Phân lập, tuyển chọn, và tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho chủng acetobacter xylnum h6, chế tạo màng sinh học

Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Trường đại học sư phạm hà nội Khoa sinh - ktnn - Lô thị bảo khánh Phân lập, tuyển chọn tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng cho chủng vi khuẩn acetobacter xylinum h6, chế tạo màng sinh học Khóa luận tốt nghiệp đại học Chuyên ngành: Vi sinh vật Hà nội 2008 Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật MC LC Li cm n Bn cam oan Mc lc Danh mc bng v hỡnh t Ni dung Chng Tng quan ti liu 1.1 Lch s nghiờn cu v vi khun Acetobacter 1.2 Phõn loi Acetobacter 1.2.1.Cỏc tiờu chun phõn loi vi khun 1.2.2 Lc s phõn loi Acetobacter 1.3 c im chung ca Acetobacter 11 1.3.1 c im khun lc Acetobacter 13 1.3.2 c im mng vi khun Acetobacter trờn mụi trng lng 13 1.3.3 Nhu cu dinh dng ca chng Acetobacter 14 1.3.4 Con ng chuyn hoỏ Cacbon 14 1.3.5 c im ca mt s loi vi khun Acetobacter 15 1.4 C s khoa hc ca quỏ trỡnh lờn men axetic 18 1.5 Cỏc yu t iu kin v mụi trng nh hng 19 1.6 Mng sinh hc (Bacterial cellulose, Biocellulose BC) 20 Chng Nguyờn liu v phng phỏp nghiờn cu 22 2.1 i tng hoỏ cht 22 2.1.1 i tng 22 2.1.2 Thit b - hoỏ cht 22 2.2 Phng phỏp nghiờn cu 24 Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật 2.2.1 Phõn lp chng vi khun Acetobacter 24 2.2.2 Tuyn chn Acetobacetr cho mng 25 2.2.3 Tuyn chn vi khun Acetobacter thun khit 25 2.2.4 Phõn bit vi khun bng phng phỏp nhum Gram 26 2.2.5 Phng phỏp xỏc nh kh nng tng hp axit 27 2.2.6 Phng phỏp xỏc nh s lng t bo vi khun 28 2.2.7 Phng phỏp tuyn chn cỏc chng 28 2.2.8 Phng phỏp xỏc nh s lng t bo vi khun 29 2.2.9 Phng phỏp quy hoch hoỏ toỏn hc thc nghim 29 2.2.10 Phng phỏp to vt thng th 33 Chng Kt qu v tho lun 35 3.1 Phõn lp v tuyn chn chng vi khun Acetobacter 35 3.2 Nghiờn cu mt s c tớnh hỡnh thỏi 39 3.2.1 Quan sỏt hỡnh dng t bo vi khun Acetobacter xylinum 39 3.2.2 Kho sỏt kh nng to axit axetic ca vi khun 39 3.2.3 Nghiờn cu mt s c tớnh sinh hc ca chng 42 3.2.4 Kho sỏt kh nng to mng ca vi khun A.xylinum 43 3.3 Nghiờn cu ng thỏi sinh trng phỏt trin A xylinum H6 47 3.4 Ti u hoỏ mụi trng dinh dng cho chng vi khun H6 51 3.4.1 Thit lp mụ hỡnh toỏn hc 52 3.4.2 Ti u hoỏ 56 3.5 Bc u dựng mng BC tr bng th 58 Chng Kt lun v kin ngh 62 4.1 Kt lun 62 4.2 Kin ngh 62 Ti liu tham kho 63 Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật DANH MC BNG V HèNH Bng: Bng 1.1 Nhng c im phõn bit, so sỏnh Acetobacter 12 Bng 2.1 Thnh phn mụi trng 23 Bng 2.2 Cỏch s lý mng 34 Bng 3.1 Quan sỏt thi gian dc im mng to thnh 37 Bng 3.2 Hm lng axit axetic ca mt s chng40 Bng 3.3 c im sinh hoỏ ca chng vi khun A xylinum 42 Bng 3.4 Kho sỏt kh nng to mng ca vi khun A xylinum 43 Bng 3.5 Kho sỏt kh nng to mng ca H6 45 Bng 3.6 Tng quan gia nng pha loóng 48 Bng 3.7 Thi gian nuụi cy v hm lng t bo 49 Bng 3.8 Cỏc yu t v mc kho sỏt53 Bng 3.9 Ma trn thc nhim.54 Bng 3.10 Kim tra s thớch ng ca mụ hỡnh 56 Bng 3.11 Ti u hoỏ mụi trng 57 Bng 3.12 Din tớch vt thng cũn li thc t59 Hỡnh: Hỡnh 1.1 C ch ca quỏ trỡnh oxy hoỏ r etylic 19 Hỡnh 3.1 Mu khun lc vi khun Acetobacter nhúm 138 Hỡnh 3.2 Mu khun lc vi khun Acetobacter nhúm 338 Hỡnh 3.3 T bo chng vi khun Acetobacter xylinum 39 Hỡnh 3.4 th biu din hm lng axit axetic 40 Hỡnh 3.5 Vũng phõn gii CaCO3 ca vi khun Acetobacter xylinum 41 Hỡnh 3.6 Mng mng, dch nuụi cy c 45 Hỡnh 3.7 Mng mng, dch nuụi cy Lô Thị Bảo Khánh 45 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Hỡnh 3.8 Mng BC dy 46 Hỡnh 3.9 Mng BC ca chng H6 46 Hỡnh 3.10 th tng quan gia s lng t bo ca chng H6 49 Hỡnh 3.11 th sinh trng phỏt trin ca chng H6 50 H ỡnh 3.12 th biu din t l lnh vt thng 59 Hỡnh 3.13 Vt thng s dng mng tr bng60 Hỡnh 3.14.Vt thng s dng mng BC tm du mự u sau ngy 60 Hỡnh 3.15 Vt thng s dng mng BC tm du mự u sau 15 ngy61 Hỡnh 3.16 Vt thng khụng dựng mng BC, bụi du mự u sau 15 ngy 61 Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật T VN Ngy nay, i vi cỏc quc gia trờn th gii cụng ngh sinh hc (CNSH) khụng cũn l mt nghnh mi m m nú ó tr thnh mt nghnh kinh t ch o s phỏt trin khoa hc k thut v cụng ngh L mt b phn ca CNSH, cụng ngh vi sinh ó v ang ngy cng phỏt trin mnh m v ngy cng cú nhng ng dng thit thc vo cuc sng Bng vic ng dng cỏc quỏ trỡnh lờn men vi sinh vt ó to ch phm giỳp chỳng ta tn dng v tit kim chi phớ vic gii quyt nhiu vớ d nh nụng nghip, cụng nghip, bo v mụi trng Mt cỏc chng vi khun c s dng rng rói nht cụng ngh lờn men vi sinh l vi khun Acetobacter (cũn gi l vi khun gim) Vi khun Acetobacter xylinum nuụi cy trờn mụi trng dch lng, iu kin nuụi cy tnh s hỡnh thnh mt lp mt lp mng trờn b mt thoỏng ca dung dch, mng ny cú bn cht l cellulose kt hp vi t bo vi khun Acetobacter xylium Cụng thc cellulose vi khun sn xut cng ging nh cellulose ca t bo thc vt nhng nú cú mt s tớnh cht u vit hn: dai, bn c hc, kh nng polymer hoỏ cao Nh vo mt s c tớnh lý hoỏ vt tri m mng BC ngy c coi nh mt ngun polymer sinh hc mi, mt ngun nguyờn liu cú tim nng Hin nay, cỏc nh khoa hc ó tỡm thờm mt s tớnh nng c bit ca mng nh : bỏm chc vo b mt nc bc hi li cú th di chuyyn qua, ngn cn c s xõm nhp ca vi khun [7], [8] Nh ú m mng BC c ng dng rt nhiu cỏc lnh vc khỏc nhau: cụng ngh thc phm lm thch da l n ming khỏ ph bin, cụng ngh sn xut giy cht lng cao, y hc lm mng thay th cho da tm thi cỏc bnh nhõn bng, mt loi mng siờu thm, khoa hc vt liu mi Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật vi vic sn xut micro cht lng cao, tỏc dng bo v mụi trng sn xut EM (Effective Micorgamisms) [11] Vit Nam vic nghiờn cu, s dng mng BC mi ch c quan tõm thi gian gn õy v mi thu c nhng kt qu bc u (dựng mng p lờn vt thng h, dựng mng p mt n dng da cho ph n) [7], [8] Vic nghiờn cu mt mụi trng dinh dng ti u nht cho chng vi khun Acetobacter xylinum phỏt trin, ch to mng sinh hc trờn quy mụ cụng nghip ang l hng nghiờn cu c nhiu tỏc gi quan tõm Vi mong mun c tỡm hiu rừ hn, tỡm mụi trng dinh dng ti u cho chng vi khun Acetobacter xylinum v nhng ng dng hu ớch ca mng BC trờn c s k tha nhng kt qu thu c ca cỏc tỏc gi ó nghiờn cu trc m tụi quyt nh chn ti: Phõn lp, tuyn chn v ti u hoỏ mụi trng dinh dng cho chng Acetobacter xylinum H6, ch to mng sinh hc Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật NI DUNG Chng TNG QUAN TI LIU 1.1 Lch s nghiờn cu vi khun Acetobacter ( vi khun gim) Gim l mt sn phm rt quen thuc cú t lõu i m cho n ngy c s dng rng rói cụng nghip v i sng hng ngy T xa xa ngi ó bit lm gim da vo kinh nghim thc t ca mỡnh m h cha hiu gỡ v c s khoa hc, cng khụng gii thớch l bng cỏch no ru loóng cú th bin thnh gim n Cho n u th k XIX, khoa hc k thut phỏt trin, c bit vi s i ca kớnh hin vi, th gii vi sinh vt dn c khỏm phỏ Con ngi cng gii thớch c c ch ca quỏ trỡnh lờn men to gim (Vinnnegar) nh mt nhúm vi sinh vt m ngy cỏc nh khoa hc gi chỳng l vi khun Acetobacter hay vi khun axetic, vi khun gim [4], [5] Nm 1822, Person tin hnh nhng nghiờn cu u tiờn v vi khun Acetobacter t lp mng thu c trờn b mt cỏc bỡnh sn xut gim ễng khng nh ú l mt loi vi sinh vt, gi l Mycoderma aceti [7] n nm 1837, Kiitzing tip tc tỡm hiu sau loi b ht cỏc vi sinh vt chum lm gim v thy rng gim khụng c to thnh ễng ó a nhn xột: quỏ trỡnh lờn men gim nht thit phi cú vi sinh vt nu khụng s khụng din s chuyn hoỏ ru thnh gim Cng nm 1837, Hansen (ngi an Mch) ó tỏch c t mng gim hai loi vi khun thun khit l: Mycoderma aceti v Mycoderma pastuerianum T nm 1862 n nm 1868, Pasteur vi s tr giỳp c lc ca kớnh hin vi ó chng minh c s ỳng n nhn xột ca Kiitzing, Hansen v khng nh bn cht ca quỏ trỡnh lờn men gim ễng tip tc tin hnh Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật nghiờn cu lp mng nhy xut hin trờn b mt bia, ru vang v a n kt lun: mng ú c to thnh mt loi trc khun m ụng gi tờn l Mycoderma aceti Cựng vi nhng nghiờn cu trờn v vi khun Acetobacter, cỏc nghiờn cu tip theo cng nh nhng nghiờn cu sau ny u nhm mc ớch tỡm hiu rừ thờm v tỡm cỏch ci thin quỏ trỡnh lờn men gim Tng bc nghiờn cu nhng ng dng mi ca vi khun Acetobacter bng cỏch phõn lp cỏc chng vi khun thun khit, nghiờn cu cỏc c im cu to, sinh lý, sinh hoỏ ca chỳng tỡm nhng chng tt nht cho tng ng dng da trờn c s l cỏc tiờu chun phõn loi ó c a 1.2 Phõn loi Acetobacter 1.2.1 Cỏc tiờu chun phõn loi vi khun Acetobacter phõn loi vi khun Acetobacter cú mt s tiờu chun phõn loi : + c im phõn lp: l ni c trỳ cú liờn quan n iu kin mụi trng sng + c im hỡnh thỏi: hỡnh dng t bo, cỏch sp xp t bo, kh nng di ng, v nhy, mu sc t bo nhum Gram + c im nuụi cy: da vo trng thỏi, c im, c tớnh (trn, xự xỡ), tớnh cht (c, trong), mu scca vt mc (khun lc) trờn mụi trng thch Khi nuụi cy trờn mụi trng lng cn lu ý n s bin i ca mụi trng sau mt thi gian nuụi cy (mụi trng c hay trong, cú mựi thm hay khụng mựi, cú mu vng nõu hay vng nht) + c im sinh hoỏ (theo khoỏ phõn loi ca Pasteur, 1950) - Kh nng to catalase - Kh nng tng hp cỏc xeto t cỏc ru bc cao nh: glyxerol, manitol, sorbitol - Kh nng oxi hoỏ axetat thnh CO2 v H2O Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật - Kh nng oxi hoỏ glucoz thnh axit gluconic - Kh nng s dng mui amon lm ngun nit mụi trng Hoyer v s dng ru etylic lm ngun cacbon - Kh nng to sc t nõu - Kh nng tng hp cellulose Ngoi cỏc tiờu chun trờn, hin phõn loi Acetobacter, cỏc tỏc gi cũn s dng sinh hc phõn t gii trỡnh t rARN 16S 1.2.2 Lc s phõn loi Acetobacter Ngay t th k XIX, cỏc tỏc gi ó tin hnh phõn lp Acetobacter thnh cỏc chng thun khit v tin hnh phõn loi chỳng Trong ú, khúa phõn loi ca Beijerinck (1899) ó thu hỳt c s quan tõm ca nhiu tỏc gi ễng ó chia vi khun axetic thnh nhúm c bn Nm 1916 k tip nghiờn cu ca Beijerinck, Janke ó phõn loi vi khun axetic thnh nhúm da trờn du hiu sau: - Mt l: kh nng s dng m amoni thc hin quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin ca mỡnh - Hai l: cú hay khụng giai on di ng quỏ trỡnh phỏt trin Da vo ni sng c trng ca vi khun axetic m nm 1926, Heneberg ó chia chỳng thnh nhúm khỏc nhau: - Nhúm 1: vi khun khụng phỏt trin trờn bia vỡ hoa hublon c vi chỳng - Nhúm 2: vi khun cú kh nng phỏt trin trờn bia - Nhúm 3: vi khun phỏt trin dung dch ru vang - Nhúm 4: vi khun sn xut gim theo phng phỏp nhanh Nm 1934, theo cỏc nh vi khun hc Hoa K, vi khun axetic cú kh nng s dng cỏc hp cht tng i n gin ca C v N t ú vi khun axetic cú tờn l vi khun Acetobacter Lô Thị Bảo Khánh 10 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Hỡnh 3.11 th sinh trng phỏt trin ca chng H6 Da vo th trờn ta thy : + T 24h : s lng t bo dch nuụi cy tng lờn u nhng mc tng chm Giai on ny vi khun lm quen vi mụi trng, tớch lu cht dinh dng v nng lng cho cỏc giai on sinh trng tip theo õy l thi gian ca pha tim phỏt, cha thy mng xut hin + T 24 48h : l pha cp s m (hay pha log) pha ny s lng t bo tng nhanh vỡ tc sinh trng riờng ca chỳng t cc i, cha thy mng xut hin + T 48 72h : l pha cõn bng ng, biu hin ca pha ny l s lng t bo dch nuụi cy tng i n nh Cú th gii thớch hin tng ny l mt s t bo sinh nhng mt s t bo khỏc li b phõn hu dn n tng s lng t bo c qun th dch l khụng i, giai on ny thy mng xut hin + T 72h tr i s lng t bo dch nuụi cy gim mnh, õy l thi gian ca pha suy vong giai on ny s lng t bo cht nhiu Lô Thị Bảo Khánh 51 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật ngun cht dinh dng dn cn kit, khụng cung cp cho cỏc t bo sinh trng phỏt trin hoc cỏc vi khun khụng phõn chia na ng thỏi phỏt trin ca chng vi khun Acetobacter xylinum H6 phự hp vi ng thỏi phỏt trin ca vi sinh vt núi chung v cỏc tỏc gi nhiờn cu t trc [6], [7], [8] Nh vy: da vo ng thỏi sinh trng ca chng H6 thy mng BC hỡnh thnh t ngy th sau ú n nh ngy vy thu mng tt nht l t 72 96 h, ng vi pha cõn bng 3.4 Ti u hoỏ mụi trng dinh dng cho chng vi khun Acetobacter xylinum H6 Cng nh tt c cỏc vi sinh vt cú nhõn nguyờn thu quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin ca mỡnh vi khun Acetobacter chu nh hng ca rt nhiu yu t mụi trng nuụi cy Cú th chia chỳng thnh: + Nhúm cỏc yu t thnh phn mụi trng dinh dng nuụi cy: glucoz, pepton, (NH4)2SO4, CaHPO4 + Nhúm cỏc yu t iu kin nuụi cy: nhit , pH, thi gian nuụi cy Do iu kin cũn hn ch, chỳng tụi cha th tin hnh nghiờn cu tt c cỏc yu t nh hng n sinh tng hp mng BC ca chng Acetobacter xylinum Trong phm vi ti ca mỡnh tụi ch i sõu ti u hoỏ mụi trng dinh dng cho chng Acetobacter xylinum H6, theo phng phỏp quy hoch hoỏ toỏn hc thc nghim da trờn c s l nhng nghiờn cu v ng thỏi sinh trng phỏt trin ca chỳng Theo tỏc gi inh Th Kim Nhung [9] mụi trng dinh dng nh hng n s sinh trng phỏt trin ca ca vi khun Acetobacter l t cỏc ngun: ngun cug cp C t glucoz, ngun cug cp N bao gm: N vụ c ca (NH4)2SO4 v N hu c ca pepton, cao nm men , ngun cung cp P gm Lô Thị Bảo Khánh 52 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật CaHPO4, KH2PO4, ngun cung cp S l t MgSO4 Da vo ú cng nh thnh phn mụi trng c s (MT2) vic to mng chỳng tụi quyt nh la chn phng phỏp Box Wilson (phng hỏp dc) ng thi dn dt cỏc yu t ti cựng mt vựng ti u Mc ớch ca quỏ trỡnh ny l ti u hoỏ mụi trng dinh dng cho chng vi khun Acetobacter xylinum H6 thu mng BC t c yờu cu : mng, dai, thi gian to mng ngn v n nh T ú ỏp dng ch to mng sinh hc trờn quy mụ cụng nghip s em li li ớch kinh t v cú ý ngha ln Do vy chỳng tụi quyt nh ti u hoỏ mụi trng dinh dng cho chng Acetobacter xylium H6 3.4.1 Thiờt lp mụ hỡnh toỏn hc ti u hoỏ mụi trng nuụi cy Chỳng tụi ó tin hnh ti u húa mụi trng vi cỏc yu t l: Hm lng ng (Glucoz), pepton, (NH4)2SO4 - Cỏc yu t c nh: Cỏc yu t iu kin nuụi cy: nhit , pH, thi gian nuụi cy Cỏc yu t mụi trng dinh dng : KH2PO4, MgSO4.7H2O,cao nm men, ru Hm lng ging ban u - Cỏc yu t thay i: Hm lng ng (Glucoz) (x1) Pepton (x2) (NH4)2SO4 (x3) * Ch tiờu t c l hm mc tiờu y vi lng mng tiờu chun bng 3,4 (g) bỡnh tam giỏc 250ml + Qua nghiờn cu th nghim chỳng tụi ó xỏc nh khong cú ngha ca cỏc bin s x1, x2, x3 nh bng sau: (vi khong bin thiờn = 2) Lô Thị Bảo Khánh 53 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Bng 3.8 Cỏc yu t v mc kho sỏt ng Pepton (NH4)2SO4 (x1, g) (x2, g) (x3, g) Mc thp (-) 18 Mc c s (0) 20 Mc cao (+) 22 Cỏc yu t kho sỏt + Mụ hỡnh toỏn hc cn thit lp biu din mi liờn hgia hm mc tiờu vi cỏc bin s cú dng: y b0 b1~ x1 b2 ~ x2 b3 ~ x3 Trong ú: y: l hm mc tiờu (khi lng mng) ~ x1 , ~ x2 , ~ x : l bin mó ca yu t ng, pepton, (NH4)2SO4 b0, b1, b2, b3 : cỏc h s + Thit lp ma trn theo phng phỏp thc nghim yu t y : Ma trn thc nghim vi n=3, s thớ nghim N= 23, kt qu thớ nghim c trỡnh by bng sau: Lô Thị Bảo Khánh 54 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Bng 3.9 Ma trn thc nghim Khi lng mng ti (g) N ~ x1 ~ x2 ~ x3 x2 + + + + + + x2 S 2j x3 y1 22 4,168 4,256 4,848 4,424 0,137 - 22 4,275 3,702 3,657 3,878 0,119 - + 22 3,472 2,532 2,982 2,964 0,179 + - - 22 3,056 2,765 2,624 2,815 0,049 - + + 18 3,210 3.914 3,512 3,545 0,125 - + - 18 3,128 3,416 2,945 3,163 0,056 - - + 18 2,253 2,761 2,534 2,516 0,065 - - - 18 2,156 1,917 2,245 2,109 0,029 y2 y3 y *) Kim tra s hi t cỏc s liu theo tiờu chun Cochran S 2j max 0,179 GTT N 0,236 GB 0,156 0,759 S j j Trong ú GB c tỡm bng cỏch tra bng chun Cochran bit bc t f1= k-1 v f2 =N=8 Nh vy cỏc sai s hi t hay cỏc thớ nghim c o cựng mt chớnh xỏc nh *) Tớnh cỏc h s ca phng trỡnh hi quy: N y b0 j N b1 Lô Thị Bảo Khánh j 25,414 3,177 N ~ 4,121 yx1 0,515 N j 55 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật s b2 b3 ,313 , 664 2, 405 ,3 Mụ hỡnh toỏn hc c thit lp l: y 3,177 ,515 ~ x1 ,664 ~ x ,3 ~ x3 *) Kim tra s cú ngha ca cỏc h s theo tiờu chun Student H s ca mụ hỡnh cú ngha: bi Sb t Vi N= 8, f= N(k- 1) = 16 tra bng phõn phi Student tỡm c t= 2,12 vi = 0,05 Phõn phi trung bỡnh cho tng thớ nghim: N S Sy2 j j N 0,759 0,095 Phõn phi trung bỡnh cựng loi cho mi ln o y S Sy2 k 0,095 0,032 Phõn phi m cc h s xỏc nh Sb Sy2 B 0,032 0,089 Vi i = 1,2,3 ta u cú bi Sb t 0,089.2,12 0,188 Nh vy mi h s ca phng trỡnh hi quy ó xỏc nh u cú ngha *) Kim tra s thớch ng ca mụ hỡnh, ta cú bng sau: Lô Thị Bảo Khánh 56 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Bng 3.10 Bng kim tra s thớch ng ca mụ hỡnh Khi lng mng ti (g) N Mụ hỡnh yTT y TN y TT yTN 3,177+0,515+0,644+0,3 4,576 4,424 0,023 3,177+0,515+0,644-0,3 4,036 3,878 0,025 3,177+0,515-0,644+0,3 3,348 2,964 0,147 3,177+0,515-0,644-0,3 2,748 2,815 0,004 3,177-0,515+0,644+0,3 3,606 3,545 0,004 3,177-0,515+0,644-0,3 3,006 3,163 0,025 3,177-0,515-0,644+0,3 2,318 2,515 0,039 3,177-0,515-0,644-0,3 1,718 2,109 0,153 STU Ta cú: 2 0,42 yTN yTT 0,105 j N B FTT Nh vy mụ hỡnh: 0,105 3,281 F minS ; S 0,032 max S y2 ; STU y TU B 4,77 y 3,177 0,515~ x1 0.664~ x2 0,3~ x3 l hon ton thớch ng Qua mụ hỡnh ta thy c yu t: ng, pepton, (NH4)2SO4 u nh hng n kh nng to mng Trong yu t thỡ pepton l yu t quan trng nht 3.4.2 Ti u hoỏ mụi trng nuụi cy Tỡm cỏc giỏ tr tuyt i bi i b11 0,515 1,03 b2 0,644.2 1,288 b3 0,3.2 0,6 Lô Thị Bảo Khánh 57 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Vy : max b i i b 1, 288 Chn lng pepton l bin c s ( xcs ) xcs x2 x1 2,03 1,576 1,288 x3 0,6 0, 466 1, 288 Bng 3.11 Ti u húa mụi trng ng Pepton SLGB Khi lng mng ti (gam) N (gam) (gam) (ml) y1 y2 y3 y 16,848 2,068 4,012 4,645 3,704 4.12 18,424 2,534 3,258 3,463 3,395 3.372 20 3,024 2,769 3,207 21,576 3,466 3,145 3,929 3,864 3.646 23,152 3,832 4,254 4,650 4,012 4.244 Qua bng trờn ta thy: t hm mc tiờu (ymax) thỡ thớ nghim thớch hp nht l thớ nghim vi lng ng l 18.424(g), pepton l (g), (NH4)2SO4 l 2,534(g) Kt qu thu c cú th c gii thớch nh sau: glucoz tham gia vo quỏ trỡnh chuyn hoỏ , cú vai trũ s hỡnh thnh tớnh dy mng ca mng BC Theo tỏc gi Hong Joo Son, 2001 [12] sn xut mng BC dy ó a vo mụi trng 40 g ng glucoz Theo chỳng tụi to mng mng b sung 18,424 l hon ton phự hp Vi N cú vai trũ tham gia vo cu trỳc t bo vi khun Kt qu nghiờn cu u khng nh ngun N hu c v N vụ c u cú ý ngha i vi vic tng hp tng hp cellulose ca chng Acetobacter xylinum H6 Trong ú theo Hong Joo Son Lô Thị Bảo Khánh 58 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật [12] thỡ pepton c coi l cht kớch thớch sinh trng i vi Acetobacter Khi vi khun sinh trng tt thỡ quỏ trỡnh trao i cht din mng m v sn phm trao i cht mng BC s rt ln Vi mc ớch l ch to mng mng nờn theo chỳng tụi vi lng pepton = 5g v (NH4)2SO4 = 3,466g l phự hp Nh vy: thnh phn mụi trng cha hm lng ng l 18,424 (g), pepton l (g), (NH4)2SO4 l 2,534 gam lm mụi trng dinh dng ch to mng BC 3.5 Bc u dựng mng tr bng th Chng vi khun Acetobacter xylinum H6 c chỳng tụi la chn t quỏ trỡnh nghiờn cu ca mỡnh Qua vic kho sỏt kh nng to mng ca chng H6 trờn cỏc mụi trng khỏc nhau, chỳng tụi quyt nh la chn mụi trng l mụi trng c s cho vic ti u hoỏ mụi trng dinh dng cho chng H6 Ti u hoỏ mụi trng dinh dng phự hp nhm mc ớch ch to mng sinh hc, búc u ng dng thc nghim Chỳng tụi tin hnh quỏ trỡnh lờn mờn iu kin thớch hp v mụi trng dinh dng ti u ó thu c trờn Sau ngy tin hnh thu mng ca chng vi khun Acetobacter xylinum H6, chỳng tụi nhõn thy mng thu c khỏ ng nht, mng khong 0,8 1,2 mm Lng mng thu c chỳng tụi tin hnh x lý theo quy trỡnh v nghiờn cu kh nng tr bng trờn i tng th nghim l th nhm thay th da tm thi Th nh kho mnh trng lng t 1,4 1,6 kg gõy bng bng cỏch ct mt ming da khong cm2, dựng mng thu c cú tm du mự u, ng kớnh khong 10cm p lờn vt thng h Du mự u l mt cht sỏt khun rt tt Mng cú c im sau: + Trng trong, d quan sỏt tỡnh trng vt thng + Ngn khụng cho cỏc vi khun xõm nhp, che kớn vt thng, hỳt cỏc dch r vt thng Lô Thị Bảo Khánh 59 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật + Lm mỏt vt thng, cú tỏc dng thay th da tm thi, cú th thay mng thng xuyờn m khụng gõy au rỏt cho vt thng [8] Chỳng tụi b trớ thnh lụ thớ nghim : + Lụ 1: p mng BC cú tm du mự u lờn vt bng + Lụ 2: p gc y t cú tm du mự u lờn vt bng + Lụ 3: ch bụi du mự u lờn vt bng + Lụ 4: vt bng t lnh Sau ú theo dừi tỡnh trng vt thng xem cú nhim trựng hay khụng, ỏnh giỏ tỡnh trng lnh vt thng chỳng tụi tin hnh o din tớch vt thng cũn li theo thi gian Kt qu thu c nh sau : Bng 3.12 Din tớch vt thng cũn li thc t (cm2) Ngy Lụ 12 15 3,36 2,98 2,36 0,81 0,41 3,79 3,25 2,97 1,64 1,42 3,64 3,18 2,85 1,46 1,24 4 3,84 3,54 3,12 2,01 1,76 90 80 70 60 T l lnh vt 50 thng (%) 40 30 20 10 Lụ Lụ Lụ Lụ ngy 12 15 Hỡnh 3.12 th biu din t l (%) lnh vt thng theo thi gian Lô Thị Bảo Khánh 60 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật T kt qu trờn ta thy rng: lụ c iu tr bng, mng BC cú tm du mự u trờn i tng l th cú thi gian lnh vt thng nhanh nht Chỳng tụi mong mun c ng dng th nghim dựng mng BC trờn bnh nhõn bng v sn xut ch phm BC y hc Nh vy: mng BC cú tm mự u cú thi gian lnh vt thng nhanh nht: 15 ngy t l lnh vt thng l 89,75% trờn i tng ng vt th nghim l th Hỡnh 3.13 Vt thng s dng Hỡnh 3.14 Vt thng dựng mng mng BC tr bng Lô Thị Bảo Khánh BC ngy 61 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Hỡnh 3.15 S dng mng BC tm Hỡnh 3.16 Vt thng khụng dựng du mự u sau 15 ngy mng BC, bụi du mự u sau 15 ngy Lô Thị Bảo Khánh 62 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Chng KT LUN V NGH 4.1 Kt lun T ngun nguyờn liu l bia hi H Ni v gim lm theo phng phỏp th cụng chỳng tụi ó phõn lp c 20 mu vi khun axetic ú cú chng l vi khun Acetobacter xylinum Khi tin hnh th kh nng to mng ca chng trờn chỳng tụi ó la chn c chng Acetobacter xylinum H6 cú kh nng to mng mng, dai, bn, chc ỏp ng c yờu cu ch to mng sinh hc Nghiờn cu c mt s c tớnh sinh hc, ng thỏi phỏt trin ca chng H6 Ti u hoỏ c mụi trng dinh dng vi thnh phn: hm lng ng (glucoz) l 18.424(g), pepton l (g), (NH4)2SO4 l 2,534(g)cho chng Acetobacter xylinum H6 theo phng phỏp toỏn hc thc nghim Bc u ng dng th nghim trờn th tr bng, thay th da tm thi 4.2 ngh õy ch l nhng nghiờn cu bc u ca chỳng tụi v vi khun Acetobacter xylinum H6 cho mng mng vi mc ớch ti u hoỏ mụi trng dinh dng v ch to mng sinh hc Nhng nhng hn ch nht nh v thi gian v kh nng chỳng tụi ch mi nghiờn cu c mt s cỏc c im sinh hc, tỡm c mụi trng dinh dng vi yu t c ti u cho chng vi khun Acetobacter xylinum H6 v bc u ng dng tr bng th Tụi mong rng, thi gian ti s c to iu kin tip tc nhng nghiờn cu sõu hn v i tng Acetobacter xylinum H6 v cỏc lnh vc nh: la chn mụi trng ti u v nhiu yu t hn cho chng phỏt trin, ng dng th nghim mng BC cho cỏc bnh nhõn bng, sn xut mng trờn quy mụ cụng nghip ng dng y hc õy l hng nghiờn cu cú trin vng hin Lô Thị Bảo Khánh 63 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật TI LIU THAM KHO Nguyn Lõn Dng v cng s, 1972 Mt s phng phỏp nghiờn cu vi sinh vt hc, Tp 1, Nh xut bn Khoa hc v k thut, H Ni Nguyn Lõn Dng v cng s, 1976 Mt s phng phỏp nghiờn cu vi sinh vt hc, Tp 2, Nh xut bn Khoa hc v k thut, H Ni Nguyn Lõn Dng v cng s, 1978 Mt s phng phỏp nghiờn cu vi sinh vt hc, Tp 3, Nh xut bn Khoa hc v k thut, H Ni Nguyn Thnh t, Nguyn Duy Tho, Vng Trng Ho, 1990 Thc hnh vi sinh vt hc, nh xut bn Giỏo dc, trang 213- 278 ng Th Hng, 2007 Phõn lp, tuyn chn v nghiờn cu mt s c tớnh sinh hc ca vi khun Acetobacter xylinum, ch to mng sinh hc (BC) Lun thc s khoa hc Hunh Th Ngc Lan, Nguyn Vn Thanh, 2001 Nghiờn cu to mng sinh hc tr bng t Acetobacter xylinum Y hc thc hnh, S Hunh Th Ngc Lan, Nguyn Vn Thanh, 2001 Nghiờn cu cỏc c tớnh mng cellulose t vi khun Acetobacter xylinum s dng lm mng tr bng Tp Dc hc, s 361, trang 18-20 inh Th Kim Nhung, Nghiờn cu mt s c im sinh hc ca chng Acetobacter v ng dng lờn men Axờtic theo phng phỏp chỡm Lun ỏn phú tin s khoa hc ,1995 inh Th Kim Nhung, 1997 Phõn lp v tuyn chn mt s chng Acetobacter ng dng lm thch da Thụng bỏo khoa hc Trng i hc s phm H Ni 2, s 1, trang 181- 186 10 inh Th Kim Nhung, 1995 Ti u húa thnh phn mụi trng dinh dng cho vi khun Acetobacter bng phng phỏp quy hoch húa toỏn hc thc nghim Tp Sinh hc, s Lô Thị Bảo Khánh 64 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật 11 Haim W, Shai S., Dorit A, Yehudit S., Gail V, Patriccia O, Moshe B, 1997 Cdi-binding protein, a new factor regulating cellulose synthesis in Acetobacter xylinum FEBS letter 416, 207- 201 12 Hong J.S, Moon S.H, Young G.K and Sang J.L, 2001 Opimization of fermentation condittion for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter A9 in shacking cultures Biotecchnool Appl.Biochem 331-5 (printed in Great Britain) 13 Kiyoshi T., Tomoko Asakura, Masahiro Fukaya, Etsuzo Entani and Yoshiya Kawamura Cellulose Production by acetic acid- Resistant Acetobacter xylinum 14 Czafa, W., Young , D.J.; Kawechi, M Brown R.M.Je, 2007 The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications Biomacromolecules 8, 1- 12 15 Cienchanska D, 2004 Multifuntional bacterial cellulose chitosan composite materials for medical applications Fibres and Textiles in Easter Europe 12 69 72 16 Embuscado, M, Marks, I., and Miller, J., (1994) Bacterial cellulose I Factors affecting the production of Acetobacter xylinum Food Hydrocolloids, No 5, 407 418 Lô Thị Bảo Khánh 65 Lớp K30b- Sinh [...]... nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật b/ Khụng to sc t - Nhit thớch hp nht l 30 - 350C: Acetobacter suboxydans - Nhit thớch hp nht l 18 - 210C: Acetobacter oxydans Khoỏ phõn loi ca Frateur c nhiu ngi ng h vi 4 nhúm vi khun axetic l: Acetobacter subosydans Acetobacter mezoxydans Acetobacter oxydans Acetobacter peroxydans Cho n nay, khoỏ phõn loi ca Bergey v nhiu tỏc gi khỏc xp vi khun Acetobacter v vi khun... cellulose, i din l : Acetobacter xylinum + Trờn mụi trng dch th khụng to mng nhy cha cellulose, i din l: Acetobacter pasteurianum, Acetobacter kneiziiganus, Acetobacter rancens Loi 2: khụng cú kh nng oxi hoỏ axit axetic a/ To sc t nõu trờn mụi trng glucoz - Sc t nõu ti ti en nht i din l: Acetobacter melanogenus - Sc t hng, i din l: Acetobacter rasens Lô Thị Bảo Khánh 11 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp...Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật n nm 1936, cỏc tỏc gi Kenyver, Wanneil, Staniel cựng xut ý kin ghộp vi khun Acetobacter vo h Pseudomonas do chỳng co hin tng ghộp cc xon phn di ng Nm 1948, Vanghn tip tc nghiờn cu v cụng b kt qu thu c khi quan sỏt s di ng ca nhiu loi vi khun: Acetobacter aceti, Acetobacter oxydans, Acetobacter zancens, Acetobacter melanoginum, Acetobacter. .. Acetobacter 1.3.3 Nhu cu dinh dng ca vi khun Acetobacter [1] Trong quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin, nhu cu dinh dng ca vi khun Acetobacter l rt phong phỳ Ngun C, N v cỏc cht kớch thớch sinh trng cung cp cho quỏ trỡnh ny l ht sc a dng: ngun C cú th cung cp t cỏc hp cht ng: glucoz, saccaroz, ru etylic v axit hu c Mui amon lm ngun cung cp N, mui photphat lm ngun P Ngoi ra, cỏc cht sinh trng nh: cỏc axit... cỏc chng Acetobacter cho mng mng Vic tuyn chn cỏc chng Acetobacter xylinum cho mng mng, dai phi thụng thụng qua mt s ch tiờu sau: + Quan sỏt quỏ trỡnh hỡnh thnh mng: thi gian to mng, c im nuụi cy + Kớch thc v hỡnh dng t bo nhum Gram + Kim tra c tớnh sinh hoỏ ca chng vi khun phõn lp + Kim tra dy mng v tớnh chu lc ca mng Lô Thị Bảo Khánh 29 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật... cựng mt lỳc theo ngụn ng toỏn hc Phng phỏp ny cho phộp xỏc nh thnh phn mụi trng v iu kin nuụi cy, Lô Thị Bảo Khánh 30 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật thớch hp cho qỳa trỡnh lờn men axetic, s phỏt trin ca vi khun Acetobacter xylinum ng thi to mng sinh hc Phng phỏp ny gm 2 bc: 2.2.9.1 Thit lp mụ hỡnh toỏn hc Thit lp mụ hỡnh toỏn hc cho phộp ta thy c mi liờn h gia hm mc tiờu... Glucobacter thuc vo mt h riờng tờn l: Acetobacteriaceae Sau ny rt nhiu nh khoa hc vn tip tc nghiờn cu v vn cũn nhiu tranh lun khỏc nhau v s phõn loi ng nht vi khun Acetobacter nhng tt c cỏc nghiờn cu trờn u to c s cho nhng nghiờn cu tip theo, ng thi ó to iu kin thun li cho vic ng dng vi khun Acetobacter vo i sng thc tin 1.3 c im chng ca Acetobacter [4], [6], [7], [8] Vi khun Acetobacter l tỏc nhõn chớnh ca... men axetic [4] Ebner v Hromatka (1949 1953) cho rng: axit axetic c to thnh bi chớnh t bo sinh sn Di tỏc dng ca vi khun Acetobacter m nh quỏ trỡnh lờn men ru etylic to thnh axit axetic Bi vy cỏc yu t nh: thnh phn mụi trng, nhit , ch thụng khớu nh hng n quỏ trỡnh lờn men Lô Thị Bảo Khánh 20 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật Vi khun Acetobacter l loi vi khun a m, nhit thớch... Bảo Khánh 24 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật 2.2.Phng phỏp nghiờn cu 2.2.1 Phõn lp chng vi khun Acetobacter (vi khun gim) theo phng phỏp Vinogradski [1], [2], [3] cú c chng vi khun Acetobacter chỳng tụi tin hnh phõn lp t ngun nguyờn liu l bia hi H Ni, gim lm theo phng phỏp c truyn Trc ht cn thc hin quỏ trỡnh lờn men t ngun nguyờn liu trờn Vi khun Acetobacter l loi vi khun... thu Lô Thị Bảo Khánh 25 Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật tinh trang mt ln khp mt thch Bao gúi cn thn v ct trong t m 28oC -30oC Sau 3 4 ngy trờn mụi trng thch cú xut hin cỏc khun lc riờng r Da vo c im ca khun lc nh: kớch thc, mu sc, trn búng m ta so sỏnh, i chiu m chn ra khun lc ca vi khun Acetobacter 2.2.2 Tuyn chn chng Acetobacter cho mng cellulose theo phng phỏp Graxinop ... lp, tuyn chn v ti u hoỏ mụi trng dinh dng cho chng Acetobacter xylinum H6, ch to mng sinh hc Lô Thị Bảo Khánh Lớp K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật NI DUNG Chng TNG QUAN... Nhu cu dinh dng ca vi khun Acetobacter [1] Trong quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin, nhu cu dinh dng ca vi khun Acetobacter l rt phong phỳ Ngun C, N v cỏc cht kớch thớch sinh trng cung cp cho quỏ... K30b- Sinh Khoá luận tốt nghiệp Chuyên nghành vi sinh vật 3.2.Nghiờn cu mt s c tớnh hỡnh thỏi, sinh lý, sinh hoỏ ca cỏc mu vi khun Acetobacter xylinum 3.2.1 Quan sỏt hỡnh dng t bo vi khun Acetobacter