phỏp Vinogradski [1], [2], [3]
Để cú được chủng vi khuẩn Acetobacter chỳng tụi tiến hành phõn lập từ
nguồn nguyờn liệu là bia hơi Hà Nội, giấm làm theo phương phỏp cổ truyền. Trước hết cần thực hiện quỏ trỡnh lờn men từ nguồn nguyờn liệu trờn. Vi
khuẩn Acetobacter là loại vi khuẩn hiếu khớ sau một thời gian chỳng sẽ hỡnh
thành một lớp màng trắng, dai trờn mụi trường dịch thể, đú chớnh là tập hợp cỏc tế bào vi khuẩn axetic. Từ cỏc mẫu màng trờn chỳng tụi tiến hành rửa sạch, cho vào ống nghiệm đựng nước cất thanh trựng, lắc đều bằng mỏy vontex thu được ống nghiệm đựng mẫu màng gốc.
Khi phõn lập cần pha loóng nồng độ vi sinh vật. Chỳng tụi sử dụng phương phỏp pha loóng Pasteur. Ban đầu chuẩn bị 10 ống nghiệm cú định mức 10ml, cú đậy nỳt bụng và đó sấy khử trựng. Đỏnh số thứ tự và cho vào mỗi ống nghiệm trờn 9ml nước cất bằng pipet vụ trựng. Sau đú, dựng pipet vụ trựng hỳt 1ml dịch từ ống nghiệm đựng mẫu màng gốc cho vào ống nghiệm thứ nhất, đậy nỳt bụng và lắc đều ống nghiệm bằng mỏy vontex (để vi sinh vật phõn bố đều trong ống nghiệm) ta được dung dịch pha loóng ở nồng độ 10-1. Tiếp tục dựng pipet lấy 1ml dung dịch của ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ 2, đậy nỳt, lắc đều ta thu được dung dịch cú nồng độ 10-2. Với cỏc thao tỏc lặp lại như trờn ta sẽ thu được dung dịch pha loóng ở cỏc nồng độ 10-3, 10-4 …10-10. Mức độ pha loóng này sẽ phản ỏnh số lượng vi khuẩn cú trong mẫu ống nghiệm. Chỳng tụi lựa chọn mẫu cú độ pha loóng 10-4 đến 10-6 để tiến hành cỏc bước tiếp theo.
Phương phỏp thạch đĩa: chuẩn bị MT1 đó hấp khử trựng, đổ vào cỏc hộp petri và để nguội. Dựng pipet vụ trựng hỳt và nhỏ một giọt dung dịch (cú độ pha loóng 10-4 đến 10-6) vào hộp petri dẫ chuẩn bị trờn. Dựng bàn trang thuỷ
tinh trang một lần khắp mặt thạch. Bao gúi cẩn thận và cất trong tủ ấm ở 28oC -30oC. Sau 3 – 4 ngày trờn mụi trường thạch cú xuất hiện cỏc khuẩn lạc riờng rẽ. Dựa vào đặc điểm của khuẩn lạc như: kớch thước, màu sắc, độ trơn búng
mà ta so sỏnh, đối chiếu mà chọn ra khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter. 2.2.2. Tuyển chọn chủng Acetobacter cho màng cellulose theo phương phỏp Graxinop [1], [2], [3]
Trước khi tuyển chọn cần nhõn giống cỏc chủng vi khuẩn bằng cỏch : dựng que cấy đầu trũn (đó khử trựng trờn ngọn lửa đốn cồn) gợt lấy một khuẩn lạc riờng rẽ, đủ tiờu chuẩn cấy vào một ống nghiệm đó được đổ thạch (MT2 , đặt nghiờng, để nguội) theo đường ziczac. Đỏnh dấu cỏc ống nghiệm bằng một kớ hiệu riờng, để trong tủ ấm ở 28oC – 30oC, sau 3 – 4 ngày vi khuẩn sẽ phỏt triển theo đường cấy.
Tuyển chọn cỏc chủng vi khuẩn Acetobacter trong mụi trường oxy hoỏ
(mụi trường dich thể - MT2) để kiểm tra khả năng tạo màng. Sau 3 lần liờn tiếp tuyển chọn chỳng tụi thu cỏc chủng cú khả năng tạo màng tốt nhất để sử dụng cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
Để giữ giống cần tiến hành cấy chuyển giống từ ống thạch nghiờng này sang ống thạch nghiờng khỏc với chu kỡ 2 thỏng 1 lần.
2.2.3. Tuyển chọn cỏc chủng vi khuẩn Acetobacter thuần khiết [5]
Sau khi đó cú chủng vi khuẩn axetic cho lờn men trờn mụi trường oxy
hoỏ, tiến hành tuyển chọn chủng Acetobacter thuần khiết dựa trờn đối chiếu,
định loại đặc điểm khuẩn lạc trờn mụi trường A và mụi trường B. Thành phần MTA và MTB như sau:
Mụi trường A Mụi trường B Dịch chiết nấm men 3% Rượu etylic 15%- 2ml CaCO3 2% Agar 2% Dịch chiết nấm men 3% Rượu etylic 15%- 2ml Xanh lục Bromocresol 1 mg của dung dịch 2,2%
Ở mụi trường A: nuụi cấy vi khuẩn axetic nếu là Gluconobacter thỡ cú một vũng sỏng xung quanh khuẩn lạc, nếu là Acetobacter thỡ vũng sỏng rừ
hơn và cú một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc huớng về phớa vũng sỏng.
Ở mụi trường B: nuụi cấy vi khuấn axetic nếu là Gluconobacter làm mụi trường biến đổi thành màu vàng, nếu là Acetobacter cũng làm mụi
trường biến đổi thành màu vàng nhưng cú một màu xanh lơ do quỏ trỡnh oxy hoỏ axit.
2.2.4. Phõn biệt vi khuẩn bằng phương phỏp nhuộm Gram [1], [2], [3], [9], [11] [9], [11]
Vi khuẩn Acetobacter là vi khuẩn Gram õm (Gr -) do đú cú thể phõn biệt chỳng bằng phương phỏp nhuộm Gram (nhuộm kộp).
Để tiến hành phương phỏp nhuộm Gram cần lấy mẫu từ cỏc chủng đó qua sơ tuyển làm tiờu bản. Phương phỏp nhuộm Gram bao gồm cỏc bước cụ thể sau:
+ Rửa sạch lam kớnh bằng NaOH sau đú rử sạch HCl hoặc H2SO4, rửa lại bằng cồn, nước cất và lau khụ.
+ Nhỏ một giọt nước vụ trựng lờn lam kớnh, dựng que cấy khử trựng trờn ngọn lửa đốn cồn, để nguội, lấy một ớt màng (hoặc dịch nuụi cấy hoặc giống vi khuẩn) hoà vào cựng giọt nước đú, hơ qua trờn ngọn lửa đốn cồn để cố định mẫu (chỳ ý: mẫu cỏch ngọn lửa đốn cồn khoảng 10 đến 15 cm là hợp lý).
+ Đặt lờn mẫu miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tớm geltian giũ trong 1 - 2 phỳt.
+ Lấy giấy lọc ra,nhỏ duung dịch Lugol lờn mẫu, giữ trong vũng 5 phỳt.
+ Rửa tiờu bản bằng nước, rửa cồn 20 giõy sau đú rửa lại bằng nước. + Nhỏ Fucshin lờn mẫu trong 1 – 2 phỳt.
+ Rửa tiờu bản bằng nước, hong khụ tự nhiờn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi đú tuỳ vào màu của tiờu bản thu được giỳp ta phõn biệt được vi khuẩn Gr – hay Gr+. Nếu sau khi nhuộm kộp tế bào bắt màu hồng thỡ đú là vi khuẩn Gr -, bắt màu tớm là vi khuẩn Gr +. Bản chất của hiện tượng bắt màu khỏc nhau này là do chất nguyờn sinh của tế bào vi khuẩn Gr+ được cấu tạo từ một loại protein đặc biệt, chứa muối Nucleatmagie cú khả năng tạo với tớm Gential và Lugol một loại phức chất bền, khú bị rửa trụi, khi quan sỏt tiờu bản trờn kớnh hiển vi tế bào vi khuẩn Gr+ bắt màu tớm geltian.Vi khuẩn Gr – khụng cú khả năng bắt màu này nờn dễ bị rửa trụi bởi cồn. Chỉ khi nhỏ Fucshin vi khuẩn Gr - mới bắt màu hồng của Fucshin.
2.2.5. Phương phỏp xỏc định khả năng tổng hợp axit acetic bằng chuẩn độ với NaOH 0,1 N cú Phenolphtalein làm chỉ thị (phương phỏp Therne) độ với NaOH 0,1 N cú Phenolphtalein làm chỉ thị (phương phỏp Therne) [4]
Để xỏc định lượng axit tạo thành trong quỏ trỡnh nuụi cấy chỳng tụi tiến
hành chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cú Phenolphtalein. Hàm lượng axit axetic
tạo thành được xỏc định theo cụng thức: . .100
10
V K
X (g/ml)
Trong đú: X là số gam axetic trong 100ml dung dịch lờn men.
V là số ml NaOH 0,1N sử dụng .
10 là số ml dịch lờn men đem chuẩn độ. 2.2.6. Phương phỏp xỏc định số lượng tế bào [6]
Lấy 1ml dịch huyền phự cú chứa vi khuẩn 24 giờ nuụi cấy, pha loóng theo phương phỏp pha loóng giới hạn rồi dựng micropipet hỳt 0,1 ml pha loóng rồi trang đều trờn mụi trường thạch đĩa. Nuụi ở 300C trong 2 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong mụi trường đĩa petri, từ đú xỏc định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuụi cấy ban đầu theo cụng thức.
1000 1
. .
100 10 n
N A
Trong đú: N : Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuụi cấy ban đầu. A: Số CFU trung bỡnh đếm được trờn mỗi đĩa petri. 10-n : Độ pha loóng dịch nuụi cấy.
2.2.7. Phương phỏp tuyển chọn cỏc chủng Acetobacter cho màng mỏng Việc tuyển chọn cỏc chủng Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai Việc tuyển chọn cỏc chủng Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai
phải thụng thụng qua một số chỉ tiờu sau:
+ Quan sỏt quỏ trỡnh hỡnh thành màng: thời gian tạo màng, đặc điểm nuụi cấy…
+ Kớch thước và hỡnh dạng tế bào nhuộm Gram
+ Kiểm tra đặc tớnh sinh hoỏ của chủng vi khuẩn phõn lập + Kiểm tra độ dày mỏng và tớnh chịu lực của màng
2.2.8 Phương phỏp xỏc định sụ lượng tế bào vi khuẩn bằng đo mật độ quang (Optical Density - OD) [8]
Để xỏc định được số lượng tế bào vi khuẩn dựa vào mật độ quang ta phải tiến hành những bước sau :
+ Bước 1: xỏc định mối tương quan giữa số lượng tế bào (CFU) vi
khuẩn Acetobacter xylinum với giỏ trị OD
Tạo huyền phự vi khuẩn Acetobacter xylinum : lấy 1ml dịch nuụi cấy
cho vào ependof, tiến hành li tõm (10 000vũng / phỳt trong thời gian 10 phỳt), loại bỏ dịch, phần thu được là cỏc tế bào lắng xuống. Bổ sung thờm 1ml nước cất vụ trựng, vontex đều và tiếp tục li tõm. Tiến hành lặp lại 3 lần, phần cặn thu được hoà tan vào 1ml nước cất vụ trựng, lắc đều, sản phẩm thu được là
huyền phự vi khuẩn Acetobacter xylinum.
Pha loóng huyền phự vi khuẩn theo nhiều nồng độ khỏc nhau, chỳng tụi lựa chọn nồng độ 10 -4 – 10 -7 để tiến hành cỏc nghiờn cứu tiếp theo. Một phần huyền phự ở nồng độ này chỳng tụi đem phõn lập ở cỏc hộp petri để đếm số lượng khuẩn lạc. Đồng thời, một phần khỏc đem đo OD bước súng 610nm (OD610), tiến hành lặp lại 3 lần. Sau khi đó đếm được số lượng khuẩn lạc qua phõn lập và đo được giỏ trị OD610, chỳng tụi thiết lập mối tương quan giữa giỏ trị OD610 với số lượng tế bào vi khuẩn tương ứng với cỏc nồng độ khỏc nhau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Bước 2: Dựa vào đồ thị, đó xỏc định giỏ trị OD610 sẽ tớnh được số lượng tế bào trong dịch nghiờn cứu cựng nồng độ ở thời điểm khỏc nhau. 2.2.9. Phương phỏp quy họach hoỏ toỏn học thực nghiệm (phương phỏp Box – Wilson) [4], [8], [9]
Phương phỏp Box-Wilson là phương phỏp dẫn dắt cỏc yếu tố đến vựng tối ưu khi cỏc biến số thay đổi cựng một lỳc theo ngụn ngữ toỏn học. Phương phỏp này cho phộp xỏc định thành phần mụi trường và điều kiện nuụi cấy,
thớch hợp cho qỳa trỡnh lờn men axetic, sự phỏt triển của vi khuẩn Acetobacter
xylinum đồng thời tạo màng sinh học. Phương phỏp này gồm 2 bước:
2.2.9.1. Thiết lập mụ hỡnh toỏn học
Thiết lập mụ hỡnh toỏn học cho phộp ta thấy được mối liờn hệ giữa hàm mục tiờu với cỏc biến dưới dạng mặt đồng mức.
Mặt đồng mức được biểu diễn theo phương trỡnh hồi quy: 3 3 2 2 1 1 0 b ~x b ~x b ~x b y (1) Trong đú: bi là cỏc hệ số i 1 n y là hàm mục tiờu i x là cỏc biến mó số (kod)
Phương phỏp Box- Wilson chỉ cú hiệu quả khi mụ hỡnh tuyến tớnh, cỏc hệ số của phương trỡnh đều cú nghĩa, nếu hệ số nào khụng cú nghĩa cần loại khỏi mụ hỡnh. Để thiết lập mụ hỡnh ta cú cỏc bước sau:
- Xỏc định cỏc chỉ tiờu để tối ưu.
- Xỏc định cỏc yếu tố ảnh hưởng đến chỉ tiờu tối ưu. - Xỏc định mức của cỏc biến.
- Xỏc định khoảng biến thiờn của cỏc yếu tố. - Lập ma trận thực nghiệm.
- Tớnh cỏc hệ số của phương trỡnh hồi quy. Từ số liệu thực nghiệm thu được, ta cần: *) Kiểm tra sự hội tụ của cỏc số liệu: - Tớnh phương sai: 2 2 1 1 1 k j j ji i S y y k (2)
j
y là số lần đo trung bỡnh của thớ nghiệm thứ j
ji
y là số lần đo thứ i của thớ nghiệm j.
- Tớnh giỏ trị tớnh toỏn GTT: (GTT = Gtớnh toỏn) 2 2 1 max j TT N j j S G S (3)
Điều kiện để cỏc sai số hội tụ là: GTT < GB (GB là G bảng). GB là giỏ trị
tỡm được bằng cỏch tra bảng chuẩn Cochran khi biết bậc tự do f1 k 1 và
2 f N . - Xỏc định cỏc hệ số hồi quy: 2 0 1 1 N j j b S n (4) 1 1 N i j i j b y x N i 1 n (5)
*) Kiểm tra sự cú nghĩa của cỏc hệ số:
Để đưa cỏc hệ số khụng cú nghĩa ra khỏi mụ hỡnh cần đỏnh giỏ theo tiờu chuẩn Student. Hệ số cú nghĩa phải thỏa món: bi S tb.
Trong đú: t là giỏ trị chuẩn Student được xỏc định bằng cỏch tra bảng khi biết N và bậc tự do f = N(k - 1).
Sb được xỏc định:
- Tớnh phõn phối trung bỡnh cho từng thớ nghiệm:
2 2 1 1 N y j j S S N (6)
- Tớnh phõn phối trung bỡnh cho mỗi lần đo: 2 2 1 1 . N j y j S S k N (7) - Tớnh phõn phối mà cỏc hệ số xỏc định: 2 2 y b S S B (8)
Trong đú: B là hệ số của phương trỡnh hồi quy.
Từ số liệu thực nghiệm đến mụ hỡnh xõy dựng được bao giờ cũng cú những sai lệch nhất định, để đỏnh giỏ độ sai lệch giữa thực nghiệm và mụ hỡnh ta dựng chuẩn Fisher. Mụ hỡnh chỉ thớch ứng khi FTT < FB. Trong đú FB
tỡm được bằng cỏch tra bảng Fisher khi biết F1 = N – 1; F2 = N(k - 1). Để tớnh toỏn chuẩn Fisher theo mụ hỡnh ta phải tớnh toỏn giỏ trị của hàm số theo mụ hỡnh đó tỡm được và tớnh phương sai thớch ứng 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TU S theo cụng thức: 2 1 1 N TN TT TU j j j S y y N B (9) Trong đú: TN j
y là giỏ trị trung bỡnh của số liệu thực nghiệm nhận được ở thớ nghiệm thứ j.
TT j
y là giỏ trị của hàm y tớnh theo phương trỡnh:
2 2 2 2 max ; min ; TU y TT TU y S S F S S (10) Trong đú FTT là F tớnh toỏn. 2.2.9.2. Tối ưu húa
Bước 1: dựa vào phương trỡnh hồi quy ta soạn ra một chương trỡnh gồm một số thớ nghiệm với những giỏ trị thay đổi của cỏc yếu tố xi theo chiều tăng thẳng đứng.
Để lập ma trận thực nghiệm tối ưu húa ta cần tiến hành: + Tớnh b z . i i
Trong đú: bi là hệ số của phương trỡnh hồi quy, zi là khoảng biến đổi của cỏc yếu tố tương ứng.
Sau khi đó chọn ra giỏ trị max của b z ứng với giỏ trị này ta cú biến i i
cơ sở. Bước nhảy của biến cơ sở xcs do ta tự chọn, cũn bước nhảy của cỏc
biến khỏc ta tớnh theo cụng thức : i i i cs cs cs b z x x b z (11)
Nếu hàm mục tiờu cần cực đại húa thỡ dấu của xi là: +. Nếu hàm mục tiờu cần cực tiểu húa thỡ dấu của xilà: - .
+ Lập ma trận thực nghiệm: ma trận này bắt đầu từ mức 0 của cỏc biến số và cỏc giỏ trị tiếp theo của chỳng sẽ phụ thuộc vào bước nhảy đó xỏc định ở phần trước.
Bước 2: tiến hành thớ nghiệm theo ma trận đó thiết lập và từ đú rỳt ra kết luận.
2.2.10. Phương phỏp tạo vết thương ở thỏ thớ nghiệm, dựng màng đắp lờn vết thương vết thương
2.2.10.1. Xử lý màng
Do trong quỏ trỡnh hỡnh thành màng BC vi khuẩn Acetobacter cú hỡnh
thành một lượng axit axetic, nờn màng BC thu được cú mựi của axit này và màu đục do đú ta phải tiến hành sử lý màng. Cỏc bước tiến hành như sau :
Bảng 2.2. Cỏch xử lý màng.
Cỏc bước Cỏch xử lý Kết quả
1 Rửa sạch bằng nước mỏy 3 lần. Loại bỏ bớt axit axetic. 2 Đun với NaOH 0,5% ở 100
0 C
trong 30 phỳt . Màng vàng xậm mựi hơi khột.
3 Trung hũa với nước chanh
loóng.
Màng từ màu vàng xậm chuyển thành màu trắng.
4
Ngõm với NaOH 0,5N ở nhiệt độ phũng trong thời gian 12 giờ (lặp lại 3 lần).
Màng BC trắng trong, khụng mựi, đạt về mặt cảm quang.
5 Trung hũa bằng nước chanh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
loóng.
Màng BC trắng trong, cú mựi thơm của nước chanh.
2.2.10.2. Tạo vết thương ở thỏ, dựng màng đắp lờn vết thương Quỏ trỡnh này được tiến hành qua cỏc bước sau:
+ Dựng kộo cắt bỏ miếng da ở thỏ diện tớch khoảng 4cm2 + Dựng màng cú tẩm mự u đắp lờn vết thương
+ Đỏnh giỏ kết quả bằng cỏch : theo dừi tỡnh trạng vết thương (nhiễm