Tác dụng bảo vệ thần kinh của cao chiết giàu flavonoid từ lá hồng (diospyros kaki) trên mô hình đột quỵ não thực nghiệm

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ HẠNH TÁC DỤNG BẢO VỆ THẦN KINH CỦA CAO CHIẾT GIÀU FLAVONOID TỪ LÁ HỒNG (DIOSPYROS KAKI) TRÊN MÔ HÌNH ĐỘT QUỲ NÃO THỰC NGHIỆM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ HẠNH MSV: 1301123 TÁC DỤNG BẢO VỆ THẦN KINH CỦA CAO CHIẾT GIÀU FLAVONOID TỪ LÁ HỒNG (DIOSPYROS KAKI) TRÊN MƠ HÌNH ĐỘT QUỲ NÃO THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Lê Thị Xoan TS Hà Vân Oanh Nơi thực hiện: Bộ môn Dƣợc học cổ truyền Viện Dƣợc liệu HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập, rèn luyện, thực khóa luận Viện Dược Liệu trường Đại học Dược Hà Nội, em nhận giúp đỡ nhiệt tình từ thầy cơ, anh chị, gia đình bạn bè Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: TS Lê Thị Xoan – Khoa Dược lý, Sinh hóa, Viện Dược liệu – người chị, người thầy ln nhiệt tình bảo, giúp đỡ em thực đề tài TS Hà Vân Oanh – Bộ môn Dược học cổ truyền – tạo điều kiện để em tham gia thực khóa luận ln hết lòng giúp đỡ, đóng góp ý kiến q báu để em hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán Khoa Dược lý, Sinh hóa Khoa Hóa thực vật I – Viện Dược liệu nhiệt tình giúp đỡ cho em lời động viên, khích lệ lúc khó khăn làm thực nghiệm Em chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội trang bị cho em kiến thức quý báu năm học qua Do trình độ thân hạn chế nên khơng thể tránh khỏi sai sót khóa luận Vì vậy, em mong nhận ý kiến đóng góp thầy để khóa luận hồn thiện Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Đặng Thị Hạnh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đột quỵ não 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Yếu tố nguy 1.2 Đột quỵ thiếu máu não cục 1.2.1 Đặc điểm phân bố máu động mạch não 1.2.2 Đặc điểm sinh lý tuần hồn chuyển hố não 1.2.3 Cơ chế bệnh sinh 1.2.4 Vùng nửa tối thiếu máu não cục 1.2.5 Điều trị 1.2.6 Mơ hình thiếu máu não cục 1.3 Tổng quan hồng 10 1.3.1 Mô tả 10 1.3.2 Phân bố 10 1.3.3 Bộ phận dùng, công dụng 10 1.3.4 Thành phần hóa học 11 1.3.5 Tác dụng dược lý 13 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1 Nguyên liệu 17 2.1.2 Động vật thí nghiệm 17 2.1.3 Hóa chất, trang thiết bị 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Định lượng flavonoid cao chiết ethanol 70% cao chiết giàu flavonoid 19 2.2.2 Đánh giá tác dụng dược lý 22 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28 3.1 Định lượng flavonoid cao chiết ethanol 70% cao chiết giàu flavonoid từ hồng 28 3.1.1 Sắc kí đồ mẫu chuẩn mấu thử 28 3.1.2 Xây dựng đường chuẩn định lượng kaempferol cao chiết hồng 28 3.1.3 Xây dựng đường chuẩn định lượng quercetin cao chiết hồng 29 3.1.4 Kết định lượng flavonoid cao chiết hồng 30 3.2 Tác dụng bảo vệ thần kinh cao chiết hồng thực nghiệm 31 3.2.1 Ảnh hưởng cao chiết hồng mức độ thiếu hụt thần kinh vận động 31 3.2.2 Xác định mức độ nhồi máu não chuột phương pháp nhuộm 2,3,5tripphenyltetrazolium chloride (TTC) 33 BÀN LUẬN 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACAT Acyl CoA – cholesterol acyl transferase AST Aspartate transamiase CAT Catalase CCA Động mạch cảnh chung (Common carotid artery) CK DKE70 DKF Creatine kinase Cao chiết khô ethanol 70% từ hồng Cao chiết khô giàu flavonoid từ hồng DKF100 Lô chuột MCAO xử lý với mẫu thử liều 100 mg/kg DKF DKF50 Lô chuột MCAO xử lý với mẫu thử liều 50 mg/kg DKF ECA Động mạch cảnh (External carotid artery) FDA Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) GSH HMG-CoA HPLC i.v Glutathione Hydroxymethylglutaryl coenzym High Performance Liquid Chromatography Đường tiêm tĩnh mạch ICA Động mạch cảnh (Internal carotid artery) LDH Lactase dehydrogenase MCA Động mạch não (Middle cerebral artery) MCAO Thuyên tắc động mạch não MDA Malondiadehyde NXQ Cao chiết chuẩn hóa từ hồng (Naoxinqing) p.o ROS r-TPA, tPA Đường uống Reactive oxygen species Human tissue-type plasminogen activator SOD Superoxide dismutase TIA Cơn thiếu máu não thoáng qua TTC 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride WHO Tổ chức Y tế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cây hồng, Lá hồng 10 Bảng 1.2 Các flavonoid hồng 11 Bảng 2.1 Các lô chuột tiến hành thử tác dụng dược lý 24 Bảng 3.1 Kết xây dựng đường chuẩn theo kaempferol 28 Bảng 3.2 Kết xây dựng đường chuẩn theo quercetin 29 Bảng 3.3 Kết định lượng flavonoid DKE70 31 Bảng 3.4 Kết định lượng flavonoid DKF 31 Bảng 3.5 Điểm đánh giá tổn thương thần kinh 32 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức flavonoid [40] 12 Hình 1.2 Cơng thức terpenoids[40] 12 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng dược lý DKF 22 Hình 2.2 Sợi monofilament gây tắc động mạch não 25 Hình 2.3 Vị trí cắt để thu lấy lát cắt não nhuộm TTC 27 Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC phân tích định lượng flavonoid tổng số cao chiết hồng (A) Cao hồng DKF sau thủy phân; (B) Quercetin; (C )Kaempferol 28 Hình 3.2 Đường chuẩn xác định kaempferol 29 Hình 3.3 Đường chuẩn xác định quercetin 30 Hình 3.4 Hình ảnh đặc trưng lát cắt não nhóm chuột nghiên cứu nhuộm TTC Vùng màu trắng vùng nhồi máu 33 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ % nhồi máu não chuột 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày đột quỵ vấn đề thời cấp thiết y học quốc gia, dân tộc giới Tỷ lệ tử vong đột quỵ đứng thứ top 10 nguyên nhân gây tử vong sau nhồi máu tim [37] Khoảng số 1.000 người bị đột qụy đời [29] Trên giới, vào năm 2013, có 6,5 triệu người chết đột quỵ [38] Tại Mỹ, đột quỵ giết chết khoảng 140.000 người 795.000 bị đột quỵ năm Cứ 40 giây lại có trường hợp đột quỵ não cấp phút lại có trường hợp tử vong đột quỵ não [18], [38] Tại Việt Nam, năm có khoảng 200.000 người mắc đột quỵ, khoảng 50% số tử vong Đột quỵ thường xảy “bất ngờ” để lại hậu vơ nặng nề có tới 90% bệnh nhân phải gánh chịu di chứng sau đột quỵ liệt nửa người, liệt toàn thân, bại não, biến chứng tâm lý, tâm thần [1] Đột quỵ gồm hai thể: thiếu máu não cục (ischemic stroke) xuất huyết não (hemorrhagic stroke) thiếu máu não cục chiếm 87%, xuất huyết não 13% [21] Điều trị đột quỵ não sớm tổn thương di chứng để lại giảm thiểu Mỗi thể có cách điều trị khác Thiếu máu não cục xảy cục máu đông chặn mạch máu cung cấp máu cho não Đây loại phổ biến Mục tiêu điều trị làm tan loại bỏ cục máu đông [12] Cho đến nay, liệu pháp điều trị hạn chế chưa tối ưu Do đó, việc nghiên cứu phát triển liệu pháp điều trị đột quỵ não cần thiết Các thuốc từ thảo dược với thành phần hóa học đa dạng, đa mục tiêu, đạt hiệu đáng kể với bệnh phức tạp nhồi máu não Cây hồng, có tên khoa học Diospyros kaki L.f ăn lâu năm trồng phổ biến khu vực Đông Nam Á Nghiên cứu gần chứng minh cao chiết ethanol 70% từ hồng có tác dụng làm giảm tổn thương thần kinh chuột gây đột quỵ não thực nghiệm phương pháp làm tắc động mạch não (middle cerebral artery occlusion, MCAO) [18] Theo tài liệu công bố giới, thành phần flavonoid từ hồng chứng minh có tác dụng tác dụng chống oxi hóa, giãn mạch, hạ lipid máu, kháng viêm đặc biệt tác dụng chống đột quỵ thiếu máu theo chế kháng viêm bảo vệ tế bào nội mạc [39] Bảng 3.3 Kết định lượng flavonoid DKE70 Quercetin Kaempferol Khối lượng cao Diện tích pic Hàm lượng Diện tích pic Hàm lượng (mg) (mV.s) (%) (mV.s) (%) 1322176 125,2 0,768 0,729 1399001 1398166 125,1 0,812 0,784 1512145 1413326 125,2 0,820 0,754 1451022 1251479 124,8 0,730 0,850 1645133 1241062 125,5 0,720 0,863 1682138 1184113 124,7 0,692 0,836 1614705 Trung bình 0,757 0,803 SD 0,052 0,055 Flavonoid tổng số (%) 3,847 4,101 4,044 4,063 4,071 3.930 4,009 0,114 Bảng 3.4 Kết định lượng flavonoid DKF Khối Kaempferol lượng Diện tích pic Hàm lượng cao (mV.s) (%) (mg) 125,3 7989497 4,568 125,2 7774509 4,449 124,8 7655241 4,395 125,5 7422453 4,238 125,0 7359534 4,219 125,2 7355572 4,210 Trung bình 4,347 SD 0,147 Quercetin Diện tích pic (mV.s) 8651516 8609143 9189002 8832380 9407514 9437321 Hàm lượng (%) 4,211 4,194 4,487 4,291 4,585 4,592 4,393 0,184 Flavonoid tổng số (%) 22,555 22,207 22,829 21,921 22,634 22,629 22,462 0,334 Hàm lượng flavonoid DKF ~ 5,6 lần so với DKE70 3.2 Tác dụng bảo vệ thần kinh cao chiết hồng thực nghiệm 3.2.1 Ảnh hưởng cao chiết hồng mức độ thiếu hụt thần kinh vận động Điểm đánh giá tổn thương thần kinh chuột thời điểm rút sợi monofilament gây tắc động mạch não (tái tưới máu não) (ngày 0) ngày sau phẫu thuật 30 MCAO kế tiếp, thời điểm sau 24 ± lúc tái tưới máu não trình bày bẳng dạng m (a,b) với m trung vị, a tứ phân vị thứ nhất, b tứ phân vị thứ Bảng 3.5 Điểm đánh giá tổn thương thần kinh Thời điểm đánh giá tổn thương thần kinh sau phẫu thuật MCAO Lô n Bệnh lý 10 DKF50 10 DKF100 Edaravon 6,0 mg/kg 10 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 2.5 3 3 (3,75;4) (2;3) (3;3) (2;3) (2;3) (2;4) (2;4) 3 2 1,5* (3;4) (3;3) (3;3) (2;3) (1;4) (1;3) (1;2,75) 2* 1,5* 1.5* 1* (3,25;4) (1,25;2,75) (1,25;2,75) (1;3) (1;2,75) (1;3) (1;3) 2* 2* 2* 1* (4;4) (2;3) (1;3) (1;3) (1;3) (1;3) (0,5;3) Số liệu biểu thị dạng trung vị (tứ phân vị thứ nhất; tứ phân vị thứ 3) *p < 0,05 với nhóm chứng bệnh lý (Kruskall-Wallis Mann-Whitney U-test) Nhận xét: - Lơ chứng bệnh lý có điểm tổn thương thần kinh cao từ ngày − - Lô chứng dương (chuột MCAO xử lý với edaravon i.v) có điểm tổn thương thần kinh thấp lô bệnh lý đạt ý nghĩa thống kê vào ngày thứ 2, 3, 5, - Lô DKF50 (chuột MCAO xử lý với cao chiết hồng giàu flavonoid liều 50 mg/kg p.o) cải thiện chức thần kinh qua ngày so với lô bệnh lý đạt ý nghĩa thống kê vào ngày thứ - Lô DKF100 (chuột MCAO xử lý với cao chiết hồng giàu flavonoid liều 100 mg/kg) cải thiện chức thần kinh rõ rệt qua ngày đạt ý nghĩa thống kê vào ngày thứ 2, 3, 4, Tác dụng cải thiện chức thần kinh cao chiết hồng phụ thuộc theo liều 31 3.2.2 Xác định mức độ nhồi máu não chuột phương pháp nhuộm 2,3,5triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sau ngày gây đột quỵ phương pháp MCAO, thể tích nhồi máu não xác định phương pháp nhuộm TTC Bệnh lý DKF50 DKF100 Edaravon Hình 3.4 Hình ảnh đặc trưng lát cắt não nhóm chuột nghiên cứu nhuộm TTC Vùng màu trắng vùng nhồi máu *p