lọc gel
Nguyên tắc:
Sắc ký lọc gel bao gồm pha cố định là một loại gel có cấu tạo dạng mạng lưới hay lỗ và kích thước của các lỗ rây này khác nhau tùy theo loại gel được sử
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 27
dụng, còn pha chuyển động là một loại dung dịch đệm hay dung môi thích hợp. Các chất khi đi qua hệ thống lọc gel sẽ được phân tách theo nguyên tắc, trong đó chất có kích thước lớn ra trước, tiếp đến là chất có kích thước vừa và cuối cùng là chất có kích thước nhỏ, là do chất có kích thước lớn không thể chui vào các hệ thống lỗ gel, do đó khi đi qua phần kẽ hở giữa các hạt gel và ra nhanh hơn, các chất có kích thước vừa sẽ có cơ hội chui vào các lỗ gel và do đó mất nhiều thời gian để chui ra. Các chất có kích thước nhỏ dễ dàng chui vào lỗ gel và cơ hội chui vào các lỗ gel cao nhất và thời gian đi qua hệ thống lọc gel lâu nhất nên được đẩy ra khỏi hệ thống gel muộn nhất [1].
Dựa vào sắc ký lọc gel có thể đánh giá khối lượng phân tử tương đối của chất với nguyên tắc: Logarit KLPT (logMw) của các chất tỷ lệ nghịch với hệ số Ve/Vo, trong đó Ve là thể tích rửa chiết của chất sắc ký, Vo là thể tích trống của cột. Khi có được một loạt các chất chuẩn với KLPT đã biết, người ta cho sắc ký qua cột để tính ra giá trị Ve/Vo và lập đồ thị tương quan giữa logMw và Ve/Vo, từ đó với một chất chưa biết KLPT nhưng biết được Ve khi đi qua cột thì có thể tính được KLPT của chất đó [1] một cách tương đối.
Quy trình:
Gel đã trương nở được nhồi vào cột 1x 60 cm. Cột gel được cân bằng với nước cất với thể tích tổi thiểu bằng 2 lần thể tích cột gel để tạo môi trường gel sắc ký đồng nhất trong toàn bộ cột gel. Dextran xanh (2.000 kDa) được dùng để tính thể tích trống Vo của cột. Sau khi cột gel được rửa sạch, từng dịch protein chuẩn được nạp vào cột từ từ, đảm bảo bề mặt gel ổn định. Sau đó cho đệm chảy qua liên tục, tốc độ dòng chảy đươc duy trì khoảng 20 ml/giờ, thu các phân đoạn vào các ống riêng. Xác định hàm lượng protein mỗi phân đoạn để tính Ve của từng protein chuẩn với cách tinh giống như tính Vo. Tính toán các giá trị logMw và Ve/Vo của các chất chuẩn. Sau đó lập đồ thị tương quan giữa logMw và Ve/Vo với trục tung là giá trị logMw và trục hoành là tỷ lệ Ve/Vo.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 28
Mẫu đã cô đặc được nạp vào cột với thể tích khoảng 1 ml với cách thức tiến hành tương tự như đối với protein chuẩn. Khi bắt đầu cho mẫu lên cột thì cũng bắt đầu tính thể tích mẫu chảy qua cột bằng cách tiến hành thu các phân đoạn vào từng ống riêng. Các phân đoạn rửa chiết sau đó được xác định hàm lượng arabinoxylan thông qua hàm lượng xylose và arabinose như quy trình được trình bày ở mục 2.2.2. Biểu đồ của quá trình phân tách qua sắc ký lọc gel được thiết lập với trục tung là giá trị độ hấp thụ ở 340 nm và trục hoành là các phân đoạn/thể tích rửa chiết.
Dựa trên giá trị Ve của các đỉnh sắc ký qua cột lọc gel của chế phẩm arabinoxylan sau khi qua cột, tỷ lệ Ve/Vo của từng phân đoạn đỉnh sắc ký được tính và giá trị Ve/Vo được đối chiếu này với đồ thị tương quan của các chất chuẩn sẽ suy ra được giá trị logMw của AX ở phân đoạn đấy, từ đó có được giá trị KLPT tương ứng một cách tương đối.
2.2.6. Xác định độ ẩm
Nguyên tắc:
Độ ẩm được xác định theo phương pháp sấy khô mẫu ở 105oC để làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu đến khối lượng không đổi. Mẫu được cân khối lượng trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu.
Quy trình:
Hộp nhôm dùng để đựng mẫu được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng của hộp cân mo (g). Sau đó cho mẫu vào hộp nhôm, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng hộp và mẫu là m1 (g). Hộp mẫu được đặt vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 105oC, sau 1 ngày thì lấy hộp mẫu ra để nguội, cân và sau đó để hộp vào tủ sấy tiếp, cứ sau 1 ngày thì hộp được cân lại lần nữa cho đến khi khối lượng hộp mẫu giữa các lần sấy khác nhau không quá 0,01%, khối lượng m2 (g) được ghi lại.
Công thức tính độ ẩm theo phần trăm:
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 29 Trong đó:
mo: Khối lượng hộp sau khi được sấy đến khối lượng không đổi. m1: Khối lượng hộp và mẫu trước khi sấy.
m2: khối lượng hộp và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi.