Nghiên cứu quy trình tẩy rửa và bảo quản màng BC tạo ra từ vi khuẩn acetobacter

Vi khuan Acetobacter xylinum khi nudi cAy trén méi trong dịch lỏng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh tạo nên một lớp màng trên bề mặt dung dịch, màng này có bản chất từ cellulose kết hợp với

MO DAU

1 Ly do chon dé tai

Ngày nay, đối với các quốc gia trên thế giới công nghệ sinh học không còn là một ngành mới mẻ mà nó đã trở thành một ngành kinh tế chủ đạo trong sự phát triển khoa học kĩ thuật và công nghệ Là một bộ phận của công nghệ sinh học, công nghệ vi sinh đã và đang ngày càng phát triển mạnh mẽ

và ngày càng có những ứng dụng thiết thực vào cuộc sống Bằng việc ứng dụng các quá trình lên men vi sinh vật đã tạo ra chế phâm Một trong các chủng vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghệ lên men vi sinh

là vi khuan Acetobacter

Vi khuan Acetobacter xylinum khi nudi cAy trén méi trong dịch lỏng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh tạo nên một lớp màng trên bề mặt dung dịch, màng này có bản chất từ cellulose kết hợp với tế bào vi khuan Acetobacter xylinum — gọi là màng BC

Màng BC do vi khuẩn sản xuất ra có bản chất là cellulose cũng giống như cellulose của thực vật nhưng có một số tính chất ưu việt hơn như: độ

dẻo dai, độ bền cơ học, khả năng polymer hóa cao nên có rất nhiều ứng

dụng trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm (sản xuất thạch đừa, mang dé bao quản thực phẩm ); y học (sản xuất màng trị bỏng ); mỹ phẩm (sản xuất màng làm mặt nạ ); bảo vệ môi trường (màng để bảo quản thực phẩm ); công nghiệp (sản xuất giấy chất lượng cao )

Màng BC mới chỉ được quan tâm gần đây và mới bước đầu thu được kết quả Việc tây rửa và bảo quản màng như thế nào đề có những đặc tính (pH, độ bên cơ học, độ déo dai, khả năng thấm hút, khả năng kháng khuẩn ) phù hợp với ứng dụng trị bỏng trên thỏ đang là hướng nghiên cứu được nhiều tác giả quan tâm

Với mong muốn tìm hiểu rõ hơn, tìm ra được phương pháp tây rửa màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum để đạt được những đặc tính cơ bản và phương pháp bảo quản màng trong một thời gian nhất định không làm thay đổi tính chất có được của màng thử nghiệm ứng dụng trị bỏng trên thỏ, trên cơ sở kế thừa những kết quả của nhiều tác giả mà tôi quyết định chọn đề tài: “Wghiên cứu quy trình tấy rửa và bảo quân màng BC tạo ra từ

vi khuẩn Acetobacter”

2 Mục tiêu của đề tài

Lựa chọn phương pháp tẩy rửa màng từ vi khuẩn Acefobacter xylinum BHN; thích hợp ứng dụng trị bỏng trên thỏ

Bước đầu khảo sát phương pháp bảo quản màng

3 Nội dung tiến hành

- Tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Accetobacter xylinum BHN;

- Xử lý màng bằng 4 mô hình

- Khảo sát khả năng thấm hút nước, nghệ, thuốc kháng sinh của màng sau khi xử lý

- Bảo quán màng bằng túi hút chân không

4 Ý nghĩa của đề tài

Đề xuất ra quy trình tây rửa màng và bảo quản màng BC ứng dụng trị bỏng trên thỏ

CHƯƠNG 1: TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Phân loại vi khuan Acetobacter

1.1.1 Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter

Dé phan loai Acetobacter, ngudi ta dựa vào những tiêu chuẩn sau:

- Địa điểm nơi phân lập: có liên quan đến điều kiện môi trường sống

- Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách xắp xếp tế bào, màu sắc

tế bào khi nhuộm Gram, khả năng di động, có tiên mao hay không, vỏ nhay

- Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ giữa các yếu tố: nhiệt độ, độ pH của môi trường, khả năng hình thành sắc tố, mối quan hệ với oxy, khả năng sử dụng chất vô cơ và hữu cơ

- Đặc điểm nuôi cấy: trạng thái, đặc điểm, tính chất, màu sắc của

khuẩn lạc trên môi trường thạch Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng chú ý sự biến đổi của môi trường sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay không mùi, màu sắc môi trường có biến đổi hay không )

1.1.2 Lược sử phan loai Acetobacter

Việc nghiên cứu Acetobacter noi chung va Acetobacter xylinum noi riêng đã và đang thu hút được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước đi sâu nghiên cứu tìm hiểu Việc tiễn hành phân loại vi khuẩn Acerobarer được tiến hành từ thế kỷ XIX Trong đó có một số khóa phân loại đáng chú ý sau:

Khóa phân loại của Beijerinek năm 1899, ông đã tiến hành phân lập vi khuẩn acetic thuần khiết và chia chúng thành 4 nhóm cơ bản

Năm 1916, Janke đã tiếp theo công trình nghiên cứu của beijerinek Ông đã phân loại dựa trên 2 dấu hiệu:

+ Một là: sử dụng muối amoni làm nguồn cung cấp nitơ trong quá trình sinh trưởng và phát triển

+ Hai là: không hoặc có khả năng di động trong quá trình phát triên

- Năm 1926, Henneberg dựa vào nơi sống mà chia vi khuẩn acetic làm 4 nhóm sau:

+ Nhóm 1: vi khuẩn không sinh trưởng trên bia, vì hoa huplon độc với chúng

+ Nhóm 2: vi khuẩn sinh trưởng trên bia

+ Nhóm 3: vi khuân phát triển trên dịch rượu vang

+ Nhóm 4: vi khuẩn dùng để sản xuất giắm theo phương pháp nhanh

- Năm 1934, các nhà khoa học Hoa Kỳ đã nghiên cứu thành phần dinh dưỡng của vi khuẩn giấm thấy chúng có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản làm nguồn nitơ và nguồn cacbon nên đã xếp chúng vào

họ Nitrobacteriaceae Từ đó vi khuẩn acetie có tên gọi là Acetobacter

- Năm 1936, Kenyver, Wanneil và Staniel nghiên cứu khả năng di động của chúng thấy có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động nên xếp chúng vào họ Pseudomonadaceae

- Năm 1948, Vanghn tiễn hành nghiên cứu khả năng di động của một

số loài Acetobacter (Acetobacter aceti, Acetobacter melanoginum, Acetobacter zances, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter oxydans) nho

đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn acetic trong họ

Pseumodonadaceae

- Năm 1949, Krassilnicov nghiên cứu trên xạ khuẩn và vi khuân cùng một số tác giả người Mỹ trong các bài báo cáo của mình đều thống nhất xếp

vi khuẩn Acetobacter vao ho Pseumodonadaceae

- Theo khóa phân loại mới của Bergey và nhiều tác giả khác thi vi khuẩn Aceobacrer và Glucobacter — các vi khuẩn acetic được xếp vào họ

Acetobacteriaceae

- Năm 1914, dựa vào khả năng oxy hóa acid acetic, Bergey phân chia các loài trong Acefobacrer thành 2 nhóm:

+ Nhóm I: có khả năng oxy hóa acid acetic thành CO; và HO

Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (sinh trưởng trên môi trường Hoyer) nhu: Acetobacter aceti

Không sử dụng muối amoni là nguồn nitơ duy nhất

Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo màng nhây chứa cellulose như: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter kneizigianus

Trên môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy chứa cellulose như: Acetobacter xylium

+ Nhóm 2: không có khả năng oxy hóa acid acetic

+ Tạo thành sắc tố trên môi trường glucose: sắc tố nâu tối đến đen nhạt (Acetobacter melanogenus); sắc tô trắng hồng (Acetobacter recens)

+ Không tạo thành sắc tố: nhiệt độ thích hợp khoảng 30 - 35°C (Acetobacter sobuxydans); nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng 18 - 21°C

(Acetobacter oxydans)

Nam 1950, Frateur chính thức đưa ra một khóa phân loại mới dựa trên

các tiêu chuẩn cụ thê:

- Kha nang tao catalase

- Khả năng tổng hợp các chất ceto từ rượu bậc cao như: glycerol, manitol, sorbitol

- Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO; và HO

- Khả năng oxy hóa glucose thành gluconic

- Khả năng sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ và rượu ethylie làm nguồn cacbon ( sinh trưởng trên môi trường Hoyer )

- Tạo sắc tô nâu

Stt| Tên nhóm Vi khuẩn đại diện Đặc điểm cơ bản

Acetobacter suboxydans | Không có khả năng oxy hóa

1 |Suboxydans | Acetobacter acid acetic thành CO; và

Acetobacter ascendans | Không có khả năng tạo các

3 |Oxydans Acetobacter ransens hop chat ceto tir ruou bac

Acetobacter lovaniens cao

Không có hoạt tính Acetobacter peroxydans

Giéng vi khuan Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae,

phân bồ rộng rãi trong tự nhiên Có thể phân lập được các giống vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực, thực phẩm, giấm, rượu, bia, hoa quả Có khoảng 20 loài thuéc giéng Acetobacter di duoc phan lap va

mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa đáng kẻ

* Đặc điểm hình thái của Acefobacfer

Vi khuẩn Acefobacter bắt màu Gram âm (Gr ' ) Thông thường Acetobacter có dạng hình que, kích thước thay đổi tùy theo loài (0,3 - 0,6 x

1 - 8 um), có thể di động (có tiêm mao hoặc chu mao), hoặc không di động (không có tiêm mao), hiếu khí bắt buộc, chịu được độ acid cao, tế bào đứng riêng rẽ hoặc kết thành từng chuỗi, có khả năng tạo thành váng trên môi

trường lỏng Tùy điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi

trường nuôi cấy ), các vi khuân Acerobacter có thê sinh ra hình thái khác biệt (kéo dài hoặc phình to ra)

Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của vi khuẩn Aceobacter có hình

dạng tròn, đều, đường kính trung bình khoảng 1 - 2 mm Trên môi trường long, vi khuan Acetobacter tập trung phát triển trên bề mặt môi trường, tao thành lớp màng mỏng, trong suốt, có độ day khác nhau

Khả năng tạo váng thay đổi tùy theo loài:

Acetobacter xylinum tao thanh vang hemicellulose kha dày và chắc Acetobacfer orleanse vắng mỏng nhưng chắc

Acetobacter pasteurianum vang khô và nhăn nheo

Acetobacter suboxydans vang mong dé tan da

Acetobacter curvum sinh ra acid acetic voi néng d6 cao nhung tao váng không chắc chắn [1]

* Đặc điểm sinh trưởng

Vi khuẩn phát triển trong phạm vi nhiệt độ 12 - 35°C, pH = 3,0 - 6,5; hiểu khí tuyệt đối

Vi khuẩn Acetobacrer có khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau

để sinh trưởng và phát triển Đa số các loài Acefobacer có khả năng đồng hóa muối amôn, có khả năng phân giải pepton

Acetobacfer đòi hỏi phải có một số vitamin nhất định như acid pantothenic và các chất khoáng như K, Mg, Ca, Fe, S, P ở dạng muối vô

cơ và hợp chất hữu cơ Do có bia, dịch thủy phân nắm men, nước mạch nha, nước trái cây là nguồn dinh dưỡng tốt cho sự phát triển của vi khuân

Acetobacter Tinh chat dic trưng cua cua Acetobacter la oxy hóa rượu thành

acid acetic Ngoai khả năng lên men tạo acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin Bị, Bạ, oxy hóa propanol thành acid propionic, oxy hóa sorbit thành đường sorbose dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C, oxy hóa glycerin thành dioxyaceton, oxy hóa glucose thành acid

Acetobacter acetic [16]

1.2.2 Dac diém vi khudn Acetobacter xylium

* Dac diém hinh thai

Acetobacter xylinum c6 dang hinh que, thắng hay hơi cong, có thé di động hay không di động, không sinh bào tử Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đối do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường Chúng có thê đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi

Khuẩn lạc của Acefobacter xylinum có kích thước (đường kính khuẩn lac dat 1 — 2 mm), tron, bé mat nhay va tron bong, phan giữa khuẩn lạc lồi lên, day hơn và sẫm hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẫn [17]

* Đặc điểm sinh lý — sinh hóa

+ Dac diém sinh ly:

Vi khuan Acetobacter xylinum phat trién ở nhiệt độ 25 - 35°C, pH = 4

- 6 Nhiệt độ và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống Ở 37C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu

Acetobacter xylinum cô khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bố sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuân lạ [5]

+ Đặc điểm sinh hoá [1]

Năm 1950, Fasteur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ

vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO; và HạO; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer Theo quan điểm này Acetobacter xylinum là chung thudc chi Acetobacter, ho Pseudomonadaceae, b6 Pseudomonadales, l6p Schizomycetes Đặc điểm phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng dưới đây:

Bang 1.2 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Acefobacfer

xylinum theo Frateur (1950)

Chuyên hoá môi trường chứa

xanh sang màu vàng

2 Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí +

môi trường Hoyer

` Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau

glucose thanh acid

CaCO;

Kiêm tra khả năng ` ` og 2

sinh sac to nau

Kiém tra kha nang „ 2 Leng

tong hop cellulose

1.2.3 Sinh tong hop cellulose ctia vi khudn Acetobacter xylium

* Cau tric cellulose

Các kỹ thuật hiện đại đã xác định được cấu trúc của cellulose vi

khuẩn Kỹ thuật nhiễu xạ tia X phân biệt cdc dang cấu trúc và kích thước của cellulose vi khuẩn Các kỹ thuật phô Rama, phân tích phô hồng ngoại phố cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tỉnh của cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn có đường kính bằng 1/100 đường kính của

cellulose thuc vat (hinh 1.1) [16]

hoe

Hình 1.1: Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật

Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mịn và độ của cellulose vi khuẩn

gần bằng với độ chịu lực của nhôm Khi đem so sánh đường kính của cellulose vi khuan va cellulose nhân tạo cho thấy: kích thước của cellulose vi khuẩn còn nhỏ hơn kích thước của sợi tổng hợp hóa học có đường kính nhỏ

nhất BC là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên

két B - 1,4 glucan [12]

Các sợi mới sinh ra của BC kết hợp lại với nhau đề hình thành nên các SỢI SƠ cấp (subfibril) có chiều dài khoảng 1,5 nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên Các sợi sơ cấp kết hợp thành vi sợi (microfibril) Các sợi nằm trong các bó (bundle) và cuối cùng thành dai (ribbon)

Cấu trúc của BC phụ chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy Ở điều kiện nuôi cấy chính, vi khuẩn tổng hợp những màng celluose trên bề mặt nuôi cấy, tại danh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxi Các màng

BC được gọi là S - BC trên môi trường nuôi cấy tĩnh (S - BC: static BC)

Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đây ra từ lỗ được xếp dọc trên bề mặt

của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi và bị đây xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song như không có tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quan thé té bao Acetobacter xylinum

* Tinh chat ctia cellulose

Chung va Shyu (1999) đã nghiên cứu các tính chất của BC như độ

cứng, độ dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dịch đường, muối lên tính

chất của BC

Sản phẩm của của cellulose vi khuẩn có một số tinh chất như sau:

- Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao

- Khả năng giữ nước và độ âm cao, do đó có thé chỉnh độ xốp

- Do khả năng S - BC hình thành sẵn màng, khi ứng dụng trong làm vải không cần qua khâu đệt, làm giấy không cần qua khâu bột giấy

- Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy

-l1 Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose

trong quá trình nuôi cấy tao cellulose

- Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tông hợp mà

không gắn ligin, có thé dé dàng bị phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật Vi

vậy, cellulose vi khuẩn được xem là nguồn nguyên liệu mới có nhiều ưu thế trong tương lai [14]

* Quá trình tổng hợp cellulose của màng bacteria cellulose ở vi khuẩn Acetobacter xylium

- Vi khuan Acetobacter xylinum khi nuôi cấy trên môi trường địch lỏng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh tạo nên một lớp màng trên bề mặt dung dịch, màng này có bản chất từ cellulose kết hợp với tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum — gọi là màng BC

- Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [7]

- Các enzym tham gia quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn bao

gồm:

1PFK: fructose-1-phosphate kinase CS: cellulose synthase

PGI: phosphoglucoisomerase Fru-bi-P: fructose-1,6- bi-phosphate PGM: phosphoglucomutase UDPGlc: uridine diphosphoglucose PTS: hé théng phosphotransferase FK: fructokinase

UGP: UDP-glucose Glc-1-P: glucose-1- phosphate

pyrophosphophorylase GK: glucokinase

Fru-6-P: fructose-6-phosphate FBP: fructose-1,6-biphosphate

PGA: phosphogluconic acid phosphatase

Glc-6-P: glucose-6-phosphate G6PDH: glucose-6- phosphate

dehydrogenase

- Quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm nhiều phản ứng liên tiếp nhau, được thực hiện bởi sự tham gia của một hệ các enzym [15]

Đầu tiên enzym glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển glucose thanh glucose-6- phosphate Enzym phosphoglucomutase tiếp tục chuyên hóa glucose-6-phosphate thành glucose-I-phosphate thông qua phản ứng isomer hóa Glucose-l-phosphate nhờ enzym UDP-glucose pyrophospholyase chuyên hóa thành UDP-glucose Cuối cùng, UDP-glucose được tổng hợp nên sẽ được polymer hóa thành cellulose và cellulose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là

-13-cellulosesynthase Enzym này được hoạt hóa nhờ một nucleotide vòng là cyclic-di-GMP

Một số chủng vi khuẩn Acefobacfer xylinum có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn Hệ thống enzym phosphotransferase sẽ chuyển fructose thanh fructose-1-phosphate Sau d6 fructose-1-phosphate sé duoc chuyển hóa thành fructose-bi-phosphaie nhờ enzym fructose-l- phosphatekinase Enzym phosphoglucose 1somerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6-phosphate Glucose-6- phosphate lai tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra

cellulose [17]

Giai đoạn kết tỉnh

Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết 1,4-glucan Trong

đó, các chuỗi glucan kết hợp với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van đec van Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên két hydro tao thành các sợi cơ bán gồm 16 chuỗi glucan Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành

các bó sợi [14]

1.3 Ứng dụng của màng BC

1.3.1 Ứng dụng của màng BC trong một số lĩnh vực

Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tỉnh sạch, độ kết tinh,

độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình đạng ban đầu,

khả năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường,

bề dày của vi sợi dưới 100 nm, bị phân hủy sinh học có tính tương thích sinh học, tính trơ chuyên hóa, không độc và không gây dị ứng Màng BC có các ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực như:

Thực phẩm: BC được dùng làm món tráng miệng (thạch dừa, kem ít calori, đồ ăn nhanh, kẹo), chất nhũ hóa trong nước ép trái cây và những thức uống khác, màng bao thực phẩm [13]

Y học: điều trị tổn thương da trong ghép mô, cơ quan nội tạng, tác nhân vận chuyền thuốc (qua đường miệng và da), da nhân tạo

Mỹ phẩm: kem đưỡng da, chất làm nền cho móng nhân tạo, chất tăng

độ đày và bền cho nước làm bóng móng tay [7]

Bảo vệ môi trường: làm chất hấp thu cho các vật liệu loại bỏ chất độc

hại (làm sạch nước thải), thu hồi dầu và khoáng sản

Công nghiệp: vật liệu làm quần áo và giày dép, màng dung chuyên đổi âm thanh, làm các loại giấy đặc biệt như giấy dùng trong lưu trữ tài liệu, giấy có thời gian sử dụng lâu dài, trong vẽ, in, chất dính và chất xơ trên trang

vẽ như giấy làm phủ bề mặt láng trong công nghiệp in

1.3.2 Ứng dụng của màng BC trong điều trị bóng

Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng ngày Ngoài tốn thương da, bỏng còn gây rối loạn nội tạng, đề di chứng nặng đến khả năng vận động, thẩm mỹ va sức khỏe của người bệnh [1 1]

Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặc biệt quan trọng Đối với vết thương nông, điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụng làm giảm đau ngăn chặn các chứng nhiễm khuẩn, tạo điều kiện tốt cho quá trình tái tạo phục hồi Đối với trường hợp bỏng sâu, điều trị tại chỗ có tác dụng lớn trong việc điều trị đự phòng các biến chứng của nhiễm khuẩn tại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và dịch trong cơ thể (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức

hoại tử, tạo điều kiện tốt cho hình thành mô hạt và biểu mô hóa thành seo,

chuẩn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật Màng BC tống hợp từ Acetobacter xylinum có những đặc tính làm màng sinh hoc tri bong, mang băng vết thương, điều trị tổn thương da Trong ghép mô, cơ quan nội tạng

-15-Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu là chủng vi khuẩn Acefobacfer xylium BHN) được cung cấp từ phòng thí nghiệm vi sinh - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.2 Thiết bị

Tủ ấm, tủ say Binder (Duc)

Nồi hấp Tommy (Nhat)

Can (Precisa XT 320 M — Thuy Si)

May li tam Sorvall ( My)

May do mau UV - vis (Nhat)

May lac Orbital Shakergallenkump

Kính hiển vi quang hoc Carl Zeiss (Đức)

Tu lanh

Máy hút chân không Ammera ® V100

Buông cấy vô trùng, kính hiển vi quang học, hộp nồng, ống nghiệm,

bình tam giác,lamen, đèn cổn và một số dụng cụ hóa sinh thông dụng

khác

2.3 Hóa chất - môi trường

2.3.1 Hóa chất

- Nguồn Cacbon: Glucose, Acid acetic

- Nguồn Nitơ:, Pepton, (NH¿)¿SO¿,

- Các muối khoáng: KH¿PO¿, CaCO;, MgSO,.7H,O, NaOH

- Các chất kích thích sinh trưởng: Cao nắm men

- Thuốc thử: dung dịch Fehling, dung địch Blue Bromophenol

- Thuốc nhuộm: tím gentian, Fucshin, Lugol

- Ngoài ra còn sử dụng : các loại bia, nước dừa, các loại nước chiết

-17-2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp vi sinh

* Phương pháp đếm khuẩn lạc [3]

Phương pháp đến khuẩn lạc là phương pháp cho phép xác định số

lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu Tế bảo sống có khả

năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Đây là

phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế bào trong mẫu, độ nhậy cao,

định lượng vi sinh vật ở nồng độ thấp, nhưng khả năng sai số lớn cần phải lặp lại nhiều lần trên một độ pha loãng

Lấy I ml dịch huyền phủ có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi đùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi ở 30°C trong 5 ngày đếm

số khuân lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức

Trong đó

N: Tổng số CFU trong I ml mẫu ban đầu

A¡: Số khuẩn lạc trung bình tạo vòng phân giảm CaCO; trén đĩa

phân lập có độ pha loãng 10”

Vị : Thể tích dịch mẫu trên mỗi đĩa phân lập

10ˆ" : Là độ pha loãng của mẫu phân lập

* Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram [3]

Vai trò: Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi khuẩn dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protit đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iot

Tiến hành: Lây chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum đem nhuộm tiêu bản theo Phương pháp Gram Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus CH - 2 với độ phóng đại 1000 lần

* Bảo quản chúng giỗng trên thạch nghiêng |3] [4]

Các khuẩn lạc sau khi phân lập và xác định sơ bộ là vi khuân axetic cấy chuyên sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 3 ngày

ở tủ ấm 28 - 30°C Sau đó giữ trong tủ lạnh 4°C cho nghiên cứu tiếp theo

Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần

* Phương pháp hoạt hóa giỗng

Giống trong ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem

sử dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hóa sử dụng môi trường tiêu chân không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121C trong 8 phút Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy truyền giống từ ống thạch nghêng vào

và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ

* Phương pháp lên men tạo màng

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh tring 6 121°C trong 8 phút để tránh phân rã đường Sau đó khử khuẩn ở đèn tím trong 15 phút Bồ sung vào môi trường 5% giống hoạt hóa

Nuôi ở điều kiện tĩnh trong 7 — 10 ngày

2.4.2 Phương pháp vật lý

* Kháo sát khá năng thấm hút của màng

Nghiên cứu khả năng thấm hút của màng BC đối với nuớc, địch nghệ, kháng sinh

Sau khi xử lý màng BC chúng tôi tiến hành sây khô ở 40°C trong vòng 24h rồi cân khối lượng của màng, rồi kiểm tra khả năng thấm hút nước,

nghệ, kháng sinh (Berberin)

-19-+ Đối với nước: sau khi sấy khô, cân màng chúng tôi đem màng ngâm vào nước trong (2h, 6h, 12h) rồi lại đem cân khối lượng của màng trong thời gian trên

+ Đối với nghệ: sau khi sấy khô, cân màng chúng tôi đem màng ngâm vào nước trong (2h, 6h, 12h) rồi lại đem cân khối lượng của màng trong thời gian trên

+ Đối với thuốc kháng sinh: sau khi sấy khô, cân màng chúng tôi đem màng ngâm vào dung dịch thuốc kháng sinh (thuốc kháng sinh hòa tan trong nước) trong (2h, 6h, 12h) rồi lai dem cân khối lượng của màng trong thời gian trên

* Khảo sát khả năng ngăn cần vi khuẩn của màng [9]

Khảo sát khả năng ngăn cản vi khuẩn của màng BC và so sánh với vải gạc vô trùng đang lưu hành trên thị trường Đặt các hộp lồng có chứa môi trường dinh dưỡng và được che phủ màng BC (mang BC được xử lý, tấm dịch nghệ, tâm kháng sinh trị bỏng), gạc vô trùng ở ngoài không khí và hộp lồng chứa môi trường dinh dưỡng mở lắp trong điều kiện của phòng thí nghiệm trong 24 giờ Đưa vào tủ ấm 37°C và quan sát trong những ngày tiếp theo

2.4.3 Kiểm tra độ pH

Kiểm tra bằng cách so màu bằng giấy chỉ thị

Dùng giấy chỉ thị đặt một đầu lên màng sau khi xử lý, khi đó giấy chỉ thị sẽ hình thành màu Ta so màu của giấy chỉ thị với bảng màu để đọc độ

pH

2.4.4 Phương pháp thống kê và xử lý kết quá [6] [10]

Số trung bình cộng: ding dé tinh giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm

+M: giá trị trung bình

+ X:: giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm, từ Iđến n

+n: số lần thí nghiệm

2.4.5 Phương pháp xử lý màng

Màng sau khi lên men còn nhiều phần dư của môi trường bám lên chủ

yếu là đường và một lượng lớn acid được tạo ra Để làm sạch khuẩn, màng

có cảm quan: màu, mùi, độ dai, bền, pH vừa phái phù hợp với ứng dụng trị bỏng thử nghiệm trên thỏ thì cần phải tây rửa màng Tôi thực hiện nghiên cứu một số mô hình tây rửa màng như sau:

Mô hình 1

+ Rửa màng BC bằng nước nhiễu lần

+ ÐĐun sôi với nước trong 30 phút

Mô hình 2

+ Rửa màng BC bằng nước nhiều lần

+ ÐĐun sôi với nước trong 30 phút

+ Trung hòa với NaOH 0,1N ở nhiệt độ phòng trong 12h

+ Rửa lại bằng nước 3 lần

Mô hình 3

+ Rửa màng BC bằng nước nhiều lần

-21-+ Dun sôi với NaOH 0,5% trong 30 phút

+ Rửa lại bằng nước 3 lần

Mô hình 4

+ Rửa màng BC bằng nước nhiều lần

+ Dun sôi với NaOH 0,5% trong 30 phút

+ Trung hòa với acid citrid 5% ngâm voi NaOH 0,5N trong 12h

+ Ngâm với NaOH 0,5N trong 12h

+ Trung hòa với acid citrid 5%

2.4.6 Phương pháp bảo quản màng

Sử dụng máy hút chân không để bảo quản màng sau khi đã xử lý

Mang sau khi được xử lý chúng tôi đem sấy khô 6 40° va bao quan màng bằng túi hút chân không bằng cách sử dụng máy hút chân không hút hết không khí bên trong túi đựng màng