Chuyên đề : CÔNG NGHỆ SINH HỌC – VI SINH

Chuyên đề : CÔNG NGHỆ SINH HỌC – VI SINH I. Thí nghiệm nhuộm đơn quan sát hình thái vi sinh vật I.1. Mục tiêu thí nghiệm I.1.1. Kiến thức Củng cố nội dung kiến thức cơ bản về các dạng hình thái tiêu biểu về khuẩn lạc và tế bào của các nhóm vi sinh vật (VSV) phổ biến như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men và nấm mốc; đặc điểm nổi bật của các nhóm VSV phổ biến trên và một số ứng dụng thực tiễn của các nhóm VSV đã được đề cập trong nội dung lí thuyết và thực hành phần Vi sinh vật học của sách giáo khoa Sinh học lớp 10 cơ bản và nâng cao. I.1.2. Kỹ năng Rèn luyện các kỹ năng: nhận biết VSV trên môi trường nuôi cấy, làm tiêu bản VSV, nhuộm, sử dụng kính hiển vi (KHV). Các kỹ năng cơ bản này sẽ giúp giáo viên thực hiện được các bước nhuộm đơn, quan sát và nhận diện các VSV qua kính hiển vi, từ đó có thể hướng dẫn được học sinh thực hiện thí nghiệm, quan sát và nhận diện VSV trong các bài thực hành ở phổ thông. I.2. Nguyên vật liệu và dụng cụ thí nghiệm I.2.1. Nguyên vật liệu - Các mẫu vi sinh vật: vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis, nấm men Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc Aspergillus niger, Penicillium sp., xạ khuẩn Streptomyces spp. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus sp. Khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae Khuẩn lạc xạ Khuẩn lạc nấm Khuẩn lạc nấm khuẩn mốc Aspergillus mốc Penicillium Streptomyces sp. niger sp. Hình 1. Hình dạng khuẩn lạc của các nhóm vi sinh vật thường gặp - Môi trường nuôi cấy: MPA (cao thịt 5g; peptôn 10g; NaCl 5g; nước 1000ml; thạch 20g), Hansen (glucoza 　 50g; peptôn 　 10g; 　 KH2PO4 3g; MgSO4.7H2O 2g; nước 1000ml; thạch 15-20g; pH=5,6), Czapeck (sacaroza 30g; NaNO3 3g; K2HO4 1g; MgSO4 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4 0,1g; nước 1000 ml; pH= 5,0-5,5; thạch 20g) và Gauze I (tinh bột tan 20g; KH2PO4 0,5g; MgSO4.7H2O 0,5g; KNO3 1g; NaCl 0,5g; FeSO4 0,01g; nước 1000ml; thạch 20g). - Thuốc nhuộm fuchsin kiềm: fuchsin kiềm 10g, rượu etylic 90 hoặc 95o 100ml - Thuốc nhuộm xanh methylen: xanh methylen 10g, rượu etylic 90 hoặc 95o 100ml I.2.2. Dụng cụ - Kính hiển vi: Kính hiển vi quang học có chất lượng tốt, có các vật kính với bội giác x10, x40, x100. Thị kính và các vật kính - đặc biệt các vật kính dầu (x100) - không được nhiễm nấm mốc. - Khăn lau kính: Nên dùng giấy lau kính chuyên dụng hoặc sử dụng loại khăn mềm chất liệu cotton không pha hoặc pha ít nilon để lau kính hiển vi. Không dùng các loại giấy ăn, giấy viết để lau kính. - Chậu rửa có cầu rửa: Chậu thủy tinh hoặc chậu nhựa với các cầu rửa (cầu rửa là hai đũa thuỷ tinh hai đầu nối với nhau bằng ống cao su, hoặc que thuỷ tinh uốn cong hình chữ z). - Bình nhựa có vòi chịu được dung môi để đựng được các dung môi như cồn 70 o (hoặc dung dịch chứa 70% cồn và 10% izopropanol)... - Đèn cồn: Bấc đèn phải bằng bông cotton không pha nilon; lửa ngọn đèn khi cháy phải đều và xanh. Khi dùng xong đèn cồn phải đậy nắp tránh sự bốc hơi của cồn dẫn đến lần sử dụng tiếp theo ngọn lửa đỏ, sức nóng kém. Khi ngọn lửa đèn cồn bị đỏ phải thay bấc hoặc vắt khô bấc rồi dúng vào cồn mới. Khi có điều kiện nên sử dụng đèn khí đốt. - Phiến kính (lam) và lá kính (lammel): phiến kính thường có kích thước 76 x 26 mm, dày 1,0-1,5 mm. Không dùng các phiến kính và lá kính quá dày và nhiều vết xước. - Các dụng cụ khác: Bình đựng nước có vòi phun, ống nghiệm, hộp lồng (hộp Petri), bình cầu, bình nón (bình tam giác), que cấy (có thể sử dụng que cấy vòng hoặc que cấy hình kim), bông, dầu sedre hoặc dầu khoáng, giấy thấm.... I.3. Các bước tiến hành thí nghiệm Nhuộn đơn là nhuộm tế bào bằng một loại thuốc nhuộm. Sau khi nhuộm, toàn bộ tế bào bắt màu đậm của thuốc nhuộm đó, bởi vậy cách nhuộm này thường dùng khi muốn quan sát hình dạng tế bào VSV. I.3.1. Nhuộm màu tế bào sống Thường nhuộm tế bào bằng các dung dịch loãng như xanh metylen hay fuchsin (1:100). Cách nhuộm: -Bước 1: Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm lên lam kính sau đó dùng que cấy đã vô trùng lấy VSV và đưa vào giọt thuốc nhuộm (chú ý: chỉ cần lượng nhỏ VSV, không nên lấy quá nhiều, tiêu bản sẽ dày đặc và không quan sát được đặc điểm của từng tế bào). - Bước 2: Nhẹ nhàng trộn vi sinh vật với thuốc nhuộm (trong trường hợp muốn quan sát màng nhày hoặc tiên mao, không nên sử dụng que cấy để trộn; VSV tự dàn đều trong giọt thuốc nhuộm). - Bước 3: Đậy lamen lên hỗn hợp thuốc nhuộm và VSV, thấm bớt thuốc nhuộm thừa (nếu có) xung quanh lá kính và quan sát tiêu bản sau 1-2 phút. * Chú ý: Sợi của nấm mốc thường trong suốt, khó bắt màu cho nên khi nhuộm cần xử lý sợi với 1 giọt lactophenon để thấm ướt sợi nấm, các bước tiếp theo được thực hiện theo qui trình trên. I.3.2. Làm tiêu bản cố định nhuộm đơn Trong phương pháp này, các tế bào VSV được nhuộm màu sau khi đã được cố định trên lam kính. Do vậy, tế bào thường bắt màu nhanh hơn, rõ hơn và ít bị rửa trôi trong quá trình rửa thuốc nhuộm; vi sinh vật được cố định tạo nên sự thuận lợi cho quá trình quan sát dưới kính hiển vi và tiêu bản có thể được bảo quản trong thời gian dài hơn so với tiêu bản nhuộm tế bào sống. Quy trình nhuộm gồm các bước sau: - Bước 1: Làm vết bôi vi sinh vật + Nhỏ một giọt nước lên trên lam kính (nếu chúng ta muốn quan sát các vi sinh vật khác nhau trên cùng một lam kính, chúng ta có thể nhỏ 3 giọt nước cách đều nhau trên lam kính). + Dùng que cấy đã vô trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy một ít VSV và hòa vào giọt nước – thu được huyền phù VSV. - Bước 2: Làm khô vết bôi Hong khô vết bôi trong không khí. Để vết bôi có thể khô nhanh trong không khí, khi làm vết bôi chỉ nên lấy một giọt nhỏ dịch huyền phù (khoảng 30 – 50µl). - Bước 3: Cố định vết bôi Thường cố định bằng cách hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn: Đưa vết bôi nhanh qua ngọn đèn cồn 2-3 lần. Tránh hơ quá nóng dễ làm biến dạng hình thái và cấu trúc của tế bào VSV. * Chú ý: không cố định bằng cách hơ nóng khi muốn quan sát màng nhày hoặc roi. - Bước 4: Nhuộm tiêu bản Dùng pipet nhỏ lên vết bôi một giọt thuốc nhuộm, giữ trong khoảng 1 – 2 phút. - Bước 5: Rửa tiêu bản Dùng bình rửa có vòi hoặc pipet dội nước từ một đầu phiến kính cho trôi qua vết bôi có thuốc nhuộm đến khi nước rửa không còn màu thuốc nhuộm là được. - Bước 6: Thấm khô tiêu bản Thấm khô xung quanh vết bôi và tiêu bản bằng giấy thấm (không thấm trực tiếp trên vết bôi). - Bước 7. Quan sát tiêu bản: Khởi động và kiểm tra kính hiển vi. Đặt tiêu bản lên giá kính. Chỉnh vị trí quan sát vào trung tâm của quang trường ở bội giác x10 và chọn cường độ ánh sáng phù hợp với vật kính đang quan sát. Sử dụng vi chỉnh để điều chỉnh độ nét phù hợp với mắt của người quan sát. Để quan sát ở vật kính dầu ta không thay đổi tiêu cự mà chuyển sang bội giác nhỏ nhất để tạo khoảng trống lớn, thuận tiện cho việc nhỏ dầu lên tiêu bản. Xoay vật kính x100 sang vị trí quan sát để cho vật kính tiếp xúc với dầu. Chỉnh cường độ sáng cao nhất. Dùng vi chỉnh chỉnh độ nét của tiêu bản. Quan sát, vẽ hình và nhận xét. I.4. Phân tích kết quả thí nghiệm - Nhận xét kết quả: + Nền của tiêu bản phải sạch, sáng trong, không lẫn thuốc nhuộm thừa, phản ánh rõ hình dạng và màu của tế bào VSV + Thí nghiệm được thực hiện trên 5 VSV khác nhau trong đó vi khuẩn E. coli, B. subtilis và xạ khuẩn Streptomyces sp. được nhuộm với thuốc nhuộm fuchsin kiềm nên có màu đỏ; đối với nấm men, nấm mốc sử dụng thuốc nhuộm xanh methylen sẽ có màu xanh. + Mật độ VSV trên tiêu bản: mục tiêu thí nghiệm là nhuộm và quan sát hình dạng vi sinh vật nên số lượng tế bào VSV trên tiêu bản không được quá nhiều, các tế bào nằm riêng rẽ, cho phép quan sát rõ hình thái tế bào VSV. Nếu các tế bào xếp thành từng đám, dày hoặc tế bào quá thưa và khó tìm thấy trên tiêu bản là tiêu bản chưa đạt về mật độ. + Hình dạng tế bào VSV cần phải được vẽ lại và có chú thích hoặc so sánh tỉ lệ kích thước với các VSV khác trong quá trình thí nghiệm. Đặc điểm này rất quan trọng trong quá trình thí nghiệm sau này, khi chúng ta quan sát các VSV riêng rẽ. II. Câu hỏi mở rộng và thông tin bổ sung II.1. Câu hỏi mở rộng 1. Hãy giải thích tại sao khi nhuộm vi khuẩn chúng ta nên sử dụng thuốc nhuộm kiềm? 2. Tại sao khi muốn quan sát màng nhày của VSV thì không nên làm khô và cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn? 3. Khi quan sát bằng kính hiển vi quang học có 2 mắt kính, để có được hình ảnh tiêu bản to, sắc nét và có thể quan sát rõ cần chú ý những điểm nào? II.2. Thông tin bổ sung Một trong những khó khăn đối với các trường phổ thông trung học là trang thiết bị trong nghiên cứu VSV học không đầy đủ, thiếu đồng bộ nên dẫn đến khó khăn cho việc chuẩn bị giống VSV phục vụ thực hành. Vấn đề này có thể được giải quyết một cách đơn giản khi các giáo viên biết lựa chọn đối tượng VSV để thực hiện các giờ thực hành lý thú và bổ ích. - Mẫu vi sinh vật: + Mẫu vi khuẩn có thể dễ dàng được tìm thấy khi chúng ta tạo môi trường nước thịt đun sôi, để nguội 16-24 giờ ở điều kiện nhiệt độ ấm (25-35 oC). Hoặc đơn giản hơn nữa, các thầy cô giáo có thể yêu cầu học sinh mang nước dưa chua tới phòng thí nghiệm và coi đó là mẫu vi khuẩn để quan sát. Nhóm vi khuẩn quan sát được trong nước dưa chủ yếu thuộc họ Lactobacteriaceae. + Mẫu nấm men, học sinh hoặc thầy cô giáo có thể chuẩn bị bằng cách mua bánh men giống có trên thị trường. Do VSV đang ở trại thái nghỉ nên trước khi sử dụng, thầy cô giáo nên lấy ít bột bánh men cho vào cốc nước đường 5-10% (glucoza hoặc saccaroza đều được) và để ở nhiệt độ 25-35oC trong thời gian 12-16 giờ, thỉnh thoảng lắc cốc để làm tăng mức độ thoáng khí trong nước. + Mẫu nấm mốc có thể tìm thấy dễ dàng ở các vùng nông thôn và khó hơn ở khu vực nội thành. Tuy nhiên, nếu để ý chúng ta có thể có được mẫu nấm mốc để làm thực hành dựa trên mẫu thực vật bị mốc xâm chiếm như bắp ngô bị mốc, lạc mốc, mốc tương, mốc mucor mọc trên bánh mì... + Xạ khuẩn là đối tượng phổ biến trong môi trường tự nhiên nhưng có tốc độ sinh trưởng và phát triển chậm trên môi trường nhân tạo. Đây cũng là đối tượng khó gặp ở trạng thái khuẩn lạc lớn để có thể thu nhận, thực hành quan sát ở trường phổ thông. Trong trường hợp này, các trường nên có kế hoạch trước và yêu cầu các đơn vị nghiên cứu ở bậc đại học hỗ trợ đối tượng xạ khuẩn thuần chủng để thực hiện nội dung bài thực hành. - Thuốc nhuộm: Xanh methylen là thành phần dễ kiếm trên thị trường. Thuốc nhuộm fuchsin có thành phần chủ yếu là i-ốt nên cũng có thể dễ dàng tìm thấy trong phòng thí nghiệm tại các trường Trung học phổ thông. Các thầy cô giáo chỉ cần chú ý tới tỉ lệ của các thành phần hóa chất đã được nêu ở phần đầu của bài này. - Môi trường nuôi cấy VSV: giáo viên có thể sử dụng một ít thịt bò hoặc thịt lợn, đun sôi lấy nước và bổ sung thêm thạch theo tỉ lệ 15-20 gam/lít, đun sôi cho tan thạch, để nguội, ta sẽ có môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn. Mẫu nấm mốc Aspergillus sp. có thể dễ dàng tìm thấy trên Bánh men được sử dụng để thu nấm men phục vụ thực hành bài quan sát nông sản VSV và lên men rượu Nguyên liệu sẵn có để tạo môi trường rắn nuôi cấy vi sinh vật.  ... + Mật độ VSV tiêu bản: mục tiêu thí nghiệm nhuộm quan sát hình dạng vi sinh vật nên số lượng tế bào VSV tiêu không nhiều, tế bào nằm riêng rẽ, cho phép quan sát rõ hình thái tế bào VSV Nếu tế... mật độ + Hình dạng tế bào VSV cần phải vẽ lại có thích so sánh tỉ lệ kích thước với VSV khác trình thí nghiệm Đặc điểm quan trọng trình thí nghiệm sau này, quan sát VSV riêng rẽ II Câu hỏi mở... thiết bị nghiên cứu VSV học không đầy đủ, thiếu đồng nên dẫn đến khó khăn cho việc chuẩn bị giống VSV phục vụ thực hành Vấn đề giải cách đơn giản giáo viên biết lựa chọn đối tượng VSV để thực thực