Trước khi được cho qua cột sắc ký lọc gel, chế phẩm arabinoxylan được định lượng theo quy trình xác lập ở phần trên. Các mẫu có nồng độ AX thấp (dưới 10 mg/ml) được cô đặc bằng màng lọc có kích thước lỗ 10 kDa. Sử dụng màng lọc này cũng có thể tinh sạch AX bằng cách loại bỏ các chất có khối lượng phân tử nhỏ hơn 30 kDa và các đường đơn xylose, arabinose, glucose… hay các muối có trong chế phẩm sau khi chiết từ cám gạo. Mẫu sau khi được cô đặc được định lượng AX để đảm bảo mẫu trước khi lên cột lọc gel có nồng độ khoảng 10 mg/ml và được cho lên cột lọc gel Sephadex G-100.
Gel Sephadex G-100 được nhồi vào cột có kích thước 1x60cm. Dung dịch dextran (nồng độ 2 mg/ml) xanh có KLPT 2000 kDa được sử dụng để xác định tính thể tích trống của cột V0 (ml) của cột. Hàm lượng dextran xanh sau khi rửa chiết ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sóng 620 nm (A620), từ đó tính được giá trị V0, khoảng 14,7 ml, là thể tích rửa chiết được tính từ lúc dextran xanh được cho lên cột cho đến khi thu được giá trị A620 cực đại.
Các chất chuẩn (protein) có nồng độ 2 mg/ml và KLPT đã biết được lần lượt cho qua cột, rửa chiết và thu riêng từng phân đoạn với thể tích mỗi phân đoạn khoảng 0,5 ml. Các phân đoạn rửa chiết protein chuẩn được đo độ hấp thụ của protein ở bước sóng 280 nm để xác định phân đoạn nào chứa nhiều protein nhất, từ đó tính thể tích rửa chiết từ lúc bắt đầu nạp mẫu cho đến khi thu được phân đoạn protein chuẩn cực đại, sau đó lập đồ thị tương quan giữa logMw và Ve/Vo của các protein chuẩn.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 41
Hình 3.4: Đồ thị sự tương quan giữa khối lượng phân tử và thể tích rửa chiết của các chất chuẩn qua sắc ký lọc gel
Các protein chuẩn bao gồm: Ovalbumin (45 kDa), Chymotrypsinogen A (25 kDa), chất ức chế trypsin hay chất ức chế Kunitz từ đậu tương (21 kDa), cytochrom c (12,4 kDa).
Kết quả (hình 3.4) nói lên tương quan giữa giữa logMw và Ve/Vo của các protein chuẩn khi được sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G-100 trong nghiên cứu của chúng tôi.
Sau khi cột gel được rửa sạch, 1 ml chế phẩm arabinoxylan có nồng độ khoảng 10 mg/ml được cho lên cột gel, rửa chiết và thu các phân đoạn vào từng ống riêng. Kết quả chúng tôi đã thu tổng số 70 phân đoạn, mỗi phân đoạn có thể tích khoảng 0,5 ml. Các phân đoạn rửa chiết được định lượng hàm lượng xylose và arabinose, sau đó vẽ đồ thi minh họa giá trị A340 của các phân đoạn rửa chiết
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 42
Hình 3.5: Đồ thị minh họa giá trị A340 của các phân đoạn rửa chiết từ 1 đến 70 qua sắc ký lọc gel Sephadex G-100
Kết quả biểu diễn hàm lượng arabinoxylan của các phân đoạn ở hình 3.5 cho thấy, chúng tôi đã thu được ba đỉnh sắc ký khác nhau, đỉnh I (các phân đoạn 35-42), đỉnh II (các phân đoạn 43-48), đỉnh III (các phân đoạn 50-54) . Trên cơ sở giá trị Ve
của các đỉnh này và dựa vào đồ thị chuẩn đã được thiết lập (hình 3.4) chúng tôi đã tính ra KLPT hay kích thước của các arabinoxylan này tương ứng là 41 kDa, 35 kDa và 28,2 kDa (bảng 3.9).
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 43
ảng 3.9: Khối lượng phân tử của arabinoxylan tách ra bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-100
Đỉnh sắc ký Thể tích rửa chiết (ml) Hàm lượng arabinoxylan (mg)
Ve/V0 Mw (kDa)
Đỉnh I 20,10 2,883 1,37 41,0
Đỉnh II 23,82 2,352 1,62 35,0
Đỉnh III 28,12 2,387 1,91 28,2
Tổng hàm lượng arabinoxylan trong các phân đoạn từ 35 đến 54: 7,622 mg chiếm 80,57% hàm lượng AX tổng số trước khi qua cột. Hay nói cách khác, hiệu suất thu hồi của chế phẩm sau khi sắc ký là 80,57%.
Để khẳng định thêm về sự có mặt của xylose và arabinose sau khi đã thủy phân các phân đoạn rửa chiết qua cột, chúng tôi đã sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng trên silica gel (Các phân đoạn rửa chiết được thủy phân thành xylose và arabinose bằng enzyme Porzyme)
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 44
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 3.6: Kết quả sắc ký bản mỏng sau khi thủy phân các phân đoạn rửa chiết AX
Đường chạy 1: Đường chuẩn D-xylose Đường chạy 2: Đường chuẩn L-arabinose
Đường chạy 3: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký III đã được thủy phân Đường chạy 4: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký II đã được thủy phân Đường chạy 5: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký I đã được thủy phân Đường chạy 6: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký III chưa thủy phân Đường chạy 7: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký II chưa thủy phân Đường chạy 8: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký I chưa thủy phân Đường chạy 9: Phân đoạn rửa chiết từ 1-30 chưa thủy phân Đường chạy 10: AX trước khi qua cột Sephadex G-100
Kết quả sắc ký bản mỏng cho thấy các phân đoạn rửa chiết qua cột (hình 3.6, đường chạy 3, 4, 5) sau khi được thủy phân bằng Porzyme cho hai băng rõ nét có vị trí tương tự như vị trí của đường xylose và arabinose (hình 3.6, đường chạy 1 và 2), chứng tỏ các phân đoạn rửa chiết này có chứa AX. Hơn nữa, khi chưa được thủy phân các phân đoạn rửa chiết qua cột tạo những vệt sắc ký dài, không phân tách
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 45
thành các băng riêng rẽ, chứng tỏ trong các phân đoạn này không chứa các đường xylose và arabinose tự do. Kết quả sắc trên silica gel còn cho thấy, sử dụng sắc ký lọc gel Sephadex G-100 đã cho phép loại bỏ một số sản phẩm (mà acid hay xylanase không thể thủy phân được) có lẫn trong chế phẩm arabinoxylan.