhận giải pháp điều trị phòng ngừa bệnh khác IgY thân thiện với môi trường tác dụng phụ, bệnh kháng, dư lượng độc hại gà lẫn trứng Các nghiên cứu làm sáng tỏ thành công hiệu bảo vệ Specific IgYs chống lại loạt mầm bệnh vi khuẩn động vật có vú Ví dụ, Specific trứng gà IgYs sử dụng bò bị viêm chống Escherichia coli Staphylococcus aureus Trong nuôi trồng thủy sản, IgYs trứng gà sử dụng cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) chống Yersinia ruckeri V anguillarum, tôm Cray fish (Procambius clarkiaii) (Penaeus chinensis) chống lại WSSV, bào ngư nhỏ (Haliotis diversicolor supertexta) chống lại vi khuẩn Vibrio alginolyticus Các IgY nghiên cứu cho thấy hiệu bảo vệ liều lượng phụ thuộc thời gian chống lại nhiễm trùng Tuy nhiên, nghiên cứu thêm cần thiết để hiểu rõ chế bảo vệ IgY Trong nghiên cứu này, tác động kháng V anguillarum IgY tỷ lệ tử vong vi khuẩn mô cytokine gen biểu ayu, thách thức V anguillarum xác định Hoạt động đại thực bào cho V anguillarum diện specific IgY đánh giá Vật liệu phương pháp 2.1 Chuẩn bị kháng nguyên V.anguillarum ayu-H080701 phân lập từ bệnh ayu sử dụng nghiên cứu V anguillarumwere nuôi cấy qua đêm tách cách ly tâm, rửa sạch, tăng sinh môi trường nuôi cấy chứa muối (0,9 w / v NaCl) với mật độ 108 CFU / ml.Thêm Formaldehyde vào nồng độ 0,5% (v / v), suspensionwas ủ khoảng 370 C 24 h Tế bào rửa hai lần với dung dịch muối vô trùng để loại bỏ formaldehyde lơ lửng muối vô trùng Toàn V anguillarum đem nuôi cấy huyền phù Vi khuẩn bảo quản khoảng 0C trước sử dụng 2.2 Phát triển kháng thể kháng V.anguillarum gà Tất thử nghiệm thực theo thực nghiệm Luật Quản lý tâm thần động vật Trung Quốc chấp thuận Ủy ban Đạo đức Đại học Ningbo Một nhóm HyLine Gà đẻ màu trắng, 24 tuần tuổi, giữ cho tiêm chủng sản xuất trứng Trung tâm thiết bị vật Đại học Ningbo.V anguillarum pha loãng đến 108 CFU / ml NaCl vô trùng 0,9% (w / v) Gà tiêm bắp ngực với 0,5 ml dịch chứa kháng nguyên trộn với lượng tá dược( Freund) cho tiêm chủng Sau tiêm chủng ban đầu, hai mũi tiêm tăng cường thêm mỗigồm 0,25 ml dịch chứa kháng nguyên trộn với bằngkhối lượng không đầy đủ chất bổ trợ Freund đưa vào ngày 10 20 Trứng sau thu gom hàng ngày từ tiêm chủng gà mái bảo quản 0C sử dụng 2.3 Phân lập tinh chế IgY Tách IgY thực cách kết tủa muối(ammonium sulphate dạng rắn) sau ly tâm lọc Tiếp theo, lòng đỏ trứng tách khỏi lòng trắng, trộn với nước vô trùng, đông lạnh 200 C qua đêm Hỗn hợp sau rã đông, ly tâm 2500G (40 C, 45 phút) cặn bỏ đi.Thu dịch phía thêm ammonium sulphate (lên đến 40 %) Sau 18 40 C, ly tâm 5000G (40 C, 45 phút), dịch bỏ Các viên lơ lửng với PBS thẩm tách với PBS Kháng thể kháng V anguillarum IgY (aVIgY) chiết xuất từ trứng tiêm chủng, finonspecic IgY(nspIgY) chiết xuất từ kiểm soát Độ tinh khiết IgY đãđiều tra natrisulfat dodecylgel polyacrylamide điện di (SDS-PAGE) điều kiện giảm cách sử dụng 5%stacking gel running gel 12% Các gel nhuộm với Coomassie blue giải pháp nhuộm R-250 (Bio-Rad Labo-ratories, Hercules, CA, USA) 2.4 Cá Cá trưởng thành nặng 20-25 g thu từ bể bệnh trì cung cấp bể với nước lọc 20-220 C Cá cho ăn loại thức ăn thương mại cho cá 2.5 Gây nhiễm Liều gây chết 50% (LD50) V anguillarum ayu-H080701 xác định khoảng 5,4 105 CFU / kg cá nghiên cứu Hai Nồng độ (100 mg / kg 200 mg / kg) aVIgY nspIgY thông qua miệng vào khí quản để ayu tiêm vào màng bụng (ip), đồng thời với 1,2 104 CFU V anguillarum cá Sự khác biệt nhóm ayu mà không cần điều trị IgY tiêm ip với V anguillarum Tỷ lệ mắc bệnh theo dõi ngày sau nhận, kết ghi lại 24 h Để xác định thời gian điều trị aVIgY, mg aVIgY thông qua miệng vào khí quản để Ayu trước sau tiếp nhận vi khuẩn Đối với điều này, hai nhóm ayu tiêm ip với 1,2 104 CFU V anguillarum cá 14 ngày sau điều trị aVIgY Hai nhóm bổ sung Ayu đặt nội khí quản qua đường miệng với mg aVIgY cá d sau tiêm Một nhóm Ayu tiêm ip với V anguillarum mà không cần điều trị IgY Tình trạng bệnh tật theo dõi ngày sau nhận, kết ghi lại 24 h 2.6 Phân tích vi khuẩn chủ yếu aVIgY nspIgY 200 mg / kg đặt vào khí quản qua đường miệng để Ayu tiêm ip đồng thời với V anguillarum Một vi khuẩn chịu trách nhiệm thực mô tả [2.4] trước Một thời gian ngắn, máu, gan, lách, thận đầu thu hoạch vô trùng từ ayu lúc 24 h sau nhiễm (hpi) Mỗi gan, lách, đầu thận đồng ml vô trùng PBS (pH7.2) Homogenates máu pha loãng vô trùng PBS (pH7.2) cấy lên đĩa thạch LuriaeBertani riêng biệt Sau ủ 18 28 C, khuẩn lạc tính riêng cho mẫu Gan, lách, thận đầu mẫu chuẩn hóa để cân tạng, mẫu máu bình thường hóa với thể tích máu 2.7 Thay đổi biểu cytokine mRNA liên quan đến IgY aVIgY nspIgY với 200 mg / kg đặt vào khí quản thông qua đường miệng để Ayu tiêm ip đồng thời với 1,2 104 CFU V anguillarum cá Hai nhóm khác ayu tiêm ip với 1,2 104 CFU V anguillarum khối lượng nước muối cá, mà không cần điều trị IgY Gan, thận, lách thu thập vô trùng 12 hpi, đông lạnh nitơ lỏng, bảo quản - 700 C sử dụng Những thay đổi mRNA PaTNF-a, PaIL-1b, PaTGF-b, and PaLECT2 biểu ayu gan, thận, lách xác định thời gian thực PCR định lượng (RT-qPCR) mô tả trước [25] Mồi cụ thể thiết kế theo trình tự PaTNF-a, PaIL-1b, PaTGF-b, and PaLECT2 bảng Trong qúa trình PCR, mồi pActin2F pActin2R sử dụng để khuếch đại đoạn gene khoảng231- bp b-actin mRNA [26,27] Một ml phản ứng phiên mã ngược khuôn mẫu cho 25 ml RT-qPCR phản ứng cách sử dụng SYBR premix Ex Taq (Perfect Bất Thời gian) (Takara) RT-qPCR thực cách sử dụng RT-CYCLER (tm) Realtime PCR huỳnh quang định lượng (CapitalBio, Bắc Kinh, Trung Quốc) với bước biến tính ban đầu 95 C phút, khuếch đại cDNA mục tiêu (35 chu kỳ biến tính 95 C 30 s, ủ 580 C 30 s, mở rộng 72 0C cho 30 s) Các biểu mRNA PaTNF-a, Xô-1b, PaTGF-b, Gen PaLECT2 bình thường biểu b-actin 2.8 Khảo nghiệm thực bào đại thực bào Đa số tế bào Ayu có nguồn gốc thận phân lập nuôi theo báo cáo trước [26] Một thời gian ngắn, thận vô trùng chiết xuất, thu thập, kếtt hợp với RPMI 1640 (Invitrogen, Thượng Hải, Trung Quốc) có bổ sung 2% huyết bào thai bò (FBS) (Invitrogen), penicillin (100 U ML1 ), Streptomycin (100 mg ML1), Và heparin (20 U ML1 ) Sau ly tâm, tế bào thu thập từ interphase, rửa sạch, hòa tan RPMI 1640 có bổ sung 0,1% FBS kháng sinh tế bào sau cấy vào giếng 35mm mật độ 107 tế bào ủ qua đêm 240 C với 5% CO2 Các tế bào huyền phù rửa sau ủ qua đêm Các thành phần thay đổi để phù hợp (4% ayu huyết thanh, 6% FBS, 100 U ML1 penicillin, 100 mg ML1 streptomycin), tế bào sót lại lồng ấp điều kiện Trước nhiễm trùng, vừa đổi kháng sinh miễn phí tế bào trung bình ủ thêm 12 h Các tế bào điều trị aVIgY nspIgY (ở nồng độ cuối mg / ml), bị nhiễm FITC-dán nhãn V anguillarum đa dạng nhiễm trùng (MOI) 10 Các tế bào thu hoạch 30 phút sau nhiễm Các vi khuẩn chìm kiểm tra huỳnh quang kính hiển vi (600 phóng đại; Nikon Eclipse tiu, Tokyo, Nhật Bản) Cường độ trung bình huỳnh quang (MFI) vi khuẩn nhấn chìm tế bào nspIgY- nhóm aVIgY-điều trị phân tích chương trình NIH ImageJ, 400tế bào tính cho xét nghiệm độc lập Kết thể MFI phần trăm kiểm soát là trung bình SEM ví dụ điển hình từ ba thí nghiệm độc lập 2.9 Phân tích thống kê Kết phân tích theo phương pháp SEM Tất liệu phải thực chiều lặp lặp lại theo phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) với SPSS (phiên 13.0, Chicago, IL, USA), sau phương pháp so sánh giá trị trung bình (LSD) kiểm tra nhóm chất riêng biệt Phương pháp KaplaneMeier sử dụng để phân tích tồn Sự khác biệt coi đáng kể mặt xác suất thống kê (P) [...]... lý aVIgY dẫn đến vi c giảm các vi khuẩn số và biểu hiện cytokine vi m trong mô cá, và tăng cường các hoạt động thực bào của các đại thực bào chống lại V anguillarum trong ống nghiệm Cơ chế tác dụng bảo vệ của IgY cụ thể trong vi c nhiễm vi khuẩn có khả năng diệt khuẩn của nó dựa trên (hoặc kìm khuẩn) tác động lên một mầm bệnh nhất định và một vai trò tiềm năng trong quy định của hệ thống miễn dịch của. .. năng trong quy định của hệ thống miễn dịch của cá Như vậy, cụ thể IgY tiêm chủng phải là một an toàn, chi phí-hiệu quả, và dễ dàng thực hiện kỹ thuật để kiểm soát nhiễm khuẩn trong nuôi trồng thủy sản Lời cảm ơn Dự án được tài trợ bởi Chương trình cho Quốc Khoa học tự nhiên Foundation của Trung Quốc (31372555), tỉnh Chiết Giang Khoa học Foundation tự nhiên của Trung Quốc (LZ13C190001, LQ13C190002), Chiết... tỉnh Chiết Giang Khoa học Foundation tự nhiên của Trung Quốc (LZ13C190001, LQ13C190002), Chiết Giang Marine đội Innovation Công nghệ sinh học (ZMBIT) (2010R50029-16), Chương trình dành cho các khoa học tự nhiên Nền tảng của thành phố Ninh Ba (2013A610166) và KC Wong Magna Quỹ tại Đại học Ningbo ... tả động vật thủy sản [30e32] Trong nghiên cứu này, kháng thể lòng đỏ trứng gà chống V anguillarum sản xuất, tác dụng bảo vệ cá nhiễm vi khuẩn nghiên cứu Tiêm chủng chứng minh hiệu vi c chống lại. .. gồm vi c sử dụng kháng sinh pep-IDEs, áp dụng chế phẩm sinh học, immunostimulation , tiêm phòng [11,12], kháng thể lòng đỏ trứng gà mmunoglobulins (IgY) Kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) kháng thể. .. dụng IgY cụ thể cách tiếp cận hấp dẫn cho thiết lập khả miễn dịch bảo vệ chống lại vi khuẩn gây bệnh này, Tuy nhiên, thời gian điều trị quan trọng để bảo vệ hiệu Mặc dù cá tự sản xuất kháng thể