Để xây dựng quy trình phân tích định tính và định lượng arabinoxylan, chúng tôi đã sử dụng arabinoxylan thương mại có nguồn gốc từ bột mì được mua từ hãng Megazyme làm mẫu chuẩn để tối ưu các bước của quy trình định lượng. Sau đó, chúng tôi thử nghiệm quy trình này đối với chế phẩm AX được tạo ra từ cám gạo.
3.1.1. Thủy phân arabinoxylan bằng acid và định tính, định lượng arabinoxylan arabinoxylan
Đối với chế phẩm arabinoxylan cám gạo ở dạng bột: 1 g mẫu được thủy phân bằng acid HCl 1,3 M hoặc acid H2SO4 0,5 M ở 100oC trong thời gian 180 phút, sản phẩm sau khi thủy phân được làm nguội về nhiệt độ phòng và được trung hòa về pH 7,0 bằng NaOH có nồng độ tương đương với nồng độ acid đã sử dụng. Dung dịch sau khi trung hòa được ly tâm loại muối ở 5.000 vòng/phút trong 10 phút trước khi được định lượng D-xylose và L-arabinose bằng kit của Megazyme (mục 2.2.2).
Đối với chế phẩm arabinoxylan ở dạng dịch lỏng: bổ sung HCl đặc (hoặc HCl ở nồng độ cao hơn 1,3 M) hoặc H2SO4 nồng độ 2 M vào 100 μl mẫu để đạt nồng độ cuối cùng của HCl là 1,3 M và H2SO4 là 0,5 M. Dung dịch sau đó cũng được thủy phân ở 100o
C trong 180 phút và trung hòa bằng NaOH giống như quy trình định lượng với mẫu dạng bột. Hàm lượng arabinoxylan được tính bằng tổng hàm lượng xylose và arabinose nhân với hệ số 0,88 [17].
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 31
ảng 3.1: Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân arabinoxylan thương mại bằng acid
Acid ∆A340 * D-xylose Nồng độ xylose (mg/ml) Tỷ lệ xylose trong AX (%) ∆A340 * L-arabinose Nồng độ arabinose (mg/ml) Tỷ lệ arabinose trong AX (%) HCl 0,52 0,60 60 0,59 0,360 36,0 H2SO4 0,49 0,56 56 0,49 0,296 29,6
*) Mẫu được đo 3 lần và tính toán giá trị ∆A340 trung bình
Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân arabinoxylan thương mại bằng acid ở bảng 3.1 cho thấy, arabinoxylan (thương mại) sau khi được thủy phân bằng acid HCl có chứa 60% xylose, 36% arabinose, còn thủy phân bằng H2SO4 thì chứa 56% xylose và 29,6% arabinose. Tỷ lệ xylose và arabinose thu được phù hợp với một số đặc trưng của AX của bột mì (có thành phần khoảng 62% là đường xylose, còn lại là đường arabinose [59, 60]). Như vậy, hàm lượng AX được xác định bằng cách thủy phân thành các đường đơn xylose và arabinose bằng acid HCl và H2SO4 là 96% và 85,6%, chứng tỏ HCl cho hiệu suất thủy phân tốt hơn H2SO4. Vì thế, chúng tôi đã sử dụng quy trình này để định lượng AX có trong chế phẩm tạo ra từ cám gạo.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 32
ảng 3.2: Kết quả định lượng D-xylose sau khi thủy phân chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo bằng acid
Phương pháp thủy phân ∆A340 * Nồng độ xylose (mg/ml)
Hàm lượng xylose (mg/g mẫu)
HCl 0,52 1,68 8,40
H2SO4 0,29 1,64 8,21
*) Mẫu được đo 3 lần và tính toán giá trị ∆A340 trung bình
ảng 3.3: Kết quả định lượng L-arabinose sau khi thủy phân chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo bằng acid
Phương pháp thủy phân ∆A 340* Nồng độ arabinose (mg/ml) Hàm lượng arabinose (mg/g mẫu) HCl 0,63 1,73 8,65 H2SO4 0,29 1,40 7,02
*) Mẫu được đo 3 lần và tính toán giá trị ∆A340 trung bình
Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose trong chế phẩm AX tạo ra từ cám gạo (bảng 3.2 và 3.3) cho thấy hàm lượng xylose và arabinose trong 1g chế phẩm AX được thủy phân bằng HCl cao hơn so với được thủy phân bằng H2SO4.
Do mỗi đơn phân xylose, arabinose có khối lượng phân tử là 152 Da, khi liên kết với nhau hình thành cấu trúc AX thì bị loại đi một phân tử nước (18 Da), vì vậy để xác định hàm lượng AX khi đã biết hàm lượng của các đường đơn xylose và arabinose, chúng tôi sử dụng hệ số 0,88 (134/152 = 0,88). Kết quả chúng tôi thu được hàm lượng của AX theo phương pháp thủy phân bằng HCl và H2SO4 tương ứng là 15 mg/g mẫu và 13,4 mg/g mẫu (bảng 3.4).
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 33
Bảng 3.4: Hàm lượng arabinoxylan có mặt trong chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo Phương pháp thủy phân Hàm lượng xylose (mg/g mẫu) Hàm lượng arabinose (mg/g mẫu) Hàm lượng AX (mg/g mẫu)* HCl 8,40 8,65 15,0 H2SO4 8,21 7,02 13,4
(*): Hàm lượng arabinoxylan được tính bằng tổng lượng xylose và arabinose nhân với hệ số 0,88 Như vậy, hàm lượng AX được xác định theo phương pháp thủy phân bằng acid HCl cao hơn so với thủy phân bằng H2SO4,nhưvậy, chứng tỏ hiệu suất thủy phân AX bằng HCl là tốt hơn.
Để khẳng định thêm sự có mặt của D-xylose và L-arabinose trong chế phẩm AX sau khi được thủy phân bằng acid, chúng tôi tiến hành phân tích các sản phẩm sau khi thủy phân bằng phương pháp sắc ký bản mỏng trên gel silica.
Các mẫu sau khi được thủy phân bằng acid được trung hòa về pH 7,0 bằng dung dịch NaOH 1,3M hoặc NaOH 0,5 M (tùy thuộc vào acid sử dụng để thủy phân AX là HCl 1,3 M hay H2SO4 0,5 M), sau đó được làm khô và hòa tan trở lại trong methanol 100%, và được chấm lên bản sắc ký (thể tích mỗi mẫu chấm 10-20 µl), sử dụng hệ dung môi n-butanol : acid axetic : H2O (tỷ lệ 3:1:1). Bản sắc ký sau đó được làm khô và được chạy thêm một lần nữa trước khi được nhuộm màu bằng dung dịch aniline phthalate, hiện màu ở 100oC trong 10 phút và quan sát kết quả.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 34
1 2 3 4 5
Hình 3.1: Kết quả sắc ký bản mỏng chế phẩm chứa arabinoxylan từ cám gạo sau khi được thủy phân bằng acid
Đường chạy 1: Đường chuẩn D-xylose Đường chạy 2: Đường chuẩn L-arabinose
Đường chạy 3: Chế phẩm được thủy phân bằng acid HCl Đường chạy 4: Chế phẩm được thủy phân bằng acid H2SO4 Đường chạy 5: Chế phẩm chưa thủy phân
Kết quả sắc ký bản mỏng sản phẩm thủy phân AX (hình 3.1) cho thấy chế phẩm arabinoxylan được thủy phân bằng acid HCl và H2SO4 đều chứa D-xylose và L-arabinose (Hình 3.1, đường chạy 3, 4). Tuy vậy cả hai mẫu đều vẫn còn lẫn sản phẩm chưa thủy phân hoàn toàn, trong đó mẫu được thủy phân bằng H2SO4 có ít các băng phụ hơn và phân tách các băng rõ nét hơn so với mẫu được thủy phân bằng HCl. Chúng tôi đã thử nghiệm tăng thời gian thủy phân cũng như tăng nồng độ acid tuy vậy hàm lượng D - xylose và L - arabinose tạo thành không tăng lên và sự phân tách các băng trong sắc ký đồ cũng không được cải thiện hơn đáng kể. Kết quả này
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 35
có thể được giải thích là do chế phẩm AX được tạo ra từ cám gạo còn bị lẫn một số hợp chất khác.
3.1.2. Thủy phân arabinoxylan bằng enzyme xylanase và định tính, định lượng arabinoxylan
Chúng tôi sử dụng chế phẩm enzyme xylanase thương mại là Ultraflo M, Ultraflo L, Porzyme với cùng số đơn vị hoạt độ (khoảng 0,2 U/1 mg AX) để thủy phân AX, cùng số đơn vị hoạt độ enzyme xylanase (khoảng 0,2 U/1 mg AX) để thủy phân AX trong đệm CH3COONa, ở 50oC trong 24 giờ, sau đó xác định hàm lượng xylose và arabinose tạo thành.
ảng 3.5: Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân arabinoxylan thương mại bằng enzyme xylanase
Enzyme ∆A340 * D- xylose Nồng độ xylose (mg/ml) Tỷ lệ xylose trong AX (%) ∆A340 * L- arabinose Nồng độ arabinose (mg/ml) Tỷ lệ arabinose trong AX (%) Ultraflo M 0,40 0,570 57,0 0,30 0,182 18,2 Ultraflo L 0,44 0,622 62,2 0,46 0,278 27,8 Porzyme 0,42 0,594 59,4 0,49 0,300 30,0
*) Mẫu được đo 3 lần và tính toán giá trị ∆A340 trung bình
Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân arabinoxylan thương mại bằng enzyme xylanase (bảng 3.5) cho thấy, trong ba enzyme xylanase đã được sử dụng để thủy phân chế phẩm AX thương mại, Porzyme cho hiệu quả thủy phân tốt nhất, thu được 59,4% AX thương mại là xylose, 30% là arabinose. Tỷ lệ xylose và arabinose thu được tương đối phù hợp với một số đặc trưng của AX của bột mì (có thành phần khoảng 62% là đường xylose, còn lại là đường arabinose [59,
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 36
60]). Vì thế, chúng tôi đã lựa chọn enzyme này để xây dựng quy trinh định lượng arabinoxylan tạo ra từ cám gạo.
Bảng 3.6: Kết quả định lượng D-xylose sau khi thủy phân chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo bằng enzyme xylanase
Tên enzyme ∆A340 * Nồng độ xylose (mg/ml) Hàm lượng xylose (mg/g mẫu) Ultraflo M 0,21 1,49 7,45 Ultraflo L 0,24 1,70 8,50 Porzyme 0,23 1,63 8,15
*) Mẫu được đo 3 lần và tính toán giá trị ∆A340 trung bình
Bảng 3.7: Kết quả định lượng L-arabinose sau khi thủy phân chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo bằng enzyme xylanase
Tên enzyme ∆A 340* Nồng độ arabinose (mg/ml) Hàm lượng arabinose (mg/g mẫu) Ultraflo M 0,19 1,15 5,75 Ultraflo L 0,25 1,51 7,55 Porzyme 0,27 1,63 8,15
*) Mẫu được đo 3 lần và tính toán giá trị ∆A340 trung bình
Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo (bảng 3.6, 3.7 và 3.8) cho thấy khi dùng chế phẩm Ultraflo L và Porzyme để thủy phân AX, chúng tôi thu được hàm lượng AX tương đương nhau (tương ứng 14,12 mg/g mẫu và 14,34 mg/g mẫu), trong khi đó sử dụng chế phẩm Ultraflo M cho hàm lượng AX thấp hơn đáng kể (chỉ đạt 11,62 mg/g mẫu).
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 37
Bảng 3.8: Hàm lượng arabinoxylan trong chế phẩm tạo ra từ cám gạo được thủy phân bằng enzyme
Tên enzyme Hàm lượng xylose (mg/g mẫu) Hàm lượng arabinose (mg/g mẫu) Hàm lượng AX (mg/g mẫu) Ultraflo M 7,45 5,75 11,62 Ultraflo L 8,50 7,55 14,12 Porzyme 8,15 8,15 14,34
So sánh kết quả định lượng AX khi dùng các enzyme xylanase thủy phân (bảng 3.8) với kết quả định lượng AX khi được thủy phân bằng acid (bảng 3.4), cho thấy hàm lượng AX khi dung phương pháp thủy phân bằng acid là cao hơn so với thủy phân bằng các chế phẩm enzyme công nghiệp. Nguyên nhân của sự sai khác này có thể do tính đặc hiệu cơ chất của các enzyme xylanase mà chúng đã không thể thủy phân hoàn toàn được AX thành các đường đơn xylose và arabinose [15, 40]. Thông thường các enzyme xylanase chỉ thủy phân được các liên kết trên mạch xylan trong cấu trúc AX tạo ra xylose, xylobiose hoặc các xylo-oligosaccharide. Một số xylanase có khả năng phân cắt liên kết trong AX để tạo ra arabinose nhưng lại không tạo ra được xylose mà giải phóng các xylo-oligosaccharide có kích thước trung gian khác nhau [4].
Để khẳng định chắc chắn hơn về sự có mặt của xylose và arabinose sau khi thủy phân AX bằng enzyme xylanase, chúng tôi đã sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng trên gel silica tương tự như đã được thực hiện đối với mẫu được thủy phân bằng acid.
Kết quả sắc ký bản mỏng các sản phẩm thủy phân AX với ba enzyme xylanase khác nhau ở hình 3.2 cho thấy AX sau khi thủy phân bằng Porzyme cho kết quả phân tách tốt nhất với sự xuất hiện rõ nét của các đường xylose và arabinose
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 38
(hình 3.2, đường chạy 3). Các mẫu được thủy phân bằng Ultraflo M và Ultraflo L (hình 3.2, đường chạy 4 và 5) còn nhiều cơ chất được thủy phân ở mức độ không hoàn toàn (hình 3.2, đường chạy 4 và 5). Kết quả này một lần nữa khẳng định hiệu suất thủy phân AX cao của Porzyme như đã trình bày ở trên.
1 2 3 4 5 6
Hình 3.2: Kết quả sắc ký bản mỏng chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo sau khi được thủy phân bằng enzyme xylanase
Đường chạy 1: Đường chuẩn D - xylose Đường chạy 2: Đường chuẩn L - arabinose
Đường chạy 3: Chế phẩm thủy phân bằng Porzyme Đường chạy 4: Chế phẩm thủy phân bằng Ultraflo L Đường chạy 5: Chế phẩm thủy phân bằng Ultraflo M Đường chạy 6: Chế phẩm chưa thủy phân
Từ những kết quả thu được ở trên cho thấy có thể sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng để phát hiện sự có mặt của xylose và arabinose, cũng như đánh giá bổ sung kết quả thủy phân AX.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 39
Như vậy, có thể tóm tắt quy trình phân tích định tính và định lượng arabinoxylan như sơ đồ ở hình 3.3, với các bước: i) thủy phân AX bằng acid (HCl hoặc H2SO4) hoặc xylanase, ii) định lượng đường xylose và arabinose tạo thành bằng kit Megazyme và phân tích định tính sản phẩm thủy phân bằng sắc ký bản mỏng trên silicagel.
Hình 3.3. Tóm tắt quy tr nh phân tích định tính, định lượng arabinoxylan.
Thủy phân thành đường đơn bằng acid HCl (1,3 M) và H2SO4 (0,5 M)
ở 100o
C trong 3 giờ
Thủy phân thành đường đơn bằng enzyme xylanase porzyme trong đệm CH3COONa
50 mM, pH 5 trong 24 giờ ở 50oC Arabinoxylan ở dạng bột (1 g) hoặc
arabinoxylan ở dạng dịch (100 µl)
Định lượng xylose và arabinose bằng kit D- xylose của Megazyme, nhân hàm lượng đường
tổng số với hệ số 0,88
Mẫu được làm khô và hòa vào methanol, được định tính bằng sắc ký bản mỏng trên gel silica, sử dụng hệ dung môi n-butanol : acid axetic : H2O với tỷ lệ 3:1:1, hiện màu bằng dung dịch aniline phthalate ở
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Khóa 2010 - 2012 40