[4]
Để xỏc định lượng axit tạo thành trong quỏ trỡnh nuụi cấy chỳng tụi tiến
hành chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cú Phenolphtalein. Hàm lượng axit axetic
tạo thành được xỏc định theo cụng thức: . .100
10
V K
X (g/ml)
Trong đú: X là số gam axetic trong 100ml dung dịch lờn men.
V là số ml NaOH 0,1N sử dụng .
10 là số ml dịch lờn men đem chuẩn độ. 2.2.6. Phương phỏp xỏc định số lượng tế bào [6]
Lấy 1ml dịch huyền phự cú chứa vi khuẩn 24 giờ nuụi cấy, pha loóng theo phương phỏp pha loóng giới hạn rồi dựng micropipet hỳt 0,1 ml pha loóng rồi trang đều trờn mụi trường thạch đĩa. Nuụi ở 300C trong 2 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong mụi trường đĩa petri, từ đú xỏc định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuụi cấy ban đầu theo cụng thức.
1000 1
. .
100 10 n
N A
Trong đú: N : Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuụi cấy ban đầu. A: Số CFU trung bỡnh đếm được trờn mỗi đĩa petri. 10-n : Độ pha loóng dịch nuụi cấy.
2.2.7. Phương phỏp tuyển chọn cỏc chủng Acetobacter cho màng mỏng Việc tuyển chọn cỏc chủng Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai Việc tuyển chọn cỏc chủng Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai
phải thụng thụng qua một số chỉ tiờu sau:
+ Quan sỏt quỏ trỡnh hỡnh thành màng: thời gian tạo màng, đặc điểm nuụi cấy…
+ Kớch thước và hỡnh dạng tế bào nhuộm Gram
+ Kiểm tra đặc tớnh sinh hoỏ của chủng vi khuẩn phõn lập + Kiểm tra độ dày mỏng và tớnh chịu lực của màng
2.2.8 Phương phỏp xỏc định sụ lượng tế bào vi khuẩn bằng đo mật độ quang (Optical Density - OD) [8]
Để xỏc định được số lượng tế bào vi khuẩn dựa vào mật độ quang ta phải tiến hành những bước sau :
+ Bước 1: xỏc định mối tương quan giữa số lượng tế bào (CFU) vi
khuẩn Acetobacter xylinum với giỏ trị OD
Tạo huyền phự vi khuẩn Acetobacter xylinum : lấy 1ml dịch nuụi cấy
cho vào ependof, tiến hành li tõm (10 000vũng / phỳt trong thời gian 10 phỳt), loại bỏ dịch, phần thu được là cỏc tế bào lắng xuống. Bổ sung thờm 1ml nước cất vụ trựng, vontex đều và tiếp tục li tõm. Tiến hành lặp lại 3 lần, phần cặn thu được hoà tan vào 1ml nước cất vụ trựng, lắc đều, sản phẩm thu được là
huyền phự vi khuẩn Acetobacter xylinum.
Pha loóng huyền phự vi khuẩn theo nhiều nồng độ khỏc nhau, chỳng tụi lựa chọn nồng độ 10 -4 – 10 -7 để tiến hành cỏc nghiờn cứu tiếp theo. Một phần huyền phự ở nồng độ này chỳng tụi đem phõn lập ở cỏc hộp petri để đếm số lượng khuẩn lạc. Đồng thời, một phần khỏc đem đo OD bước súng 610nm (OD610), tiến hành lặp lại 3 lần. Sau khi đó đếm được số lượng khuẩn lạc qua phõn lập và đo được giỏ trị OD610, chỳng tụi thiết lập mối tương quan giữa giỏ trị OD610 với số lượng tế bào vi khuẩn tương ứng với cỏc nồng độ khỏc nhau.
+ Bước 2: Dựa vào đồ thị, đó xỏc định giỏ trị OD610 sẽ tớnh được số lượng tế bào trong dịch nghiờn cứu cựng nồng độ ở thời điểm khỏc nhau. 2.2.9. Phương phỏp quy họach hoỏ toỏn học thực nghiệm (phương phỏp Box – Wilson) [4], [8], [9]
Phương phỏp Box-Wilson là phương phỏp dẫn dắt cỏc yếu tố đến vựng tối ưu khi cỏc biến số thay đổi cựng một lỳc theo ngụn ngữ toỏn học. Phương phỏp này cho phộp xỏc định thành phần mụi trường và điều kiện nuụi cấy,
thớch hợp cho qỳa trỡnh lờn men axetic, sự phỏt triển của vi khuẩn Acetobacter
xylinum đồng thời tạo màng sinh học. Phương phỏp này gồm 2 bước:
2.2.9.1. Thiết lập mụ hỡnh toỏn học
Thiết lập mụ hỡnh toỏn học cho phộp ta thấy được mối liờn hệ giữa hàm mục tiờu với cỏc biến dưới dạng mặt đồng mức.
Mặt đồng mức được biểu diễn theo phương trỡnh hồi quy: 3 3 2 2 1 1 0 b ~x b ~x b ~x b y (1) Trong đú: bi là cỏc hệ số i 1 n y là hàm mục tiờu i x là cỏc biến mó số (kod)
Phương phỏp Box- Wilson chỉ cú hiệu quả khi mụ hỡnh tuyến tớnh, cỏc hệ số của phương trỡnh đều cú nghĩa, nếu hệ số nào khụng cú nghĩa cần loại khỏi mụ hỡnh. Để thiết lập mụ hỡnh ta cú cỏc bước sau:
- Xỏc định cỏc chỉ tiờu để tối ưu.
- Xỏc định cỏc yếu tố ảnh hưởng đến chỉ tiờu tối ưu. - Xỏc định mức của cỏc biến.
- Xỏc định khoảng biến thiờn của cỏc yếu tố. - Lập ma trận thực nghiệm.
- Tớnh cỏc hệ số của phương trỡnh hồi quy. Từ số liệu thực nghiệm thu được, ta cần: *) Kiểm tra sự hội tụ của cỏc số liệu: - Tớnh phương sai: 2 2 1 1 1 k j j ji i S y y k (2)
j
y là số lần đo trung bỡnh của thớ nghiệm thứ j
ji
y là số lần đo thứ i của thớ nghiệm j.
- Tớnh giỏ trị tớnh toỏn GTT: (GTT = Gtớnh toỏn) 2 2 1 max j TT N j j S G S (3)
Điều kiện để cỏc sai số hội tụ là: GTT < GB (GB là G bảng). GB là giỏ trị
tỡm được bằng cỏch tra bảng chuẩn Cochran khi biết bậc tự do f1 k 1 và
2 f N . - Xỏc định cỏc hệ số hồi quy: 2 0 1 1 N j j b S n (4) 1 1 N i j i j b y x N i 1 n (5)
*) Kiểm tra sự cú nghĩa của cỏc hệ số:
Để đưa cỏc hệ số khụng cú nghĩa ra khỏi mụ hỡnh cần đỏnh giỏ theo tiờu chuẩn Student. Hệ số cú nghĩa phải thỏa món: bi S tb.
Trong đú: t là giỏ trị chuẩn Student được xỏc định bằng cỏch tra bảng khi biết N và bậc tự do f = N(k - 1).
Sb được xỏc định:
- Tớnh phõn phối trung bỡnh cho từng thớ nghiệm:
2 2 1 1 N y j j S S N (6)
- Tớnh phõn phối trung bỡnh cho mỗi lần đo: 2 2 1 1 . N j y j S S k N (7) - Tớnh phõn phối mà cỏc hệ số xỏc định: 2 2 y b S S B (8)
Trong đú: B là hệ số của phương trỡnh hồi quy.
Từ số liệu thực nghiệm đến mụ hỡnh xõy dựng được bao giờ cũng cú những sai lệch nhất định, để đỏnh giỏ độ sai lệch giữa thực nghiệm và mụ hỡnh ta dựng chuẩn Fisher. Mụ hỡnh chỉ thớch ứng khi FTT < FB. Trong đú FB
tỡm được bằng cỏch tra bảng Fisher khi biết F1 = N – 1; F2 = N(k - 1). Để tớnh toỏn chuẩn Fisher theo mụ hỡnh ta phải tớnh toỏn giỏ trị của hàm số theo mụ hỡnh đó tỡm được và tớnh phương sai thớch ứng 2
TU S theo cụng thức: 2 1 1 N TN TT TU j j j S y y N B (9) Trong đú: TN j
y là giỏ trị trung bỡnh của số liệu thực nghiệm nhận được ở thớ nghiệm thứ j.
TT j
y là giỏ trị của hàm y tớnh theo phương trỡnh:
2 2 2 2 max ; min ; TU y TT TU y S S F S S (10) Trong đú FTT là F tớnh toỏn. 2.2.9.2. Tối ưu húa
Bước 1: dựa vào phương trỡnh hồi quy ta soạn ra một chương trỡnh gồm một số thớ nghiệm với những giỏ trị thay đổi của cỏc yếu tố xi theo chiều tăng thẳng đứng.
Để lập ma trận thực nghiệm tối ưu húa ta cần tiến hành: + Tớnh b z . i i
Trong đú: bi là hệ số của phương trỡnh hồi quy, zi là khoảng biến đổi của cỏc yếu tố tương ứng.
Sau khi đó chọn ra giỏ trị max của b z ứng với giỏ trị này ta cú biến i i
cơ sở. Bước nhảy của biến cơ sở xcs do ta tự chọn, cũn bước nhảy của cỏc
biến khỏc ta tớnh theo cụng thức : i i i cs cs cs b z x x b z (11)
Nếu hàm mục tiờu cần cực đại húa thỡ dấu của xi là: +. Nếu hàm mục tiờu cần cực tiểu húa thỡ dấu của xilà: - .
+ Lập ma trận thực nghiệm: ma trận này bắt đầu từ mức 0 của cỏc biến số và cỏc giỏ trị tiếp theo của chỳng sẽ phụ thuộc vào bước nhảy đó xỏc định ở phần trước.
Bước 2: tiến hành thớ nghiệm theo ma trận đó thiết lập và từ đú rỳt ra kết luận.
2.2.10. Phương phỏp tạo vết thương ở thỏ thớ nghiệm, dựng màng đắp lờn vết thương vết thương
2.2.10.1. Xử lý màng
Do trong quỏ trỡnh hỡnh thành màng BC vi khuẩn Acetobacter cú hỡnh
thành một lượng axit axetic, nờn màng BC thu được cú mựi của axit này và màu đục do đú ta phải tiến hành sử lý màng. Cỏc bước tiến hành như sau :
Bảng 2.2. Cỏch xử lý màng.
Cỏc bước Cỏch xử lý Kết quả
1 Rửa sạch bằng nước mỏy 3 lần. Loại bỏ bớt axit axetic. 2 Đun với NaOH 0,5% ở 100
0 C
trong 30 phỳt . Màng vàng xậm mựi hơi khột.
3 Trung hũa với nước chanh
loóng.
Màng từ màu vàng xậm chuyển thành màu trắng.
4
Ngõm với NaOH 0,5N ở nhiệt độ phũng trong thời gian 12 giờ (lặp lại 3 lần).
Màng BC trắng trong, khụng mựi, đạt về mặt cảm quang.
5 Trung hũa bằng nước chanh
loóng.
Màng BC trắng trong, cú mựi thơm của nước chanh.
2.2.10.2. Tạo vết thương ở thỏ, dựng màng đắp lờn vết thương Quỏ trỡnh này được tiến hành qua cỏc bước sau:
+ Dựng kộo cắt bỏ miếng da ở thỏ diện tớch khoảng 4cm2 + Dựng màng cú tẩm mự u đắp lờn vết thương
+ Đỏnh giỏ kết quả bằng cỏch : theo dừi tỡnh trạng vết thương (nhiễm trựng hay khụng nhiễm trựng), đo diện tớch vết thương cũn lại theo thời gian so với diện tớch ban đầu.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phõn lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter
Từ nguồn nguyờn liệu là bia hơi Hà Nội, giấm là theo phương phỏp truyền thống chỳng tụi thực hiện quỏ trỡnh lờn men. Sau thời gian 4 – 6 ngày trờn bề mặt dung dịch hỡnh thành lớp màng trắng. Lớp màng này được xỏc
định là cellulose liờn kết với tế bào vi khuẩn Acetobacter, được gọi là Bacterial cellulsse - BC [6], [7], [8]. Tuy nhiờn những mẫu màng thu được
ban đầu cũn chưa dai hoặc màng dai nhưng cũn hơi dày. Theo tỏc giả Đinh Thi Kim Nhung lớp màng tạo thành trờn mụi trường dịch thể dưới tỏc dụng của vi khuẩn axetic cú độ dày, mỏng khỏc nhau là do đặc tớnh của từng loại vi khuẩn khỏc nhau (tuy vào từng loài). Màng tạo thành cú độ bền , dai, chắc chưa cao cú thể là do chủng vi khuẩn tạo thành màng chưa thuần khiết [9].
Để chọn được cỏc chủng Acetobacter xylynum, chỳng tụi tiến hành cỏc
bước sau:
* Phõn lập từ nguồn nguyờn liệu tạo được ở trờn theo phương phỏp Vinogradxki. Căn cứ vào số lượng vi sinh vật chứa trong mẫu chỳng tụi lựa chọn độ pha loóng 10-4 – 10-6 để phõn lập trờn mụi trường 1 (cú cụng thức như phần 2.1.2.3), bao gúi hộp petri và để ở tủ ấm 28oC – 30oC. Sau 3 – 5 ngày trờn bề mặt thạch cả hộp petri xuất hiện cỏc khuẩn lạc cú kớch thước khỏc nhau. Qua quan sỏt chỳng tụi nhận thấy rằng cỏc khuẩn lạc này cú sự khỏc nhau khụng nhiều (hay cỏc khuẩn lạc đú cú sự đồng nhất về hỡnh dạng, kớch thước và màu sắc). Tuy vậy căn cứ vào đặc điểm, hỡnh dạng, kớch thước, độ trơn búng, màu sắc…của khuẩn lạc mà chỳng tụi chia thành cỏc nhúm sau : + Nhúm 1: cỏc khuẩn lạc nhỏ cú đường kớnh khoảng 0,8 – 1 mm trũn đều đặn, màu trắng sữa, trơn búng (6 mẫu, kớ hiệu : H1 – H6).
+ Nhúm 2: cỏc khuẩn lạc cú đường kớnh 2 – 4 mm màu trắng sữa, trơn búng, lồi lờn ở giữa (7 mẫu, kớ hiệu : H7 – H13).
+ Nhúm 3: cỏc khuẩn lạc cú đường kớnh khoảng 4 – 5 mm, bề mặt trơn búng, ở giữa lồi lờn và đậm màu sắc hơn xung quanh (7 mẫu, kớ hiệu : H14 – H20).
Sự khỏc nhau khụng nhiều giữa cỏc khuẩn lạc được giải thớch cú thể là do:
Một là: nghiờn cứu này chỳng tụi chỉ quan tõm đến nhúm vi khuẩn cú khả năng hỡnh thành màng trờn mụi trường dịch thể .
Hai là: mụi trường tiến hàmh lờn men giấm đó được bổ sung axit axetic (bị axit hoỏ) cho nờn cỏc nhúm vi khuẩn khỏc bị ức chế khụng phỏt triển được [8].
* Từ 3 nhúm khuẩn lạc đó phõn loại sơ bộ như trờn, chỳng tụi tiến hành thử khả năng tạo màng của chỳng trờn mụi trường oxy hoỏ (MT2 đó được khử
trựng) để tạo ra cỏc chủng Acetobacter cho màng tốt nhất theo phương phỏp
Graxinop [6], [8], [12], [16]. Ban đầu chỳng tụi tiến hành nhõn giống bằng cỏch cấy cỏc khuẩn lạc trờn mụi trường thạch nghiờng theo đường ziczac (mỗi khuẩn lạc một ống thạch nghiờng), thu được 20 ống thạch nghiờng tương ứng (H1 – H20). Dựng que cấy vụ trựng gợt lấy khuẩn lạc cho vào mụi trường dịch thể đó khử trựng và chuẩn bị từ trước. Sau 4 - 5 ngày thấy xuất hiện cỏc khuẩn lạc trờn mụi trường thạch nghiờng. Để trong nhiệt độ phũng (nhiệt độ mựa hố sẽ thớch hợp nhất cho sự tạo màng). Quan sỏt khả năng tạo màng của cỏc mẫu thấy màng xuất hiện ở ngày thứ 3, một số ở ngày thứ 4, ngày thứ 5 hoặc muộn hơn nữa. Đặc điểm của màng thu được cũng khỏc nhau cú màng mỏng (dễ vỡ hoặc dai), cũng cú màng dày. Tiến hành lặp lại cỏc thớ nghiệm 3 lần chỳng tụi thu được cỏc kết quả tương tự nhau.
Kết quả được dẫn ra ở bảng sau :
Bảng 3.1. Quan sỏt thời gian, đặc điểm màng tạo thành và đặc điểm
khuẩn lạc cỏc chủng vi khuẩn Acetobacter phõn lập được
Chủng Đặc điểm khuẩn lạc Khả năng tạo màng Thời gian tạo màng (ngày) Đặc điểm của màng H1 khuẩn lạc nhỏ 0,8 – 1 mm, bề mặt trơn búng, màu trắng sữa + 5 Màng khỏ dày, khụng nhẵn H2 + 6 Màng mỏng, khụng dai H3 + 5 Màng mỏng, khụng nhẵn H4 + 3 Màng khỏ dai, mỏng H5 + 5 Màng khỏ dai, mỏng H6 + 4 Màng rất dai, nhẵn búng H7 khuẩn lạc 2 – 4 mm, bề mặt trơn búng, lồi lờn ở giữa + 6 Màng dày, khỏ dai H8 + 5 Màng dày, khụng dai H9 – H11 - H12, H13 + 7 Màng rất dày, khỏ dai H14, H15 khuẩn lạc 4 – 5 mm, bề mặt trơn búng, lồi lờn ở giữa, đậm màu sắc hơn xung quanh + 7 Màng mỏng, dễ vỡ H16 - H17 + 6 Màng mỏng, nhăn nheo bỏm lờn thành bỡnh H18 - H19 + 5 Màng mỏng, dễ vỡ H20 -
Ghi chỳ: Dấu(+) : cú Dấu (-): khụng
Qua nghiờn cứu chỳng tụi thấy rằng cỏc mẫu thuộc nhúm 3 (H1 – H6) cú đặc điểm tương đối đồng nhất. Dựa vào mục đớch nghiờn cứu chỳng tụi lựa chọn cỏc chủng thuộc nhúm 3 để tiến hành cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
* Sau đú, để chọn cỏc chủng Acetobacter thuần khiết từ cỏc mẫu thuộc
nhúm 3 chỳng tụi tiến hành thử khả năng oxy hoỏ etanol của cỏc mẫu trờn mụi trường A và mụi trường B. Kết quả thu được như sau :
+ Mụi trường A: cú vũng sỏng rừ xung quanh khuẩn lạc và một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc hướng về phớa vũng sỏng.
+ Mụi trường B: làm mụi trường biến đổi thành màu vàng, tạo viền xanh lơ khi oxy hoỏ axit.
Dựa vào kết quả thớ nghiệm và một số đặc điểm khỏc nhau giữa 2 giống
Acetobacter và Gluconobacter [5] chỳng tụi xỏc định được cỏc chủng phõn
lập được thuộc nhúm 3 đều là vi khuẩn Acetobacter.
Lấy màng tạo thành từ 6 mẫu trờn, làm tiờu bản với thuốc nhuộm Iốt và H2SO4, quan sỏt trờn kớnh hiển vi chỳng tụi thấy màng cú màu xanh (do bắt
màu của Iot). So sỏnh với những đặc điểm trong phõn loại Acetobacter chỳng tụi khẳng định 6 mẫu trờn đều là vi khuẩn Acetobacter xylinum.
Hỡnh 3.1. Mẫu khuẩn lạc vi
khuẩn Acetobacter nhúm 1
Hỡnh 3. 2. Khuẩn lạc của vi khuẩn
3.2.Nghiờn cứu một số đặc tớnh hỡnh thỏi, sinh lý, sinh hoỏ của cỏc mẫu vi
khuẩn Acetobacter xylinum
3.2.1. Quan sỏt hỡnh dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum