Chỳng tụi tiến nuụi cấy 6 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum (H1 – H6) đó chọn ở trờn trong mụi trường 2, sau 5 ngày tiến hành chuẩn độ theo
phương phỏp Therne để xỏc định lượng axit axetic tạo thành do oxy hoỏ etanol. Kết quả thu được như sau :
Bảng 3.2. Hàm lượng axit axetic của một số chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum
STT Tờn chủng Lượng axit tạo thành (P%)
1 H1 2.24 2 H2 2.36 3 H3 2.28 4 H4 2.42 5 H5 2.47 6 H6 2.59
Từ bảng trờn ta cú thể thiết lập đồ thị biểu diễn hàm lượng axit axetic tạo thành như sau : 2.24 2.36 2.28 2.42 2.47 2.59 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 NH1 NH2 NH3 NH4 NH5 NH6 % axit acetic
Hỡnh 3. 4 . Đồ thị biểu diễn hàm lượng axit axetic của một số chủng vi
khuẩn Acetobacter xylinum
Như vậy ta thấy rằng: cỏc chủng Acetobacter xylinum đều cú khả năng
tạo axit axetic trong quỏ trỡnh nuụi cấy. Hàm lượng axit axetic tạo thành trong khoảng 2,24 – 2,59 %. Thực chất của quỏ trỡnh này là sự oxy hoỏ rượu etylic
khụng hoàn toàn tạo thành axit axetic dưới tỏc dụng của vi khuẩn Acetobacter
xylinum với phương trỡnh hoỏ học như sau :
CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O (*)
Nồng độ axit tạo thành như trờn cũn gần tương ứng với nồng độ axit cú
trong giấm nờn trong thực tế vi khuẩn Acetobacter xylinum cũn được dựng
trong sản xuất giấm ăn (lờn men giấm).
Khi chấm điểm trờn mụi trường đặc cú chứa CaCO3 chỳng tụi thấy rằng: khi khuẩn lạc xuất hiện và phỏt triển thỡ xung quanh khuẩn lạc xuất hiện một vũng sỏng nhỏ, làm mất màu của mụi trường đú là vũng phõn giải CaCO3. Vũng phõn giải này xuất hiện vào ngày thứ 7 hoặc ngày thứ 8 sau khi hỡnh thành khuẩn lạc. Điều này chứng tỏ axit axetic là một sản phẩm thứ cấpcủa quỏ trỡnh lờn men và cỏc chủng thuộc nhúm 3 cú khả năng tạo axit axetic thấp. Việc xuất hiện vũng phõn giải là do phương trỡnh phản ứng sau:
CaCO3 + 2 CH3COOH (CH3COO)2Ca + H2O + CO2 (**)
Hỡnh 3.5. Vũng phõn giải CaCO3 của vi khuẩn
3.2.3. Nghiờn cứu một số đặc tớnh sinh học của vi khuẩn Acetobacter
xylynum
Trong quỏ trỡnh nghiờn cứu chỳng tụi đó tỡm hiểu đặc tớnh sinh học của
vi khuẩn Acetobacter xylinum, kết quả nghiờn cứu được trỡnh bày ở bảng sau : Bảng 3.3. Đặc điểm sinh húa của vi khuẩn Acetobacter xylinum
STT Đặc điểm sinh húa của vi khuẩn
Acetobacter xylinum
Hiện tượng KQ
1 Oxy húa ethanol thành axit axetic Axit axetic tạo ra kết hợp với CaCO3 làm vũng sỏng rộng
hơn và tạo lớp cặn đục rừ
+
2 Catalase Sủi bọt khớ +
3 Hoyer Sinh khối khụng phỏt triển -
4 Chuyển húa glycerol thành
dihidroxy axeton
Vũng CuO xuất hiện xung quanh khuẩn lạc
+
5 Chuyển húa glucozơ thành axit Vũng sỏng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc
+
6 Kiểm tra khả năng tạo sắc tụ nõu Khụng thấy sắc tố nõu -
7 Kiểm tra tổng hợp cellulose Vỏng vi khuẩn xuất hiện màu lam
+
Ghi chỳ: Dấu(+) : cú Dấu (-): khụng
So sỏnh với kết quả của cỏc tỏc giả nghiờn cứu rừ trước nghiờn cứu về
vu khuẩn Acetobacter xylinum thỡ những đặc điểm trờn chỳng tụi thu được là hoàn toàn phự hợp. Cỏc chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum đều cú khả năng
tổng hợp màng cellulose; khả năng chuyển hoỏ etanol thành axit axetic trờn mụi trường A và mụi trường B; cú hoạt tớnh catalase dương; chuyển hoỏ glucozơ thành axit lactic với việc tạo vũng phõn giải khi thử với CaCO3.
3.2.4. Khảo sỏt khả năng tạo màng của vi khuẩn Acetobacter xylinum 3.2.4.1. Khảo sỏt khả năng tạo màng của vi khuẩn Acetobacter xylinum
trờn mụi trường 2
Đồng thời với quỏ trỡnh quan sỏt tế bào vi khuẩn, nghiờn cứu khả năng oxy húa rượu thành chỳng tụi tiến hành khảo sỏt khả năng tạo màng của vi
khuẩn Acetobacter xylinum trờn mụi trường 2 và ở bỡnh tam giỏc 250 ml. Vi khuẩn Acetobacter xylinum là loại vi khuẩn hiếu khớ và là đối tượng
duy nhất cú khả năng tổng hợp cellulose mạnh [8], nờn khi nuụi cấy trong mụi trường lỏng chỳng tạo thành màng trờn bề mặt thoỏng của dung dịch. Màng này là sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn trong quỏ trỡnh sinh trưởng và phỏt triển [12], [13].
Qua theo dừi quỏ trỡnh tạo màng, một số mẫu màng bắt đầu hỡnh thành từ ngày thứ 3, một số mẫu màng hỡnh thành từ ngày thứ 4. Khoảng 4 ngày tiếp theo màng dầy rất nhanh và sau đú chậm dần lại. Màng cú thể mỏng - dày, bề mặt màng trơn - nhăn, màng đều dai. Khi thu màng vào ngày thứ 5, rửa sạch màng và đem cõn khối lượng màng tươi ta thu được kết quả:
Bảng 3.4. Khảo sỏt khả năng tạo màng của vi khuẩn Acetobacter xylinum
Tờn chủng H1 H2 H3 H4 H5 H6
Khối lượng màng
BC (gam) 4,01 3,75 3,92 3,45 3,41 3,39
Từ bảng trờn ta thấy rằng: 6 chủng Acetobacter xylinum trờn đều cú khả
năng tạo màng và cho khối lượng màng tương đối lớn ( > 3g) trờn mụi trường lỏng. Đo độ dày của màng và quan sỏt dịch nuụi cấy chỳng tụi đó phõn ra làm 5 loại màng sau:
Loại 1: màng dày hơn 1,5 mm, dịch nuụi cấy đục.
Loại 3: màng mỏng hơn 1 mm, bề mặt màng trơn hoặc nhăn, dịch nuụi cấy trong.
Loại 4: màng mỏng, bề mặt màng trơn hoặc nhăn, dịch nuụi cấy đục. Loại 5: màng mỏng, bề mặt màng nhăn, dịch nuụi cấy đục.
Qua khảo sỏt trờn chỳng tụi thu được kết quả cú tớnh quy luật như những nghiờn cứu trước đõy : trờn mụi trường lỏng, vi khuẩn nào cú khối lượng màng nhỏ, khả năng chuyển húa rượu thành axit cao. Điều này cú thể
được giải thớch là do sự oxy húa rượu etylic thành axit axetic theo phương
trỡnh:
CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O
Quỏ trỡnh này cần cú oxy vỡ hiệu suất chuyển húa rượu etylic thành axit axetic sẽ phụ thuộc vào khả năng lấy oxy của tề bào vi khuẩn. Bởi vi khuẩn sống trong mụi trường lỏng, nờn lượng oxy hũa tan rất hạn chế. Khi vi khuẩn sinh trưởng và phỏt triển cú tạo thành màng trờn bề mặt thoỏng lại càng giảm khả năng hũa tan của oxy vào mụi trường nuụi cấy. Màng này càng dày thỡ càng ngăn cản sự tiếp xỳc giữa oxy với mụi trường nuụi cấy. Vỡ vậy, lượng oxy cung cấp cho quỏ trỡnh chuyển húa giảm dần, dẫn đến hiệu suất chuyển húa rượu thành axit thấp. Ngược lại, nếu màng mỏng sự tiếp xỳc giữa khụng khớ với mụi trường nuụi cấy, tạo điều kiện tốt hơn cho sự tan của oxy, lượng oxy cung cấp cho quỏ trỡnh chuyển húa nhiều hơn, dẫn đến hiệu suất tạo thành axit axetic cao.
Trong cỏc chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum trờn, chủng vi khuẩn H6
với thời gian hỡnh thành màng là 4 ngày, tớnh chất màng thu được đảm bảo yờu cầu mỏng, dai, bề mặt nhẵn, trắng trong. Do vậy chỳng tụi bước đầu
khẳng định chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum H6 là chủng cú khả năng tạo
màng đạt yờu cầu. Chỳng tụi quyết định lựa chọn chủng vi khuẩn Acetobacter
Hỡnh 3. 6 . Màng mỏng, dịch nuụi cấy đục
Hỡnh 3. 7. Màng mỏng, dịch nuụi cấy trong
3.2.4.2. Khảo sỏt khả năng tạo màng của chủng Acetobacter xylinum H6 trờn cỏc mụi trường khỏc nhau
Việc tỡm ra mụi trường dinh dưỡng thớch hợp nhất cho chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum H6 sinh trưởng, phỏt triển cho màng trong thời gian ngắn và màng thu được đảm bảo cỏc yờu cầu với mục đớch chế tạo màng sinh học là hết sức cần thiết. Do vậy, chỳng tụi khảo sỏt khả năng tạo màng của chủng H6 trờn cỏc mụi trường số 2, 3, 4, 5, 6 và bỡnh tam giỏc 250 ml thụng qua cỏc chỉ tiờu: màu sắc màng, thời gian tạo màng, tớnh chất màng, khả năng chịu lực, khối lượng màng tươi…Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.5. Khảo sỏt khả năng tạo màng của H6
Chỉ tiờu MT2 MT3 MT4 MT5 MT6
Thời gian (ngày) 4 5 3 5 4
Tớnh chất màng Dai Dai Dai Dai Dai
Khối lượng (gam) 3,62 3,47 3,4 3,74 4,25
Màu sắc Vàng đậm Trắng trong Vàng nhạt Vàng ngà Màu Sỏng Khả năng chịu lực Tốt Tốt Tốt Tốt Tốt
Qua kết quả thớ nghiệm cho thấy :
Trong cỏc mụi trường cú thành phần khỏc nhau, khả năng tạo màng của chủng H6 cũng khỏc nhau: MT4 và MT5 là cỏc mụi trường cú bổ sung pepton hay cao nấm men thỡ màng tạo thành cú khả năng đàn hồi tốt, dai, tuy nhiờn khối lượng màng thu được ở hai mụi trường lại khụng đồng nhất. MT2, MT3, MT6 khụng được bổ sung thành phần này màng tạo thành cú đặc điểm kộm hơn. Điều này được giải thớch do hàm lượng đường cug cấp cú sự thay đổi : MT5 cú bổ sung 200ml nước mớa nguyờn chất (cú chứa fructozơ) tạo điều kiện thớch hợp cho quỏ trỡnh tổng hợp màng BC. Kết quả này hoàn toàn phự hợp với kết quả nghiờn cứu của Ebuscado và cộng sự [16]. Tất cả cỏc mụi trường thỡ MT4 tạo màng mỏng nhất, MT6 tạo màng dày và khối lượng lớn nhất.
Dựa vào mục đớch của đề tài, chỳng tụi quyết định chọn mụi trường 4 là mụi trường cú đầy đủ cỏc thành phần dinh dưỡng, vitamin…cho màng mỏng nhất làm mụi trường lờn men tạo màng và sử dụng trong cỏc nghiờn
cứu tiếp theo.
3.3. Nghiờn cứu động thỏi sinh trưởng phỏt triển của chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum H6
Sinh trưởng của sinh vật là sự tăng lờn hay giảm đi (sinh trưởng õm) một cỏch cõn đối cỏc thành phần của cơ thể. Riờng ở vi sinh vật, sinh trưởng khụng chỉ là sự tăng lờn về kớch thước như cơ thể đa bào mà cũn là sự tăng lờn về số lượng tế bào (do sự phõn bào – sinh trưởng phỏt triển). Để theo dừi sự tăng giảm số lượng tế bào sống của vi sinh vật trong mụi trường dịch thể ta sẽ nghiờn cứu động thỏi sinh trưởng phỏt triển của đối tượng vi sinh vật đú [1].
Để nghiờn cứu động thỏi sinh trưởng phỏt triển của chủng Acetobacter
xylinum H6 chỳng tụi tiến hành nuụi cấy chủng vi khuẩn H6. Lấy dịch nuụi cấy của chủng vi khuẩn H6 để xỏc định số lượng tế bào bằng phương phỏp đếm số luợng khuẩn lạc và phương phỏp đo mật độ quang OD.
Ban đầu từ 1ml dịch nuụi cấy của chủng H6 cho vào ependof chỳng tụi đem li tõm, loại bỏ phần dịch, thu sinh khối tế bào, pha với 1 ml nước cất, vontex đều rồi lại đem li tõm, tiến hành lặp lại 3 lần. Cuối cựng phần sinh khối thu được hoà với 1 ml nước cất, vontex đều, tiếp tục pha loóng pasteur theo cỏc nồng độ. Chỳng tụi lựa chọn cỏc nồng độ pha loóng từ 10-3 – 10-6 để tiến hành cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
Ở mỗi nồng độ chỳng tụi tiến hành đồng thời
Hỳt 0,1ml dịch trang đều lờn mặt thạch của hộp petri (mỗi nồng độ tiến hành lặp lại 3 lần), để vào tủ ấm 28 – 30oC, sau 4 ngày thu và đếm số lượng khuẩn lạc từ đú xỏc định số lượng tế bào cú ở từng nồmg độ.
Mang một phần đo OD ở bước súng 610 nm (OD610) ở cỏc nồng độ tương ứng với nồng độ phõn lập. Mỗi thớ nghiệm tiến hành lặp lại 3 lần chỳng tụi thu được kết quả sau :
Bảng 3.6. Tương quan giữa nồng độ pha loóng, giỏ trị OD610, số lượng tế bào
Nồng độ pha loóng 10-6 10-5 10-4 10-3
Giỏ trị OD610 0,38 0,54 0,88 1,32
Số lượng tế bào (. 106) 13,41 0,02 20,70,02 36,40,02 56,130,02
dựa vào kết quả thu được chỳng tụi thiết lập được đồ thị tương quan giữa cỏc yếu tố thu được cú dạng: y = 0.022x + 0,085 (độ chớnh xỏc 99,81%).
Hỡnh 3.10. Đồ thị tương quan giữa số lượng tế bào của chủng H6 với giỏ trị OD610
Từ đồ thị thu được chỳng ta cú ta cú thể xỏc định được số lượng tế bào trong dịch nghiờn cứu vào cỏc thời điểm nuụi cấy khỏc nhau khi đó xỏc định được giỏ trị OD610. Đõy cũng là cơ sở để nghiờn cứu động thỏi sinh trưởng
phỏt triển của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum H6
Để nghiờn cứu được động thỏi sinh trưởng phỏt triển của chủng vi khuẩn
axetic, rượu etylic) tiếp tục cung cấp thờm dịch giống tỉ lệ 10% vào mụi trường. Chia thành 11 ống nghiệm nuụi cấy trong cỏc điều kiện giống nhau, chỉ khỏc nhau về thời gian nuụi cấy : 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 (giờ). Dịch nuụi cấy ở cỏc thời điểm khỏc nhau đú đem đo số lượng tế bào bằng phương phỏp mật độ quang OD. Từ giỏ trị OD610 thu được và dựa vào đồ thị y = 0,022x + 0,085 xỏc định được số lượng tế bào. Kết quả thu được như sau :
Bảng 3.7. Thời gian nuụi cấy và số lượng tế bào Thời gian nuụi cấy
(giờ)
Giỏ trị OD610 Số lượng tế bào ( .106) 0 0,155 3,2 12 0,184 4,5 24 0,305 10 36 0,457 16,9 48 0,875 35,9 60 1,134 47,7 72 1,321 56,2 84 1,341 57,1 96 1.33 56,8 108 1,288 54,7 120 1,239 52,4
Hỡnh 3.11. Đồ thị sinh trưởng phỏt triển của chủng H6 Dựa vào đồ thị trờn ta thấy :
+ Từ 0 – 24h : số lượng tế bào trong dịch nuụi cấy tăng lờn đều nhưng mức độ tăng chậm. Giai đoạn này vi khuẩn làm quen với mụi trường, tớch luỹ chất dinh dưỡng và năng lượng cho cỏc giai đoạn sinh trưởng tiếp theo. Đõy là thời gian của pha tiềm phỏt, chưa thấy màng xuất hiện.
+ Từ 24 – 48h : là pha cấp số mũ (hay pha log). Ở pha này số lượng tế bào tăng nhanh vỡ tốc độ sinh trưởng riờng của chỳng đạt cực đại, chưa thấy màng xuất hiện.
+ Từ 48 – 72h : là pha cõn bằng động, biểu hiện của pha này là số lượng tế bào trong dịch nuụi cấy tương đối ổn định. Cú thể giải thớch hiện tượng này là do một số tế bào sinh ra nhưng một số tế bào khỏc lại bị phõn huỷ dẫn đến tổng số lượng tế bào trong cả quần thể dịch là khụng đổi, ở giai đoạn này thấy màng xuất hiện.
+ Từ 72h trở đi số lượng tế bào trong dịch nuụi cấy giảm mạnh, đõy là thời gian của pha suy vong. Ở giai đoạn này số lượng tế bào chết nhiều do
nguồn chất dinh dưỡng dần cạn kiệt, khụng đủ cung cấp cho cỏc tế bào sinh trưởng phỏt triển hoặc cỏc vi khuẩn khụng phõn chia nữa.
Động thỏi phỏt triển của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum H6 phự hợp với động thỏi phỏt triển của vi sinh vật núi chung và cỏc tỏc giả nhiờn cứu từ trước [6], [7], [8].
Như vậy: dựa vào động thỏi sinh trưởng của chủng H6 thấy màng BC hỡnh thành từ ngày thứ 3 sau đú ổn định 1 – 2 ngày do vậy để thu màng tốt nhất là từ 72 – 96 h, ứng với pha cõn bằng.
3.4. Tối ưu hoỏ mụi trường dinh dưỡng cho chủng vi khuẩn Acetobacter
xylinum H6
Cũng như tất cả cỏc vi sinh vật cú nhõn nguyờn thuỷ trong quỏ trỡnh
sinh trưởng và phỏt triển của mỡnh vi khuẩn Acetobacter chịu ảnh hưởng của
rất nhiều yếu tố mụi trường nuụi cấy. Cú thể chia chỳng thành:
+ Nhúm cỏc yếu tố thành phần mụi trường dinh dưỡng nuụi cấy: glucozơ, pepton, (NH4)2SO4, CaHPO4....
+ Nhúm cỏc yếu tố điều kiện nuụi cấy: nhiệt độ, độ pH, thời gian nuụi cấy...
Do điều kiện cũn hạn chế, chỳng tụi chưa thể tiến hành nghiờn cứu tất
cả cỏc yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp màng BC của chủng Acetobacter
xylinum. Trong phạm vi đề tài của mỡnh tụi chỉ đi sõu tối ưu hoỏ mụi trường
dinh dưỡng cho chủng Acetobacter xylinum H6, theo phương phỏp quy hoạch hoỏ toỏn học thực nghiệm dựa trờn cơ sở là những nghiờn cứu về động thỏi sinh trưởng phỏt triển của chỳng.
Theo tỏc giả Đinh Thị Kim Nhung [9] mụi trường dinh dưỡng ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng phỏt triển của của vi khuẩn Acetobacter là từ cỏc
nguồn: nguồn cug cấp C từ glucozơ, nguồn cug cấp N bao gồm: N vụ cơ của (NH4)2SO4... và N hữu cơ của pepton, cao nấm men..., nguồn cung cấp P gốm
CaHPO4, KH2PO4, nguồn cung cấp S là từ MgSO4...Dựa vào đú cũng như