Nghiên cứu một số đặc trưng của chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Ngô Thị Huyền Trang NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TRƯNG CỦA CHẾ PHẨM ARABINOXYLAN TẠO RA TỪ CÁM GẠO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Ngô Thị Huyền Trang NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TRƯNG CỦA CHẾ PHẨM ARABINOXYLAN TẠO RA TỪ CÁM GẠO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS PHAN TUẤN NGHĨA Hà Nội - 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 Arabinoxylan nguồn nguyên liệu cám gạo .2 1.1.1 Giới thiệu chung arabinoxylan .2 1.1.2 Cấu tạo arabinoxylan 1.1.3 Chức sinh học arabinoxylan 1.1.4 Nguyên liệu cám gạo chứa arabinoxylan 1.2 Enzyme endoxylanase phương pháp tách chiết arabinoxylan 1.2.1 Giới thiệu chung enzyme endoxylanase .8 1.2.2 Các phương pháp tách chiết arabinoxylan 10 1.3 Các nghiên cứu định tính định lượng arabinoxylan .12 1.3.1.Thủy phân arabinoxylan thành monosaccharide 13 1.3.2 Phân tích định tính arabinoxylan .14 1.3.3 Phân tích định lượng arabinoxylan 14 1.4 Các nghiên cứu tinh xác định khối lượng phân tử arabinoxylan 18 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên liệu 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu .20 2.2.1 Thủy phân arabinoxylan thành monosaccharide 20 2.2.2 Phân tích định lượng arabinoxylan kit D-xylose kit Arabinan 21 2.2.2.1 Xác định hàm lượng D-xylose có arabinoxylan sau đươc thủy phân D-xylose kit [60] 21 2.2.2.2 Xác định hàm lượng L-arabinose có arabinoxylan sau đươc thủy phân Arabinan kit [59] 23 2.2.3 Phân tích định tính arabinoxylan phương pháp sắc ký mỏng 25 2.2.4 Tinh cô đặc mẫu màng lọc có kích thước lỗ xác định 26 2.2.5 Đánh giá tỷ lệ kích thước arabinoxylan phương pháp sắc ký lọc gel.26 2.2.6 Xác định độ ẩm 28 2.2.7 Xác định hàm lượng nitơ tổng số phương pháp Kjeldahl [2] 29 2.2.8 Xác định hàm lượng asen 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Xây dựng quy trình định tính định lượng arabinoxylan 30 3.1.1 Thủy phân arabinoxylan acid định tính, định lượng arabinoxylan30 3.1.2 Thủy phân arabinoxylan enzyme xylanase định tính, định lượng arabinoxylan .35 3.2 Phân tích số tính chất chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo .40 3.2.1 Xác định khối lượng phân tử chế phẩm arabinoxylan 40 3.2.2 Xác định độ ẩm chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo45 3.2.3 Xác định hàm lượng protein tổng số chế phẩm arabinoxylan .46 3.2.4 Xác định hàm lượng asen chế phẩm arabinoxylan 46 KẾT LUẬN .47 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO .48 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT AX Arabinoxylan A340 Độ hấp thu bước sóng 340 nm EtOH Ethanol kDa Kilodalton HPSEC Sắc ký chọn lọc theo kích thước phân tử hiệu cao (High Performance Size Exclusion Chromatography) KLPT Khối lượng phân tử β-D-Xylp β-D-xylopyranosyl α -L-Araf α-L-arabinofuranosyl XOS Xylan-oligosaccharide DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần hợp chất thành tế bào số hạt ngũ cốc……….4 Bảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng số ngũ cốc…………………………….8 Bảng 2.1: Thành phần phản ứng định lượng D-xylose D-XYLOSE KIT22 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng định lượng L-arabinose ARABINAN KIT………………………………………………………………….24 Bảng 3.1: Kết định lượng D-xylose L-arabinose sau thủy phân arabinoxylan thương mại axit……………………………………………… 31 Bảng 3.2: Kết định lượng D-xylose sau thủy phân mẫu chứa arabinoxylan axit………………………………………………………………………… 32 Bảng 3.3: Kết định lượng L-arabinose sau thủy phân mẫu chứa arabinoxylan axit………………… …………………………………………32 Bảng 3.4: Hàm lượng arabinoxylan có mặt chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo thủy phân axit……………………………………………… 33 Bảng 3.5: Kết định lượng D-xylose L-arabinose sau thủy phân arabinoxylan thương mại enzyme xylanase………………… …………… 35 Bảng 3.6: Kết định lượng D-xylose sau thủy phân chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo enzyme xylanase………………………………………… 36 Bảng 3.7: Kết định lượng L-arabinose sau thủy phân chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo enzyme xylanase….……………………… 36 Bảng 3.8: Hàm lượng arabinoxylan chế phẩm tạo từ cám gạo thủy phân enzyme…………………………………………………………………37 Bảng 3.9: Khối lượng phân tử arabinoxylan tách sắc ký lọc gel Sephadex G-100……………………………………………………………… …43 Bảng 3.10: Khối lượng hộp mẫu sau sấy đến khối lượng không đổi…………………………………………………………………………………45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc đơn vị arabinoxylan……………………………………5 Hình 1.2: Cấu trúc arabinoxylan ngũ cốc……………………………………….6 Hình 1.3: Cấu trúc phân tử arabinoxylan………………………………………… Hình 1.4: Cấu trúc họ endoxylanase 10 11………………………………….9 Hình 1.5: Sự phân loại arabinoxylan theo khả hòa tan…………………… 11 Hình 1.6: Vị trí cắt hoạt động endoxylanase………………………………………12 Hình 1.7: Vị trí hoạt động endo-1,4-β -ᴅ-xylanase phân tử arabinoxylan13 Hình 3.1: Kết sắc ký mỏng chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo sau thủy phân axit………………………………………………………34 Hình 3.2: Kết sắc ký mỏng chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo sau thủy phân enzyme xylanase……………………………………….38 Hình 3.3: Tóm tắt quy trình phân tích định tính, định lượng arabinoxylan……………….………………………………………………………39 Hình 3.4: Đồ thị tương quan khối lượng phân tử thể tích rửa chiết chất chuẩn qua sắc ký lọc gel Sephadex G-100……………………………… …41 Hình 3.5: Đồ thị minh họa giá trị A340 phân đoạn rửa chiết từ đến 70 qua sắc ký lọc gel Sephadex G-100………………………………………………… 42 Hình 3.6: Kết sắc ký mỏng sau thủy phân phân đoạn rửa chiết arabinoxylan………………………………………………………………………44 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang MỞ ĐẦU Arabinoxylan (AX) polysaccharide cấu tạo từ hai đường arabinose xylose có kích thước phân tử lớn lên đến hàng trăm, hàng nghìn kDa thường sử dụng làm thực phẩm chức tương đối phổ biến giới AX thể hoạt tính miễn dịch, phòng chống ung thư, có ưu vượt trội so với hoạt chất gây kích thích miễn dịch khác có nguồn gốc tự nhiên sử dụng với chức tăng cường miễn dịch cho bệnh nhân nhiễm HIV, viêm gan ung thư Hiện giới có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức chứa AX thực tế cho thấy chế phẩm bán với giá cao, nữa, thành phần cụ thể hàm lượng AX chế phẩm không nhà sản xuất cung cấp cách rõ ràng Trong AX lại tách chiết từ phụ phẩm nông nghiệp rẻ tiền ngũ cốc, mày ngô, hay phổ biến từ cám gạo, nguyên liệu sẵn có nước nông nghiệp Việt Nam Một số nhóm nghiên cứu nước bắt đầu nghiên cứu tạo chế phẩm AX từ nguồn nguyên liệu sẵn có nông nghiệp cám gạo mở hội cho người tiêu dùng sử dụng AX với giá hợp lý Vì vậy, việc thiết kế quy trình định tính, định lượng AX chế phẩm cách hiệu nghiên cứu số đặc trưng chế phẩm cần thiết cho nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức chứa AX Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài “ Nghiên cứu số đặc trưng chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo” Khóa 2010 - 2012 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Arabinoxylan nguồn nguyên liệu cám gạo 1.1.1 Giới thiệu chung arabinoxylan Ở thực vật, polysaccharide chủ yếu tồn hai dạng: tinh bột phi tinh bột, hàm lượng chúng thay đổi tùy theo loài, loại tế bào giai đoạn sinh trưởng [15] Nhóm polysaccharide phi tinh bột bao gồm cellulose, hemicellulose, pectic polysaccharide phân loại chủ yếu dựa vào phương pháp sử dụng để tách chiết polysaccharide khả hòa tan chúng chiết kiềm Cellulose polymer cấu tạo đơn vị đường glucose, nối với liên kết β-(1→4) glycoside, gồm chất không hòa tan kiềm nhóm hợp chất hữu nhiều tự nhiên Nhóm hemicellulose bao gồm hợp chất xylan, arabinoxylan, β-glucan, galactan, xyloglucan… có khả hòa tan kiềm Các pectin bao gồm gốc acid polygalacturonic thành phần cấu tạo arabinan, galactan arabinogalactan [15] Cả cellulose hemicellulose có vai trò vật liệu để cấu trúc nên thành tế bào thực vật, thành phần cellulose tạo độ cứng rắn hemicellose tạo nên dẻo dai cho cấu trúc thành tế bào nhờ liên kết dọc với vi sợi cellulose [10] Các monosaccharide thường có thành tế bào ngũ cốc bao gồm hexose Dglucose, D-galactose, D-mannose; đường pentose L-arabinose, D-xylose đường acid acid D-galacturonic, acid D-glucuronic dạng eter 4-Omethyl chúng [15] Các xylan hemicellulose phổ biến tự nhiên polysaccharide phi tinh bột có nhiều thứ hai thể thực vật sau cellulose Các xylan phân chia thành nhóm [41]: Khóa 2010 - 2012 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang 3.2 Phân tích số tính chất chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo 3.2.1 Xác định khối lượng phân tử chế phẩm arabinoxylan Trước cho qua cột sắc ký lọc gel, chế phẩm arabinoxylan định lượng theo quy trình xác lập phần Các mẫu có nồng độ AX thấp (dưới 10 mg/ml) cô đặc màng lọc có kích thước lỗ 10 kDa Sử dụng màng lọc tinh AX cách loại bỏ chất có khối lượng phân tử nhỏ 30 kDa đường đơn xylose, arabinose, glucose… hay muối có chế phẩm sau chiết từ cám gạo Mẫu sau cô đặc định lượng AX để đảm bảo mẫu trước lên cột lọc gel có nồng độ khoảng 10 mg/ml cho lên cột lọc gel Sephadex G-100 Gel Sephadex G-100 nhồi vào cột có kích thước 1x60cm Dung dịch dextran (nồng độ mg/ml) xanh có KLPT 2000 kDa sử dụng để xác định tính thể tích trống cột V0 (ml) cột Hàm lượng dextran xanh sau rửa chiết khỏi cột đo độ hấp thụ bước sóng 620 nm (A620), từ tính giá trị V0, khoảng 14,7 ml, thể tích rửa chiết tính từ lúc dextran xanh cho lên cột thu giá trị A620 cực đại Các chất chuẩn (protein) có nồng độ mg/ml KLPT biết cho qua cột, rửa chiết thu riêng phân đoạn với thể tích phân đoạn khoảng 0,5 ml Các phân đoạn rửa chiết protein chuẩn đo độ hấp thụ protein bước sóng 280 nm để xác định phân đoạn chứa nhiều protein nhất, từ tính thể tích rửa chiết từ lúc bắt đầu nạp mẫu thu phân đoạn protein chuẩn cực đại, sau lập đồ thị tương quan logMw Ve/Vo protein chuẩn Khóa 2010 - 2012 40 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Hình 3.4: Đồ thị tương quan khối lượng phân tử thể tích rửa chiết chất chuẩn qua sắc ký lọc gel Các protein chuẩn bao gồm: Ovalbumin (45 kDa), Chymotrypsinogen A (25 kDa), chất ức chế trypsin hay chất ức chế Kunitz từ đậu tương (21 kDa), cytochrom c (12,4 kDa) Kết (hình 3.4) nói lên tương quan giữa logMw Ve/Vo protein chuẩn sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G-100 nghiên cứu Sau cột gel rửa sạch, ml chế phẩm arabinoxylan có nồng độ khoảng 10 mg/ml cho lên cột gel, rửa chiết thu phân đoạn vào ống riêng Kết thu tổng số 70 phân đoạn, phân đoạn tích khoảng 0,5 ml Các phân đoạn rửa chiết định lượng hàm lượng xylose arabinose, sau vẽ đồ thi minh họa giá trị A340 phân đoạn rửa chiết Khóa 2010 - 2012 41 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Hình 3.5: Đồ thị minh họa giá trị A340 phân đoạn rửa chiết từ đến 70 qua sắc ký lọc gel Sephadex G-100 Kết biểu diễn hàm lượng arabinoxylan phân đoạn hình 3.5 cho thấy, thu ba đỉnh sắc ký khác nhau, đỉnh I (các phân đoạn 35-42), đỉnh II (các phân đoạn 43-48), đỉnh III (các phân đoạn 50-54) Trên sở giá trị Ve đỉnh dựa vào đồ thị chuẩn thiết lập (hình 3.4) tính KLPT hay kích thước arabinoxylan tương ứng 41 kDa, 35 kDa 28,2 kDa (bảng 3.9) Khóa 2010 - 2012 42 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang ảng 3.9: Khối lượng phân tử arabinoxylan tách sắc ký lọc gel Sephadex G-100 Đỉnh sắc ký Thể tích rửa chiết (ml) Hàm lượng arabinoxylan (mg) Đỉnh I 20,10 Đỉnh II Đỉnh III Ve/V0 Mw (kDa) 2,883 1,37 41,0 23,82 2,352 1,62 35,0 28,12 2,387 1,91 28,2 Tổng hàm lượng arabinoxylan phân đoạn từ 35 đến 54: 7,622 mg chiếm 80,57% hàm lượng AX tổng số trước qua cột Hay nói cách khác, hiệu suất thu hồi chế phẩm sau sắc ký 80,57% Để khẳng định thêm có mặt xylose arabinose sau thủy phân phân đoạn rửa chiết qua cột, sử dụng phương pháp sắc ký mỏng silica gel (Các phân đoạn rửa chiết thủy phân thành xylose arabinose enzyme Porzyme) Khóa 2010 - 2012 43 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang 10 Hình 3.6: Kết sắc ký mỏng sau thủy phân phân đoạn rửa chiết AX Đường chạy 1: Đường chuẩn D-xylose Đường chạy 2: Đường chuẩn L-arabinose Đường chạy 3: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký III thủy phân Đường chạy 4: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký II thủy phân Đường chạy 5: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký I thủy phân Đường chạy 6: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký III chưa thủy phân Đường chạy 7: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký II chưa thủy phân Đường chạy 8: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký I chưa thủy phân Đường chạy 9: Phân đoạn rửa chiết từ 1-30 chưa thủy phân Đường chạy 10: AX trước qua cột Sephadex G-100 Kết sắc ký mỏng cho thấy phân đoạn rửa chiết qua cột (hình 3.6, đường chạy 3, 4, 5) sau thủy phân Porzyme cho hai băng rõ nét có vị trí tương tự vị trí đường xylose arabinose (hình 3.6, đường chạy 2), chứng tỏ phân đoạn rửa chiết có chứa AX Hơn nữa, chưa thủy phân phân đoạn rửa chiết qua cột tạo vệt sắc ký dài, không phân tách Khóa 2010 - 2012 44 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang thành băng riêng rẽ, chứng tỏ phân đoạn không chứa đường xylose arabinose tự Kết sắc silica gel cho thấy, sử dụng sắc ký lọc gel Sephadex G-100 cho phép loại bỏ số sản phẩm (mà acid hay xylanase thủy phân được) có lẫn chế phẩm arabinoxylan 3.2.2 Xác định độ ẩm chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo Arabinoxylan tạo từ cám gạo dạng bột xác định độ ẩm theo quy trình trình bày mục 2.2.6 Khối lượng hộp: m giá trị mo-mn tương ứng khối lượng hộp có chứa mẫu sau sấy n ngày Bảng 3.10: Khối lượng hộp mẫu sau sấy đến khối lượng không đổi Độ ẩm STT mo (g) m1 (g) m2 (g) m3 (g) m4 (g) m5 (g) tương đối (%) 25,21566 25,73341 25,68721 25,67841 25,67618 25,67614 11,06 25,98038 26,35956 26,32681 26,32036 26,31890 26,31891 10,72 25,21910 26,79677 26,63364 26,62958 26,63074 26,62746 10,73 23,84970 25,21241 25,15166 25,14922 25,14657 25,14655 11,31 25,98659 28,21436 28,11465 28,10267 28,10092 27,97245 10,86 Độ ẩm tương đối trung bình sau lần đo (%) 10,94 Kết xác định độ ẩm thu bảng 3.10 cho thấy, sau ngày sấy mẫu 105oC, mẫu có khối lượng ổn định sở khối lượng mẫu ban đầu lượng mẫu lại, tính độ ẩm chế phẩm arabinoxylan từ cám gạo 10,94% Khóa 2010 - 2012 45 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang 3.2.3 Xác định hàm lượng protein tổng số chế phẩm arabinoxylan Chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo dạng bột gửi đến Phòng Kiểm nghiệm hóa, Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội để xác định hàm lượng protein tổng số Kết xác định mẫu khác lấy trung bình cho thấy hàm lượng protein tổng số chế phẩm arabinoxylan 12,49 g% ± 0,43% Trong đó, chế phẩm BioBran thương mại sản xuất Công ty Daiwa Pharmaceutical có hàm lượng protein khoảng 8-15% 3.2.4 Xác định hàm lượng asen chế phẩm arabinoxylan Tương tự việc phân tích hàm lượng nitơ tổng số, chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo dạng bột gửi đến Phòng Kiểm nghiệm hóa, Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội để xác định hàm lượng asen, phương pháp thử theo TCVN 7770-2007 Kết thu chế phẩm arabinoxylan từ cám gạo chứa 0,31 mg asen/kg chế phẩm (0,31 ppm), thấp khoảng 10 lần so với chế phẩm BioBran thương mại sản xuất Công ty Daiwa Pharmaceutical có hàm lượng asen khoảng ppm [66] Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia QCVN 8-2:2011/BYT giới hạn ô nhiễm kim loại nặng thực phẩm không quy định mức giới hạn cho phép hàm lượng asen thực phẩm chức năng, nhiên so với thực phẩm khác hàm lượng asen cho phép khoảng 0,1-5 mg/kg tùy thuộc vào nhóm thực phẩm [67] Như vậy, chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo có hàm lượng asen mức giới hạn cho phép Khóa 2010 - 2012 46 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang KẾT LUẬN Từ kết thu trình nghiên cứu, rút số kết luận sau: Chế phẩm arabinoxylan từ cám gạo tạo từ đề tài ĐT.02.11/CNSHCB, Bộ Công thương có chứa khoảng 80% arabinoxylan với khối lượng phân tử nằm khoảng 30-50 kDa, độ ẩm khoảng 10,94%, hàm lượng protein tổng số 12,49 g% hàm lượng asen 0,31 mg/kg mẫu Bước đầu xây dựng quy trình phân tích định tính định lượng arabinoxylan, bao gồm bước: arabinoxylan thủy phân acid enzyme xylanase, sau xylose arabinose tạo thành phân tích phản ứng sử dụng enzyme đặc hiệu phân tích định tính đường tạo thành sắc ký mỏng, hàm lượng arabinoxylan tính sở nhân hàm lượng đường đơn tổng số xylose arabinose tạo thành với hệ số 0,88 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu số tính chất kích thích miễn dịch chế phẩm arabinoxylan từ cám gạo để dùng làm thực phẩm chức Khóa 2010 - 2012 47 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất giáo dục VIệt Nam, Hà Nội, tr 63-90 Nguyễn Quang Vinh, Bùi Phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Thực tập hóa sinh học, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội, tr 25-30 Tài liệu tiếng Anh: Bacic, A., Stone, B A (1981), “Chemistry and organization of aleurone cell wall components from wheat and barley”, Aust J Plant Physiol., 8, pp 475495 Bastawde, K B (1992), “Xylan structure, microbial xylanases, and their mode of action”, World J Microbiol Biotechnol., 8, pp 353 -368 Bataillon, M., Mathaly, P., Nunes Cardinali, A P., Duchiron, F (1998), “Extraction and purification of arabinoxylan from destarched wheat bran in a pilot scale”, Indust Crops Prod., 8, pp 37-43 Biely, P (1985), “Microbial xylanolytic systems”, Trends Biotechnol., 3, pp 286-290 Biely, P., Vršanská, M., Tenkanen, M., Kluepfel, D (1997), “Endo-β-1,4xylanase families: differences in catalytic properties”, J Biotechnol., 57, pp 151-166 Bradbury, A G W., Halliday, D J., Medcalf, D G., (1981), "Saparation of monosaccharides as trimethylsilylated alditols on fusedsilica capillary columns", J Chromatogr., 213, pp:146–150 Cao, L., Liu, X., Qian, T., Sun, G., Guo, Y., Chang, F., Zhou, S., Sun, X (2011), “Antitumor and immunomodulatory activity of arabinoxylans: a major constituent of wheat bran”, Int J Biol Macromol., 48, pp 160-164 Khóa 2010 - 2012 48 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang 10 Carpita, N C., Gibeaut, D M (1993), “Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth”, Plant J., 3, pp 1-30 11 Cerning, J., Guilbot, A (1973), “A specific method for the determination of pentosans in cereals and cereal products”, Cereal Chem., 50, pp 176-184 12 Cleemput, G., Bleukx, W., Van Oort, M., Hessing, M., Delcour, J A (1995), “Evidence for the presence of arabinoxylan hydrolyzing enzymes in European wheat flours”, Cereal Sci., 22, pp 1-7 13 Cleemput, G., Hessing, M., Van Oort, M., Deconynck, M., Delcour, J A (1997), “Purification and characterization of a beta-D-xylosidase and an endoxylanase from wheat flour”, Plant Physiol., 113, pp 377-386 14 Courtin, C M., Delcour, J A (2000), “Relative activity of endoxylanases towards water-extractable and water-unextractable arabinoxylan”, J Cereal Sci., 33, pp 301-312 15 Choct, M (1997), “Feed non-starch polysaccharides: Chemical structures and nutritional significance”, Feed Mill Intern., June Issue, pp 13-26 16 Dekker, R F., Richards, G N (1976), “Hemicellulases: their occurrence, purification, properties, and mode of action”, Adv Carbohydr Chem Biochem., 32, pp 277–352 17 Delcour, J A., Van Win, H., Grobet, P J (1999), “Distribution and structural variation of arabinoxylans in common wheat mill streams”, J Agric Food Chem., 47, pp 271-275 18 Dervilly, G., Saulnier, L., Roger, P., Thibault, J (2000), “Isolation of homogenous fractions from wheat water-soluble arabinoxylans influence of the structure on their macromolecular characteristics”, J Agric Food Chem., 48, pp 270-278 19 Doner, L W B., Johnston, D., Singh, V (2001), “Analysis and properties of arabinoxylans from discrete corn wet-milling fiber fractions”, J Agric Food Chem., 49, pp 1266-1269 Khóa 2010 - 2012 49 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang 20 Douglas, S G (1980), “A rapid method for the determination of pentosan in wheat flour”, J Agric Food Chem., 7, pp 139-145 21 Englyst, H N., Cummings, J H (1988), "Improved method of measurement of dietary fiber as non starch polysaccharides in plant foods", J Assoc Off Anal Chem., 71, pp 808-814 22 Englyst, H N., Quigley, M E., Hudson, G J., Cummings, J H (1992), "Determination of dietary fiber as non-starch polysaccharides by gas-liquid chromatography" Analyst, 117, pp 1707–1714 23 Finnie, S., Bettge, A., Morris, C (2006), “Influence of Cultivar and Environment on Water-Soluble and Water-Insoluble Arabinoxylans in Soft Wheat”, Cereal Chem., 83, pp 617-623 24 Fleury, M D., Edney, M J., Campbell, L D., Crow, G H (1997), “Total water-soluble and acid-soluble arabinoxylans in western Canadian barleys”, Can J Plant Sci., 77, pp 191-196 25 Folkes, D J (1980), "A gas chromatographic method for the determination of pentosans", J Sci Food Agric., 31, pp 1011–1016 26 Garófalo, L., Vazquez, D., Ferraira, F., Soule, S (2011), “Wheat flour nonstarch polysaccharides and their effect on dough rheological properties”, Ind Crop Prod., 34, pp 1327-1331 27 Gebruers, K., Debyser, W., Goesaert, H., Proost, P.,Van Damme, J., Delcour, J A (2001), “Triticum aestivum L endo-xylanase inhibitor consists of two inhibitors, TAXI I and TAXI II, with different specificities”, Biochem J., 353, pp 239-244 28 Ghoneum, M (1998), “Anti-HIV activity in vitro of MGN-3, an activated arabinoxylan from rice bran”, Biochem Biophys Res Commun., 243, pp 2529 29 Grupen, H., Hamer, R J, Voragen, A G J (1991), “Water-unextractable cell wall material from wheat flour Extraction of polymers with alkali”, J Cereal Sci., 16, pp 41-51 Khóa 2010 - 2012 50 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang 30 Hashimoto, S., Shogren, M D., Pomeranz, Y (1987), “Cereal pentosans: their estimation and significancee I Pentosans in wheat and milled wheat products”, Cereal Chem., 64, pp 3034 31 Izydorczyk, M S., Biliaderis, C G (1995), “Cereal arabinoxylans: advances in structure and physicochemical properties”, Carbohyd Polym., 28, pp 33-48 32 Jeffries, T W (1996), “Biochemistry and genetics of microbial xylanases”, Curr Opin Biotechnol., 7, pp 337 33 Kubuta, B K., Suzuki, T., Horitsu, H., Kawai, K., Takamizawa, K (1994), “Purification and Characterization of Aeromonas caviae ME-1 Xylanase V, which produces exclusively xylobiose from xylan”, Appl Environ Microbiol., 60, pp 531-535 34 Lissoni, P., Messina, G., Brivio, F., Fumagalli, L., Vigore, L., Rovelli, F., Maruelli, L., Miceli, M., Marchiori, P., Porro, G., Held, M., Di Fede, G., Uchiyamada, T (2008), “Modulation of the anticancer immpaunity by natural agents: inhibition of T regulatory lymphocyte generation by arabinoxylan in patients with locally limited or metastatic solid tumors”, Cancer Therapy, 6, pp 1011-1016 35 Lu, J., Li, Y., Gu, G., Mao, Z (2005), “Effects of molecular weight and concentration of arabinoxylans on the membrane plugging”, J Agric Food Chem., 53, pp 4996-5002 36 Maes, C., Vangeneugden, B., Delcour, J A (2004), “Relative activity of two endo-xylanase towards water-unextractable arabinoxylans in wheat bran”, J Cereal Sci., 39, pp 181-186 37 Mares, D.J., Stone, B A (1973), “Studies on wheat endosperm I Chemical composition and ultrastructure of the cell walls”, Aust J Biol Sci., 26, pp 793812 38 Mclauchlan, W.R., Flatman, R H., Sancho, A I., Kakuta, J., Faulds, C B., Elliot, G O., Kroon, P A., Furniss, C S., Juge, N., Ravestein, P And Williamson, G (2000), “Xylanase inhibitors from cereals: Implications for Khóa 2010 - 2012 51 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang baking, brewing and plant technology”, The Second European Symposium on Enzymes in Grain Processing, VTT Technical Research Centre of Finland, pp 55-61 39 Nishath, K.G., Turner, M A (2008), “A simplified method for extracting waterextractable arabinoxylans from wheat flour”, J Sci Food Agri., 88, pp 19051910 40 Ordaz-Ortiz, J.J., Guillon, F., Tranquet, O., Dervilly-Pinel, G., Tran, V., Saulnier, L (2004), “Specificity of monoclonal antibodies generated against arabinoxylans of cereal grains”, Carbohyd Polym., 57, pp 425-433 41 Pastell, H (2010), Preparation, structural analysis and prebiotic potential of arabinoxylo-oligosaccharides, Academic doctoral dissertation, Faculty of Agriculture and Forestry, University of Helsinki, pp 18-28 42 Pastell, H., Tuomainen, P., Virkki, L., Tenkanen, M (2008), “Step-wise enzymatic preparation and structural characterization of singly and doubly substituted arabinoxylo-oligosaccharides with non-reducing end terminal branches”, Carbohydr Res , 343, pp 3049-3057 43 Pitkänen, L., Tenkanen, M., Toumainen P (2011), “Behavior of polysaccharide assemblies in field-flow fractionation and size-exclusion chromatography”, Anal Bioanal Chem., 399, pp 1467-1472 44 Preece, I A., Mcdougall, M (1958), “Enzymic degradation of cereal hemicelluloses II Pattern of pentosan degration”, J Inst Brew., 64, pp 489500 45 Rantanen, H., Virkki, L., Tuomainen, P., Kabel, M., Schols, H., Tenkanen, M (2007), “Preparation of arabinoxylobiose from rye xylan using family 10 Aspergillus aculeatus endo-1,4-β-D-xylanase”, Carbohydr Polymers, 68, pp 350-359 46 Reilly, P J (1981), “Xylanases: structure and function In: Trends in the biology of fermentation for fuels and chemicals”, Basic Life Sci., Plenum Press, New York, pp 111-129 Khóa 2010 - 2012 52 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang 47 Rose, D J., Inglett, G E (2011), “A method for the determination of soluble arabinoxylan released from insoluble substrates by xylanases”, Food Anal Methods, 4, pp 66-72 48 Rouau, X., Surget, A (1994), “A rapid semi-automated method for the determination of total and water-extractable pentosans in wheat flours”, Carbohyd Polym., 24, pp 123 -132 49 Samuelsen, A B., Rieder, A., Grimmer, S., Michaelsen, T E., Knutsen, S H (2011), “Immunomodulatory activity of dietary fiber: Arabinoxylan and mixedlinked beta-glucan isolated from barley show modest activities in vitro”, Int J Mol Sci., 12, pp 570-587 50 Shibuya, N., Iwasaki, T (1985), “Structural features of rice bran hemicelluloses”, Phytochem., 24, pp 285-289 51 Shibuya, N., Nakane, R., Yasui, A., Tanaka, K., Iwasaki, T (1985), “Comparative studies on cell wall preparations from rice bran, germ, and endosperm”, J Cereal Sci., 62, pp 252-258 52 Shiiba, K., Yamada, H., Hara, H., Okada, K., Nagao, S (1993), “Purification and characterization of two arabinoxylan from wheat bran”, Cereal Chem., 70, pp 209-214 53 Subba Rao, M.V.S.S.T., Muralikrishna, G (2006), “Hemicellulose of Ragi (Finger Millet, Eleusine coracana, Indaf-15): Isolation and purification of an alkali-extractable arbinoxylan from native and malted hemicelluloses B”, J Agric Food Chem., 54, pp 2342-2349 54 Sundberg, A., Sundberg, K., Lillandt, C., Holmbom, B (1996), “Determination of hemicelluloses and pectins in wood and pulp fibers by acid methanolysis and gas chromatography”, Nord Pulp Pap Res J., 11, pp 216- 226 55 Törrönen, A., Rouvinen, J (1997), “Structural and functional properties of low molecular weight endo-1,4-beta-xylanases”, J Biotechnol., 57, pp 137-149 Khóa 2010 - 2012 53 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang 56 Vinjamoori, D.V., Byrum, J R., Hayes, T., Das, P K (2004), “Challenges and opportunities in the analysis of raffinose oligosaccharides, pentosans, phytate, and glucosinolates”, J Anim Sci., 82, pp 319-328 57 Watanabe, T., Shida, M., Furuyama, Y., Tsukamoto, K., Nakajima T., Matsuda, K (1983), “Structure of the arabinoxylan of rice hull”, Carbohydr Res., 123, pp 83-95 58 Zheng, X., Li, L., Wang, X (2011), “Molecular characterization of arabinoxylans from hull-less barley milling fractions”, Molecules, 16, pp 27432753 59 www.megazyme.com/downloads/en/data/K-ARAB.pdf 60 www.megazyme.com/downloads/en/data/K-XYLOSE.pdf 61 http://www.jafra.gr.jp/eng/biobran.html 62 http://www.spectrumlabs.com/dialysis/Fund.html 63 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/tcvn-5780-1994.274386.html 64 http://tieuchuan.vn/vi/tin-tuc/593-tieu-chuan-quoc-gia-viet-nam-tcvn-cong-bonam-2007.html 65 http://web.idrc.ca/openebooks/278-3/ 66 http://www.daiwa-pharm.com/eng/bio-5.html 67 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/qcvn-8-2-2011-byt.1286436.html 68 www.wikipedia.org Khóa 2010 - 2012 54 [...]... CỨU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Chế phẩm arabinoxylan Chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo dùng cho các thí nghiệm được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein (là sản phẩm của đề tài ĐT.02.11/CNSHCB, Bộ Công thương do TS Nguyễn Thị Vân Anh chủ trì) 2.1.2 Hoá chất Arabinoxylan từ bột mỳ, D-Xylose Kit và Arabinan Kit được mua từ hãng Megazyme Bản mỏng sắc... chất khô của lúa Cám gạo được hình thành từ lớp vỏ nội nhũ, mầm phôi của hạt, cũng như một phần từ tấm Cám gạo có màu sáng và mùi thơm đặc trưng Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của cám gạo biến động rất lớn, phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật xay xát gạo Tỷ lệ vỏ trấu sau khi xay xát ảnh hưởng nhiều tới hàm lượng protein, chất béo và chất xơ của cám gạo thành phẩm Tỷ lệ protein trong cám gạo mịn... mua từ hãng Merck Gel Sephadex được mua từ hãng Sigma Các enzyme Ultraflo M, Ultraflo L và Porzyme được mua từ hãng Novozymes Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thủy phân arabinoxylan thành các monosaccharide Thủy phân arabinoxylan bằng acid Khi được xử lý với HCl hoặc H2SO4, arabinnoxylan được thủy phân hoàn toàn thành dạng đường đơn: Arabinoxylan. .. trúc chính của AX được minh họa như hình 1.1, và cấu trúc minh họa cho AX được thể hiện ở hình 1.2 và 1.3 H nh 1.1: Cấu trúc các đơn vị của arabinoxylan Khóa 2010 - 2012 5 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang Hình 1.2: Cấu trúc của arabinoxylan ngũ cốc H nh 1.3: Cấu trúc phân tử arabinoxylan [65] Tỷ lệ arabinose/xylose trong AX của nội nhũ lúa mì thay đổi từ 0,5-0,71, ở cám mì là từ 1,02-1,07,... (nếu có) C D-xylose của arabinoxylan (g/100g) = Cxylose của arabinoxylan (g/L)x100/trọng lượng mẫu (g/L) 2.2.2.2 Xác định hàm lượng L-arabinose có trong arabinoxylan sau khi đươc thủy phân bằng Arabinan kit [59] Nguyên tắc: - Sự chuyển đổi qua lại các cấu hình dạng α- và β của L- arabinose được xúc tác bởi enzyme galactose mutarotase (GalMR) α -L-Arabinose → β -L-arabinose - β-L-arabinose bị oxi hóa... tính và định lượng các Khóa 2010 - 2012 12 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang sản phẩm sau khi thủy phân AX có thể suy ra hàm lượng và khẳng định sự có mặt của AX có trong mẫu nghiên cứu 1.3.1 Thủy phân arabinoxylan thành các monosaccharide Thủy phân arabinoxylan bằng enzyme xylanase: Khung đường xylan của arabinoxylan có thể được thủy phân bởi nhóm các enzyme có khả năng cắt các liên kết... Huyền Trang 1.3.2 Phân tích định tính arabinoxylan Các nghiên cứu về định tính arabinoxylan thường gián tiếp định tính các đường đơn arabinose và xylose sau khi thủy phân hoàn toàn arabinoxylan Kubuta và tập thể [33] đã sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) để khẳng định sự có mặt của xylose và các oligoxylose và hiệu quả của các phản ứng thủy phân xylan bằng các enzyme xylanase được tách từ vi... arabinogalactan Khóa 2010 - 2012 được ước lượng từ hàm 17 lượng galactose với tỷ lệ Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang arabinose/galactose là 0,7 AX sau đó được phân tích bằng sắc ký HPSEC sử dụng hai cột Shodex OH-pak SB HQ 804 và 805 [18, 35] 1.4 Các nghiên cứu tinh sạch và xác định khối lượng phân tử của arabinoxylan Arabinoxylan được tạo ra từ ngũ cốc có khối lượng phân tử thay đổi phụ... đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu đối với khối u Đặc biệt, các AX có khối lượng phân tử khoảng 5-300 kDa thể hiện hoạt tính miễn dịch mạnh nhất, được sử dụng khá phổ biến trên thế giới ở dạng thực phẩm chức năng và được khuyến cáo sử dụng cho bệnh nhân nhiễm HIV, viêm gan và ung thư [36, 37] 1.1.4 Nguyên liệu cám gạo chứa arabinoxylan Cám gạo là phụ phẩm chính thu được từ lúa sau khi xay... Lúa gạo (Oryza sativa) Thành phần các hợp chất (%) Loại thành Nội nhũ hạt Ngô Nội nhũ (Zea mays) hạt [3] 71 2 26 1 20 2 75 3 27 28 20 25 [51] 50 20 17 13 [19] 1.1.2 Cấu tạo của arabinoxylan Chuỗi chính của arabinoxylan trong ngũ cốc được tạo thành từ hai loại đường 5 cacbon là arabinose và xylose, bao gồm mạch chính chứa các liên kết β(1→4) liên kết các phân tử β-D-Xylp Mạch xylan liên kết với α-L-Araf ... tích số tính chất chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo .40 3.2.1 Xác định khối lượng phân tử chế phẩm arabinoxylan 40 3.2.2 Xác định độ ẩm chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo4 5 3.2.3 Xác định... D-xylose sau thủy phân chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo enzyme xylanase………………………………………… 36 Bảng 3.7: Kết định lượng L-arabinose sau thủy phân chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo enzyme xylanase….………………………... Thị Huyền Trang CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Chế phẩm arabinoxylan Chế phẩm arabinoxylan tạo từ cám gạo dùng cho thí nghiệm cung cấp nhóm nghiên cứu thuộc