BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học

BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học

CHUYÊN ĐỀ:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ - CNSH

MÃ HỌC PHẦN: CS326

PGS.TS NGUYỄN VĂN THÀNH Nguyễn Anh Kiệt B1303675

Đỗ Thị Huỳnh Mai B1303679 Nguyễn Thị Trúc Mai B1303680 Nguyễn Thị Kiều Nga B1303685 Ngô Nhật Thành B1303847

Cần Thơ, 09/2015

MỤC LỤC

A ĐẶT VẤN ĐỀ: 1

B PHƯƠNG PHÁP TIẾP CẬN VÀ PHẠM VI ĐỀ TÀI: 2

C GIỚI THIỆU: 2

D NỘI DUNG: 2

I CÔNG NGHỆ SINH HỌC TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 2

1 Khái niệm 2

2 Lịch sử phát triển 2

3 Các kỹ thuật 3

3.1 Nuôi cấy mô tế bào động vật 3

3.1.1 Khái niệm 3

a Môi trường nuôi cấy 3

Môi trường hóa chất 3

Nhân tố sinh trưởng 4

Các chất kháng sinh 4

3.1.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào động vật 6

a Nuôi cấy sơ cấp 6

THU NHẬN MẪU VÀ XỬ LÝ SƠ BỘ 8

TÁCH RỜI CÁC TẾ BÀO 8

a Tách bằng cơ học 8

b Tách bằng Enzyme 8

c Tách tế bào bằng các phương pháp khác 10

b Nuôi cấy thu nhận mô tế bào 11

Nuôi tế bào sơ cấp 11

Nuôi cấy phát triển mảnh mô sơ cấp 11

Cấy chuyền 12

c Sự sinh trưởng của tế bào trong nuôi cấy 13

d Phương thức nuôi cấy 13

3.1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 14

a Nuôi cấy và tạo tế bào lai soma động vật 14

b.Nhân bản vô tính 18

c Kỹ thuật chuyển nhân 18

3.1.4 Thành tựu 23

Ứng dụng trong lĩnh vực y tế 23

Cấy ghép mô, cơ quan 23

Nuôi cấy tế bào trong mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất 28

Nuôi cấy tế bào để sản xuất chế phẩm sinh học 28

Nuôi cấy tế bào trong độc chất học 28

3.1.5 Các ưu điểm của nuôi cấy tế bào động vật 29

3.1.6 Một số hạn chế của nuôi cấy tế bào động vật 30

3.2 Chuyển gen _ Công nghệ gen 30

3.2.1 Khái niệm 30

3.2.2 Mục đích 31

3.2.3 Đối tượng chuyển gen 31

3.2.4 Các kỹ thuật chuyển gen 31

a Kỹ thuật điện xung 31

b Kỹ thuật vi tiêm 36

c Kỹ thuật chuyển gen nhờ liposome 40

d Chuyển gen bằng cách sử dụng tế bào gốc phôi 42

e Chuyển gen trực tiếp vào tinh trùng kết hợp với thụ tinh in vitro 44

f Chuyển gen gián tiếp (Chuyển gen nhờ vector virus và phage) 48

Vector transposon 49

Vector retrovirus 52

Vector adenovirus 59

Vector episome 62

3.2.4 Thành tựu 71

Chuột chuyển gen 71

Thỏ chuyển gen 73

Lợn chuyển gen 75

Cừu chuyển gen 76

Dê chuyển gen 76

Bò chuyển gen: 77

Gà chuyển gen 77

Khỉ chuyển gen 82

Muỗi chuyển gen 84

Cá chuyển gen 89

3.2.5 Lợi ích và hạn chế của việc tạo động vật chuyển gen 98

Lợi ích 98

Hạn chế 98

3.2.6 Ý nghĩa, thuận lợi và khó khăn trong chuyển gen tế bào động vật 98

Ý nghĩa 98

Thuận lợi 99

Khó khăn 99

Triển vọng của công nghệ chuyển gen 99

3.3 Công nghệ tế bào gốc (sẽ nói rõ ở phần II) 99

II CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GỐC 99

1 Khái niệm tế bào gốc 100

2 Đặc tính, chức năng của tế bào gốc 100

2.1 Đặc tính 100

2.1.1 Tế bào gốc là tế bào không chuyên dụng 100

2.1.2 Tế bào gốc có thể phân chia và tái tạo trong thời gian dài 101

2.1.3 Tế bào gốc có thể biến đổi thành tế bào chuyên dụng 101

2.2 Chức năng 101

2.3 Phân loại 102

2.3.1 Phân loại theo nguồn gốc 102

a Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells) 102

b Tế bào gốc mầm phôi (Embryonic germ cells) 103

c Tế bào gốc thai (Foetal stem cells) 103

d Tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cells/Somatic stem cells) 104

e Tế bào gốc khối u (Embryonic carcinomas cells) 104

2.3.2 Phân loại theo tiềm năng biệt hóa 105

a Tế bào gốc toàn năng (totipontent stem cells) 105

b Tế bào gốc vạn năng (pluripotent stem cells) 105

c Tế bào gốc đa năng (multipotent stem cells) 106

d Tế bào gốc đơn năng (mono/unipotential progenitor cells) 107

2.5 Nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc 107

2.5.1 Nuôi cấy tế bào gốc 107

a Điều kiện, môi trường nuôi cấy 107

Điều kiện nuôi cấy tế bào gốc 107

Môi trường nuôi cấy 108

b Nuôi cấy sơ cấp 108

c Nuôi cấy thứ cấp 109

2.5.2 Biệt hóa 110

a Biệt hóa bằng hóa chất 110

b Biệt hóa bằng chất nền 110

c Kích thích vật lí 111

d Chuyển gen 111

e Các gốc tự do và dạng oxygen họat động 111

f Đồng nuôi cấy với các tế bào đã biệt hóa 111

2.6 Ứng dụng 111

2.6.1 Ghép tế bào gốc trị liệu (stem cell theraphy) 111

Ứng dụng tế bào gốc trưởng thành trong điều trị 112

Ứng dụng tế bào gốc phôi trong điều trị 112

2.6.2 Công nghệ mô (Tissue engineering) 113

2.6.3 Các ứng dụng tế bào gốc phôi không liên quan đến ghép 114

3 Liệu pháp tế bào gốc 115

3.1 Tế bào gốc trong điều trị bện thần kinh 115

3.1.1 Cấy ghép tế bào gốc hay tế bào thần kinh 116

3.1.2 Kích hoạt các tế bào gốc nội sinh 116

3.2 Liệu pháp tế bào gốc trong bệnh tim mạch 116

3.2.1 Huy động tế bào gốc 116

3.2.2 Cấy ghép tế bào gốc vào tim 117

3.3 Liệu pháp tế bào gốc trong điều trị bệnh tiểu đường 117

3.3.1 Cấy ghép tế bào gốc 117

3.3.2 Ghép tế bào tiết insulin được biệt hóa từ tế bào gốc trước đó 118

3.4 Tái tạo biểu mô và da 118

4 Một số nghiên cứu về tế bào gốc 118

4.1 Tế bào gốc phôi biệt hóa thành 3 loại tế bào gốc tim 118

4.2 Chuyển đổi thành công tế bào gốc thành tế bào phổi 119

4.3 Liệu pháp tế bào gốc trong điều trị bệnh đái tháo đường type 2 121

4.4 Biến tế bào gốc thành tế bào gan, tụy tạng 122

4.5 Tạo ra thủy tinh thể từ tế bào gốc 123

4.6 Tạo tế bào gốc từ màng dây rốn 124

4.7 Tạo tinh trùng từ các tế bào gốc tủy xương 125

4.8 Thử nghiệm phương pháp điều trị ung thư phổi nhờ tế bào gốc 126

5 Các thành tựu ứng dụng tế bào gốc tiêu biểu 126

5.1 Tế bào gốc chữa khỏi bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm 127

5.2 Ghép tế bào gốc điều trị bệnh tiểu đường 128

5.3 Tạo tế bào gan từ mỡ dưới da 129

5.4 Tế bào gốc phôi trong điều trị bệnh Parkinson 130

5.5 Điều trị thoái hóa khớp gối 131

5.6 Tế bào gốc và ứng dụng trong thẩm mỹ 132

III LIỆU PHÁP GEN 133

1 Khái niệm 133

1.1 Liệu pháp gen 133

1.2 Gen liệu pháp ( therapeutic gene) 134

2 Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen 135

3 Phân loại liệu pháp gen 135

3.1 Liệu pháp gen soma 135

3.2 Liệu pháp gen tế bào mầm 135

4 Các kỹ thuật cơ bản của liệu pháp gen 136

4.1 Cơ sở của liệu pháp gen 136

4.2 Các bước cơ bản trong liệu pháp gen 137

4.3 Phương pháp và Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp 138

5 Nguyên lý của liệu pháp gen 140

5.1 Tách dòng gen liệu pháp 140

5.2 Các loại vecto thường sử dụng trong liệu pháp gen 140

5.2.1 Các vecto liệu pháp có bản chất virus 141

a Vector Adenovirus: 142

b Vectơ retrovirus 144

c Vector Adeno-Associated Virus (AAV) 146

d Vector Herpes Simplex Virus (HSV) 148

5.2.2 Các vector không có bản chất virus 149

a Liposomes 149

b Các polymer cation 150

c Cấy trực tiếp 151

d Liệu pháp tế bào gốc 151

e Biến đổi biểu hiện gen 151

Oligonucleotide 152

Ribozyme 153

Promoter 154

6 Ứng dụng của liệu pháp gen trong chữa một số bệnh 154

6.1 Các lĩnh vực ứng dụng chủ yếu của liệu pháp gen 154

6.1.1 Trong điều trị các bệnh do rối loạn di truyền 154

a Điều trị và chữa các bệnh do rối loạn di truyền các locus đơn gen 154

b Điều trị và chữa các bệnh do rối loạn di truyền các locus đa gen 154

6.1.2 Trong chữa các bệnh do nhiễm trùng 154

6.2 Một số xu hướng chữa bệnh bằng liệu pháp gen 155

6.2.1 Thay thế gen liệu pháp vào vị trí gen hỏng 155

6.2.2 Tăng cường hoặc hỗ trợ hoạt động của gen 155

6.2.3 Sửa chữa gen 155

6.2.4 Ức chế tế bào đích 156

6.2.5 Tiêu diệt tế bào đích 156

6.3 Những thành tựu đáng quan tâm 156

6.3.1 Ứng dụng liệu pháp gen trong chữa trị HIV/AIDS 156

6.3.2 Liệu pháp gen trong điều trị ung thư 159

a Ung thư 159

b Liệu pháp gen điều trị ung thư 159

6.3.3 Ứng dụng liệu pháp gen trong điều trị bệnh Parkinson 161

6.4 Triển vọng của liệu pháp gen trong tương lai 162

E KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 163

1 KẾT LUẬN 163

2 KIẾN NGHỊ 163

F TÀI LIỆU THAM KHẢO 164

CÔNG NGHỆ SINH HỌC TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

TẾ BÀO GỐC, LIỆU PHÁP GEN

A ĐẶT VẤN ĐỀ:

Thế kỷ 21 là thế kỷ của CNSH, nó sẽ xâm nhập vào mọi lĩnh vực của đời sống Với sự tiến bộ vượt bật của khoa học ngày nay, ngày càng có nhiều sản phẩm cải tiến phục vụ cho cuộc sống được ứng dụng từ công nghệ sinh học Điều này có thể thấy qua những kết quả nghiên cứu đã được công bố của các nước trên thế giới Trong vòng

30 năm qua, chúng ta chứng kiến những thành tựu đáng kinh ngạc của sinh học và công nghệ sinh học cả trong nghiên cứu cơ bản lẫn nghiên cứu ứng dụng Sự thành công của sinh học và công nghệ sinh học còn nằm ở chỗ nó tạo ra những sản phẩm chuyên về sinh – y – nông nghiệp – công nghệ sinh học với đủ mọi cấp độ quy mô Vấn đề nuôi cấy tế bào nói chung và nuôi cấy tế bào động vật nói riêng cùng với các phương pháp chuyển gen đang ngày càng được dư luận thế giới quan tâm hết mức trên nhiều phương diện khác nhau, cả về lợi ích lẫn những tác hại có thể vô cùng

to lớn mà hiện nay người ta chưa lường hết được Bên cạnh đó, tế bào gốc là một lĩnh vực nghiên cứu còn khá mới mẻ ở Việt Nam nhưng trên thế giới công nghệ tế bào gốc

đã xuất hiện cách đây cả nửa thập kỷ Những nghiên cứu về tế bào gốc chủ yếu phục

vụ cho y tế nhằm tái tạo và thay đổi các mô của cơ thể người bệnh nhờ vào công nghệ

tế bào gốc Công nghệ tế bào gốc có thể áp dụng cho mọi cơ thể sống nhưng do chi phí nghiên cứu, phân lập và nuôi cấy rất đắt nên hiện nó chỉ được sử dụng hạn chế trên một số mô của một số bệnh nhân có khả năng tài chính hoặc với mục đích thực nghiệm là chính Từ những tiến bộ và các nghiên cứu trên người ta thấy được rằng nhiệm vụ hàng đầu của công nghệ sinh học là gỉai quyết các vấn đề bệnh hiểm nghèo

và di truyền Và liệu pháp gen là kỹ thuật cao trong CNSH và có nghĩa quan trọng trong nhiệm vụ này Nhằm tìm hiều và bổ sung kiến thức về những vấn đề trên nhóm

đã tiền hành làm đề tài “ CNSH tế bào động vật, liệu pháp gen, tế bào gốc” dưới sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Văn Thành

B PHƯƠNG PHÁP TIẾP CẬN VÀ PHẠM VI ĐỀ TÀI:

Đây là một đề tài tương đối rộng và các kỹ thuật ngày càng hiện đại, phạm vi đối tương nghiên cứu lại lớn Nhưng trình độ và khả năng nhóm có hạn nên phạm vi nghiên cứu chỉ trên tế bào động vật với một số các kỹ thuật và thành tựu cơ bản

Để thực hiện đề tài này chúng tôi đã sưu tằm thông tin trên internet, sách, giáo trình, báo…và đã so sánh qua lại giữa các đề tài để đảm bảo tính chính xác vad tổng quát nhất

C GIỚI THIỆU:

CNSH tế bào động vật là tổ hợp tất cả các thao tác kỹ thuật nhằm tạo ra các cơ quan, bộ phận hòan chỉnh, hay động vật mới từ một hay một số tế bào ban đầu Kỹ thuật này có sự khác nhau với các đối tượng khác nhau

Tế bào gốc là tế bào có khả năng phân chia vô hạn định và có khả năng sinh sản

và tạo ra các tế bào khác có những chức năng chuyên biệt mỗi khi cấy vào các tế bào khác nhau CNSH tế bào gốc là sử dụng tế bào gốc để tạo ra các sản phẩm phục phụ trong đời sống, đặc biệt là trong y học hiện đại

Liệu pháp gen là phương pháp đưa gen lành vào cơ thể thay thế cho gen bệnh hay đưa gen cần thiết nào đó thay thế cho gen hư hỏng để đạt được mục tiêu cuả liệu pháp Phương pháp này được sử dụng nhiều trong y học và có ứng dụng rất cao

2 Lịch sử phát triển

Năm 1907, Harrison là người đầu tiên đã nuôi cấy thành công một mảnh mô phôi ếch trong dịch dịch bạch huyết với kỹ thuật “giọt treo” (Hanging drop).Năm

1923, Carel đã hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong các bình thủy tinh (in vitro),

để tuyệt trùng và tạo điều kiện cho tế bào phát triển tốt Nhưng phải chờ đến những năm 1960, khi hoàn thiện môi trường nuôi cấy nhân tạo thì kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật mới được phát triển mạnh và được ứng dụng vào nhiều ngành công nghệ sinh học

Sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô ngày càng tinh vi, hiện đại do nhu cầu bức thiết của hai hướng nghiên cứu chính: tạo vaccine kháng virus và nghiên cứu về ung thư

Hiện nay, các nhà nghiên cứu đang tiến tới sử dụng dạng tế bào lai (hybridoma) giữa tế bào động vật và tế bào ung thư, như là một hệ thống sản xuất các protein tái tổ hợp, ví dụ kháng thể đơn dòng, vaccine, interferon… Gần đây, nuôi cấy

tế bào gốc (stem cell) trở thành mũi nhọn mới trong công nghệ tế bào, với nhiều hy vọng ứng dụng y sinh

3 Các kỹ thuật

3.1 Nuôi cấy mô tế bào động vật:

3.1.1 Khái niệm:

Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào động vật là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các tế bào,

mô và cơ quan của động vật nhằm duy trì và/hay tăng sinh các tế bào, mô, cơ quan đó

một cách độc lập, tách khỏi những biến đổi của hệ thống in vivo ở điều kiện bình

thường hoặc stress Kỹ thuật này đầu tiên được thực hiện với các mẫu mô, và tốc độ tăng sinh của chúng rất chậm

a Môi trường nuôi cấy:

Nhu cầu dinh dưỡng của các tế bào động vật lớn hơn vi sinh vật, không giống

vi sinh vật động vật không trao đổi chất nitrogen vô cơ Vì thế, nhiều amino acid và vitamin cần dược bổ sung vào môi trường Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy

tế bào động vật bao gồm các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối kháng và glucose Ngoài ra môi trường cần được cung cấp từ 2-20 % (Theo thể tích) huyết tương của động vật Mặc dù huyết tương có thànhp hần chưa được xác định đầy đủ, nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy nó rất cần thiết cho sự phát triển và tồn tại của tế bào trong nuôi cấy

Môi trường hóa chất:

Huyết thanh dung trong môi trường nuôi cấy không chỉ đắt tiền mà còn là nguồn nhiểm bẩn virus và mycoplasma Do bản chất hóa học của huyết thanh chưa được xác định đầy đủ nên trong một số trường hợp có thể ảnh hưởng xấu đến kết quản nuôi cấy.sự hiện diện của nhìu protein khác nhau trong huyết thanh củng có thể làm phức tạp các quá trinh phân tách và tinh sạch đầu ra.vì lí do đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xây dựng môi trường không có huyết thanh Những công thức này

chứa các hormone và các nhân tố sinh trưởng được tinh sach để thay thế cho huyết thanh

Môi trường hóa chất được sáng chế từ những năm 1960 đã thay thế hoàn toàn cho các dịch sinh học như dịch chiết từ phôi gà,huyết tương,…môi trường hóa chất được điều chế hàng loạt, cất giữ được lâu, dễ thay thế , thêm, bớt các chất cần thuyết,

ít bị ô nhiễm…môi trường nuôi cấy có chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (cacbonhyrat, acid amin, vitamin, nguyên tố vi lượng, hormon, nhân tố sinh trưởng).hiện nay, người

ta dung một số môi trường như môi trường eagle, môi trường dulbecco,…

Môi trường nuôi cấy phải đẳng trương để duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu.người ta thường dung bicacbonat để tạo hệ đệm kết hợp với hệ làm giàu kết hợp

được nuôi.độ ph thích hợp là 7.4.người ta thường sử dụng đỏ phenol để kiểm tra đọ pH của môi trường, nếu môi trường chuyển dần từ đỏ sang vàng cam thì tế bào phát triển tốt, nếu chuyển snag vàng nhạt là môi trường nhiểm khuẩn

Nhân tố sinh trưởng:

Nếu không có nhân tố sinh trưởng thì tế bào động vật sẽ không phát triển.người ta thường phải bổ sung huyết thanh bê vào môi trường nuôi cấy (10-15%)

vì trong huyết thanh có chứa nhân tố sinh trưởng.nhưng vừa đắt tiền lại vừa lại nhiểm khuẩn cho nên ngày nay người ta thường dùng các chất bỏ trợ để thay thế cho huyết thanh như: insulin, transferrin, ethanolmin,… hoặc sử dụng lớp tế bào nuôi

Các chất kháng sinh:

Các chất kháng sinh như penecilin, steptomicin hoặc amphotericin B thường được dùng để chống nhiểm khuẩn cho mẻ cấy.tuy nhiên, các chất kháng sinh thường độc vì phải dùng với liều lượng thích hợp và kết hợp với qui trình tiệt trùng chu đáo

Thành phần môi trường eagle (1959)

(Môi trường nuôi cấy)

3.1.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào động vật:

a Nuôi cấy sơ cấp :

Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy truyền đầu tiên (subculture) Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là hổn hợp các dòng tế bào khác nhau, hoặc chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó có những tế bào quan tâm và những tế bào khác (được gọi là tế bào miển nhiễm) có thể loại bỏ các

tế bào nhiễm bằng cơ học hay enzyme khi tách mô hay bằng cách duy trì các điều kiện chon lọc dương tính cho sự sống sót của một kiểu tế bào quan tâm cần thu nhận

Sơ đồ nuôi cấy sơ cấp (nguồn: CNSH trên người và động vật)

Qui trình nuôi cấy sơ cấp gồm:

-Bước 1: Thu nhân mô (tươi hoặc đông lạnh) có chứa tế bào sống

-Bước 2: Phẩu tích và (hoặc) tách rời tế bào, xác định nồng độ

-Bước 3: Nuôi cấy tế bào

Nuôi mẫu mô sơ

(Mảnh nhỏ để nuôi) Tách tế bào bằng cơ học (Nghiền, ép) Tách tế bào bằng enzyme (Ủ, v.v…)

Tryspin lạnh Tryspin ấm Collagenase

Li tâm

Tái huyền phù Thu nhận tế bào mới

Nuôi sơ cấp

Nuôi mảnh mô thứ cấp

Cấy truyền

Dòng tế bào

THU NHẬN MẪU VÀ XỬ LÝ SƠ BỘ:

mẫu cần được làm sạch (rửa và sát trùng bằng cồn) rồi đưa vào bảo quản trong dung dịch DPBS rồi chuyển nhanh về phòng thí nghiệm Tùy loại mẫu mô cũng như thời gian cần thiết đưa về phòng thí nghiệm, để có kế hoạch vận chuyển chúng trong điều kiện nhiệt độ ấm (370C), nhiệt độ lạnh hay đông lạnh tạm thời

Xử lý sơ bộ mẫu mô: rửa nhiều lần bằng dung dịch DPBS có bổ sung kháng sinh, kháng nấm cắt bỏ các phần mô chết, phần thừa cắt mảnh nhỏ ra thành từng mảnh 2-3

mm2 nuôi mẫu mô sơ cấp hoặc tách rời các tế bào

TÁCH RỜI CÁC TẾ BÀO:

Mô là tập hợp các tế bào được tổ chức tinh vi và đặc trưng, chúng liên kết thành một khối thống nhất, thông qua các cầu nối gian bào Tách các tế bào ra khỏi

mô cần phá bỏ những cầu nối liên bào này, nhưng không gây tổn thương đáng kể cho

tế bào Có hai biện pháp chính để tách rời các tế bào:

a Tách bằng cơ học

- Cắt nhuyễn mô: Dùng kéo cắt nhuyễn mảnh mô, huyền phù trong dung dịch

PBS (-), để lắng và thu dịch trong (huyền phù thu nhận các tế bào đơn) Phương pháp này cho khả năng sống của tế bào cao nhưng số lượng tế bào đơn thu nhận ít nên thường được áp dụng cho những mẫu mô có kích thước lớn và không khan hiếm Trên thực tế, việc cắt nhuyễn mô thường dùng để làm tăng khả năng tiếp xúc của mô với enzyme trong kỹ thuật tách bằng enzyme được tiến hành sau đó

- Ép nhuyễn mô sử dụng hai phiến lame: thường được sử dụng để tách tế bào ở

những mô có liên kết yếu (như mô lách) Ngoài ra còn có thể sử dụng các pittong của syringe để ép mô trong đĩa petri nhằm tách rời các tế bào

- Ép bằng màng lọc tế bào (Cell strainer): đặt mẫu mô lên trên màng lọc (có

đường kính lỗ 70 – 100µm), sử dụng pittong của syringe để chà sát mạnh mảnh mô, khi đó, những tế bào sẽ va chạm vào lưới lọc và tách rời Những tế bào đơn (có đường kính nhỏ hơn lỗ lọc) sẽ lọt qua lỗ lọc

b Tách bằng Enzyme

Cầu nối gian bào có bản chất là protein (các tế bào liên kết với nhau và với ECM), do vậy các protease sử dụng để tách tế bào là những enzyme thuỷ phân protein

như: trypsin, collagenase, elastase, pronase, dispase hay những tổ hợp khác Việc sử dụng enzyme có thể riêng lẻ, hay kết hợp tùy thuộc vào mục đích

Trypsin cắt liên kết giữa nhóm carboxyl (-COOH) của lysin hoặc arginin và

gốc amin (NH2) của axid amin bất kì đứng liền kề với nó trong polypeptid, ngoại trừ liên kết giữa lysin và arginin Xử lý trypsin dẫn đến sự cuộn tròn tế bào Khi các tế bào co lại, các liên kết trở nên lỏng lẻo và tế bào dễ dàng được tách ra bởi tác động cơ học

Trypsin hoạt động trong môi trường pH 6 – 9, tối ưu ở pH 8 – 9, rất bền vững trong môi trường acid yếu

Canxi được xem như chất bảo vệ cho trypsin, hoạt tính xúc tác của trypsin bị giảm 50% khi vắng mặt Ca2+ vì trypsin trở nên trơ Một số kim loại như coban, mangan… có khả năng hoạt hóa trypsin Hoạt tính của trypsin sẽ bị kìm hãm bởi huyết thanh bò có thai hoặc DFP (di-isopropyl fluoro phosphate)

Nồng độ trypsin thường dùng để tách tế bào là 0,01–0,5% (thường là 0,25%), đôi khi là 1% Có thể sử dụng quy trình trypsin ấm (370C) hay trypsin lạnh (40C) Trypsin không tác động đặc hiệu cho loại protein, vì vậy có thể phân cắt các protein ở màng và gây vỡ tế bào khi dùng nồng độ cao, hoặc cho tác động trong thời gian dài Cần trung hòa trypsin bằng huyết thanh ngay sau khi thu đuợc tế bào đơn

Collagenase là enzyme thủy phân các liên kết peptid dạng poly-L prolin đặc

trưng cho vùng xoắn của collagen Collagenase thu nhận từ động vật hữu nhũ thì cắt chuỗi collagen tại những điểm riêng biệt, còn thu nhận từ vi khuẩn thì cắt tại nhiều vị trí dọc trên chuỗi collagen

Đa số các collagenase hoạt động ở pH trung tính hoặc hơi kiềm (pH 7- 8), nhiệt độ thích hợp dưới 400C, và giảm hoạt tính ở nhiệt độ trên 450C Có 4 loại collagenase:

- Collagenase loại I: chứa một lượng trung bình những hoạt chất (collagenase, caseinase, clostripain, trypsin hoạt động) Chúng thường được dùng cho việc tách tế bào da, gan, phổi, mỡ và những tế bào mô thượng thận

- Collagenase loại II: chứa hợp chất clostripain nhiều hơn, được sử dụng để tách

tế bào từ tim, xương, cơ và sụn

- Collagenase loại III: có hoạt tính phân giải protein thấp

- Collagenase loại IV: có hoạt tính trypsin thấp, thường dùng phân tách tế bào tụy

Collagenase và dispase phân cắt không hoàn toàn các cầu nối nên ít làm hư hại

tế bào Người ta còn sử dụng hyaluronidase kết hợp với collagenase để phân hủy các chất dịch nội bào, DNase được sử dụng để phân hủy các DNA thoát ra từ các tế bào bị

ly giải

Chymotrypsin có tính đặc hiệu kém hơn trypsin, nó phân giải các liên kết

peptide tạo thành bởi nhóm carboxyl của acid amin thơm (như tyrosin, phenylalanin, tryptophan, methionin và leucin) với một nhóm amin của một acid amin khác Chymotrypsin có pH thích hợp từ 8 – 9, và bị ức chế bởi DFB (di-isopropyl fluoro phosphate)

Papain thủy phân protein thành các polypeptid và các acid amin Papain chịu

được nhiệt độ tương đối cao (dạng khô không bị biến tính ở 1000C trong 3 giờ), hoạt động ở pH từ 4,5 – 8,5 (tùy vào cơ chất để lựa chọn độ pH thích hợp nhất cho mỗi phản ứng) Papain bị kìm hãm bởi các chất oxy hóa như oxy, ozone, hydroperoxyte, iod acetamid, thủy ngân chlobenzoate, cystin và các hợp chất disulfur khác

Elastase thủy phân một số lượng lớn protein nền Elastase là enzyme duy nhất

có khả năng thủy phân elastin, một chất nền không bị tác động bởi trypsin, chymotrypsin hay pepsin

Elastase thường được sử dụng có kết hợp với các enzyme khác như collagenase, trypsin và chymotrypsin Elastase là enzyme được chọn để tách tế bào từ phôi

c Tách tế bào bằng các phương pháp khác

+ Phương pháp ly tâm theo gradient tỷ trọng: được sử dụng để phân tách tinh

trùng hay các tế bào đơn nhân trong máu Môi trường ly tâm thường sử dụng là

Percoll, Ficoll…

VD: Quy trình Ficoll dùng để phân tách tế bào máu đơn nhân:

-Pha loãng máu (có chất chống đông) 2 lần với dung dịch đệm PBS

- Đặt 35 ml máu pha loãng lên 15ml Ficoll, ly tâm ở tốc độ 400g trong 20 phút ở 240C

- Ly tâm lần nữa ở tốc độ 500g trong 20 phút ở 240C

- Bảo quản dịch huyền phù tế bào ở 2 – 80C

+ Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt (là những receptor bề mặt

của tế bào): được sử dụng để đánh dấu và phân lập tế bào gốc Những tế bào gốc hiếm

hoi được chọn từ hàng triệu tế bào khác Dịch tế bào được đính một phân tử huỳnh quang vào receptor, dưới tác dụng của lực đẩy, dịch (có tế bào) sẽ đi qua một đầu kim rất nhỏ, sao cho mỗi lần chỉ có một tế bào Ở đầu ra của kim là một nguồn ánh sáng, thường là tia laser và sau đó là một điện trường Những tế bào phát huỳnh quang sẽ mang điện tích âm, còn những tế bào không phát huỳnh quang mang điện tích dương

Sự tích điện khác nhau như vậy cho phép thu nhận tế bào cần

Mặc dù mỗi loại mô có những yêu cầu về điều kiện tách khác nhau, nhưng cho

dù là mô nào, khi tách tế bào để nuôi cấy đều cần lưu ý một số điểm sau:

- Các mô mỡ, mô chết, mô tạp phải được loại bỏ ra trong quá trình tách

- Mô nên được cắt nhuyễn bằng dụng cụ nhọn, bén để tránh hư hại tế bào

- Enzyme sử dụng trong quá trình tách tế bào, trước đó phải được tách ra khỏi dung dịch (bằng ly tâm), hay phải bị bất hoạt (bằng huyết thanh)

- Nồng độ tế bào thu nhận cho nuôi cấy sơ cấp phải đảm bảo, đồng thời luôn cao hơn nồng độ tế bào nuôi cấy sau đó

- Hồi phục tế bào bằng cách nuôi trong môi trường dinh dưỡng cao hay bổ sung huyết thanh với nồng độ cao

- Phân tách tế bào từ mô non hay phôi nhanh hơn, hiệu quả cao hơn, tế bào thu được nhiều hơn, sống và tăng sinh mạnh hơn so với các mô đã trưởng thành

b Nuôi cấy thu nhận mô tế bào

Nuôi tế bào sơ cấp

huyền phù tế bào vào bình nuôi cấy (bình Roux), bổ sung môi trường ủ ở 37,50C trong

tủ nuôi, sau 24 giờ thay môi trường mới và tiếp tục ủ

Sau lần nuôi cấy sơ sẽ cấp thu được các tế bào sơ cấp Thành phần tế bào sơ cấp rất phức tạp, bao gồm nhiều loại tế bào khác nhau cùng hiện diện trong bình nuôi

Để có dòng tế bào thuần nhất, cần thực hiện bước tiếp là chọn dòng

Nuôi cấy phát triển mảnh mô sơ cấp

Đối với trường hợp lượng mẫu mô quá ít, cần nuôi cấy nguyên mảnh mô để thu nhận tế bào, tránh mất mẫu khi tách mô: đặt các mảnh mô trong đĩa nuôi, sử dụng cùng môi trường với môi trường nuôi tế bào từ mô đó

Các mảnh mô thường nổi, hay lơ lửng trong môi trường nuôi cấy, thường bị chết nhanh nếu không bám vào bề mặt nuôi Có thể bổ sung ít môi trường để tăng sự bám dính của mảnh mô vào bề mặt dụng cụ nuôi hoặc cố định mẫu mô bằng huyết tương/ huyết thanh

Khi các tế bào đã phát triển và lan rộng ra từ các rìa của mảnh mô, tiến hành tách bỏ mẫu mô và thu được tế bào

Cấy chuyền

Cấy chuyền rất cần để cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho các dòng

tế bào phát triển liên tục Tần số và tỷ lệ pha loãng, hay nồng độ tế bào trong cấy chuyền phụ thuộc vào các đặc tính của mỗi dòng Nếu dòng được cấy chuyền quá thường xuyên hay nồng độ tế bào quá thấp, chúng có thể bị mất

Cấy chuyền bao gồm các thao tác sau:

- Tách bỏ môi trường nuôi cấy cũ

- Rửa bề mặt giá thể nuôi (có tế bào bám)

- Tách các tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi

- Pha loãng các tế bào bằng môi trường mới

Cấy chuyền các tế bào bám dính:

- Tách bỏ môi trường khỏi hộp nuôi Nếu các tế bào bám chặt, có thể đổ bỏ môi trường Nếu nhiều tế bào nổi hay bám yếu, nên lắc nhẹ và rửa, sau đó làm lỏng sự bám dính các tế bào bằng dung dịch trypsin

- Rửa dụng cụ nuôi với PBS

- Bổ sung dung dịch trypsin

- Ủ trong tủ ấm 370C chừng 2 – 3 phút (tùy kiểu tế bào và kiểu nuôi) xem dưới kính hiển vi: nếu các tế bào có hình tròn có nghĩa là chúng đã tách ra khỏi bề mặt giá thể nuôi

- Huyền phù với môi trường có bổ sung huyết thanh, và rửa tế bào bằng cách

ly tâm ở 800 vòng/phút trong 5 – 10 phút tái huyền phù bằng môi trường nuôi (bước này có thể bỏ nếu tỷ lệ pha loãng cao trong môi trường có chứa huyết thanh)

Cấy chuyền các tế bào huyền phù:

- Nuôi cấy các tế bào trong các flask hay các spinner có thể được duy trì bằng việc pha loãng một lượng tương đương của huyền phù tế bào bằng môi trường tươi:

- Giữ flask đứng thẳng, dùng pipette huyền phù vài lần tách rời các cụm tế bào

- Tách lấy một lượng huyền phù để đếm hoặc pha loãng vào bình nuôi mới ly tâm thu cặn, loại bỏ dịch nổi tái huyền phù cặn vón vào môi trường tươi lấy một thể tích tương đương lượng tế bào mong muốn vào các bình nuôi và tiến hành nuôi

c Sự sinh trưởng của tế bào trong nuôi cấy :

- Pha chậm (lag phase) là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trường nuôi cấy cho đến khi tế bào bắt đầu phát triển.thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô được trích tế bào

- Pha tiến triển (exponential) là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăng nhanh

/cm3, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ

- Pha dừng (stationary phase) là giai đoạn pha tiến triển, trong đó số lượng tế bào không thay đổi, tức là khi môi trường dinh dưỡng nghèo dần và bắt đầu tích lũy các sản phẩm trao đổi chất độc hại, Bắt đầu xuất hiện tự hoại tế bào thể hiện ở chổ nhân bị đứt chẻ và trên bề mặt tế bào tạo thành các mảnh khối có thể quan sát được với kính hiển vi Muốn cho tế bào tiếp tục sinh trưởng caabf thực hiện các mẻ cấy truyền với môi trường mới

d Phương thức nuôi cấy :

Phương thức nuôi cấy đơn giản nhất là nuôi cáy theo mẻ (batch culture), trong đó

tế bào được nuôi vài ngày cho tớ khi sinh trưởng dừng lại đây là hệ thống nuôi cấy kín

vì hkông cho thêm gì vào cả củng không lấy ra môi trường một chất nào Điều kiện chuẩn : mật độ tế bào trong môi trường là 105 /cm3 và nuôi trong 3 ngày cho tớ khi mật

độ tế bào đạt 106 /cm3 trong khi nuôi cấy phải khuấy lắc để huyền phù tế bào và chất dinh dưỡng phân bố đều trong môi trường Tuy nhiên, môi trường sẽ nghèo dần chất dinh dưỡng và tích lũy nhìu chất độc (sản phẩm chuyển hóa của tế bào) do đó tế bào sẽ

đi vào thoái hóa

Người ta có thể kéo dài thời gian nuôi cấy bằng cách bổ sung thêm chất dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy theo thời gian để tế bào tiếp tục sinh, nhưng đến một thời gian nhất định sinh trưởng sẽ dừng lại do môi trường tích lũy quá nhiều chất độc như amoniac hay lactat,…

Để giải quyết vấn đề trên người ta tiến hành phương thức nuôi cấy liên tục (continuous fulture), trong đó môi trường luôn được đổi mới, và chất độc luôn được loại bỏ tương tự như trong cơ thể Có 2 cách nuôi cấy liên tục : cách thứ nhất dùng hệ thống tiếp liệu chất dinh dưỡng nhưng vẩn duy trì tế bào trong mẻ cấy cho đến khi số lượng tế bào đạt 106 /cm3 Cách thứ 2 là đồng thời có thêm hệ thống rút bớt môi trường cùng với tế bào ra khỏi mẻ cấy, như vậy hệ số tăng trưởng tế báo sẽ tỉ lệ với hệ số đổi mới dòng chảy vào và ra Một hệ cân bằng như vậy được gọi là hệ ổn hóa (chemostat),

là một dạng nồi lên men dùng để nuôi cấy liên tục

3.1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật:

a Nuôi cấy và tạo tế bào lai soma động vật :

Tế bào soma :

Như đã biết in vivo, sự tạo thành tế bào lai soma là vô cùng hiếm Tuy nhiên, in vitro người ta có thể nuôi cấy các loại tế bào của cùng một mô, của các mô khác nhau trong cùng một cơ thể, của các cơ thể khác nhau trong cùng một loài, thậm trí người ta

có thể nuôi cấy các tế bào giữa các loài khác nhau để tạo nên tế bào lai soma (hybridoma)

Năm 1950, lần đầu tiên, cac tác giả Barski, Sorieul, Cornefet thông báo là đã tạo được tế bào lai soma in vitro khi nuôi cấy trộn lẫn các tế bào sarcoma của chuột thuộc hai dòng khác nhau Các dòng tế bào nuôi cấy khác biệt nhau ở nhiều đặc điểm : khả năng tạo thành u khi tiêm chúng và chuột mang tính tương hợp mô và số lượng, hình thái nhiễm sắc thể của chúng cũng khác nhau

Khi tế bào lai được hình thành từ các tế bào cùng một khởi nguồn, thì tế bào lai được gọi là tế bào đồng nhân (Homocaryon-lai giả), còn khi các tế bào lai được nuôi cấy thuộc các cơ thể khác nhau về bậc phân loại khác nhau ta thu được tế bào lai dị nhân (Heterocaryon-lai thật) Như vậy, theo nghĩa đúng đắn thì heterocaryon mới thực

sự là tế bào lai (hybridoma) Khi nuôi cấy trộn lẫn các tế bào thuộc hai loài khác nhau người ta vẩn có thể thu được tế bào lai một cách ngẫu nhiên nhưng xảy ra với tần số rất thấp Vì vậy, để thu được tế bào lai dễ dàng với tầng số cao hơn người ta thường phải sử dụng các nhân tố kích thích, thông thường người ta dùng hóa chất hoặc virut làm nhân tố kích thích Một só virut được sử dụng làm nhân tố kích thích đã trở nên phổ biến là các virut chứa ADN (nhóm virut Herpes, virut đậu mùa,…), các virut chứa

ARN (virut lợn, virut Niucatson, virut Sendai, ) hoặc các virut gây ung thư (virut Sarcoma Rous),…

Đặc tính của tế bào lai soma :

+Sự hoạt hóa của nhân :

 Khi lai các tế bào bào mang nhân hoạt hóa như limpho bào của chuột, tế bào ung thư Hela của người với tế bào mang nhân bất hoạt ví dụ tế bào hồng cầu của gà, người ta thu được tế bào lai có chứa nhân lai ở trạng thái biệt hóa, trong đó các gen của hồng cầu gà trước đây bất hoạt nay đã trở nên hoạt hóa, tổng hợp ARN và protein đặc trưng cho gà

cầu của gà, ví dụ đại thực bào chẳng hạn (bình thường các đại thực bào không tổng hợp ADN và các tế bào ở giai đoạn biệt hóa G1, chúng chứa hoạch nhân nhỏ, và tổng hợp ít ARN) Khi nuôi cấy các đại thực bào (của chuột hoặc thỏ) với các tế bào hoạt hóa như

tế bào Hela hoặc tế bào melanom của người, sẽ tạo nên các tế bào lai heterocaryon, trong đó nhân đại thực bào tăng cao thể tích và chúng tổng hợp ARN tăng 4-10 lần so với bình thường chỉ 1 giờ sau dung hợp và 3 giờ sau xảy ra tổng hợp ADN Điều này chứng tỏ so với nhân hồng cầu gà, nhân đại thực bào bất hoạt ở mức thấp hơn

thực bào và tế bào melanom, người ta đã chứng minh sự tổng hợp ADN trong nhân đại thực bào không phụ thuộc vào sự tổng hợp ARN và protein trong nhân đại thực bào mà phụ thuộc vào các nhân tố đến từ tế bào chất của tế bào melanom

 Khi lai tế bào soma với tinh trùng thì nhân của tinh trùng tồn tại trong tế bào lai rất lâu (vài tháng) và vẫn ở trạng thái bất hoạt, nhưng khi đem lai tinh tử với tế bào soma (ví dụ đem tinh tử của chuột cống lai với tế bào soma của chuột nhắt) thì tạo nên các tế bào lai có khả năng phân chia

như tế bào chuột cống, khỉ hoặc người thì sẽ tạo nên tế bào lai và tế bào này có thể phát triển tới giai đoạn phôi dâu

+ Sự thụ tinh là sự dung hợp giữa tinh trùng và trứng để tạo nên hợp tử chứa cả hai nhân – có thể được xem như một tế bào lai giữa hai tế bào đơn bội cùng nguồn hoặc đôi khi khác loài xảy ra in vivo, trong ống dẫn rứng của con cái hoặc ở phần nào

đó trong xoang bụng ngoài ống dẫn trứng là đã được chương trình hóa trong bộ gen

của sinh vật Trong nuôi cấy in vitro, để thực hiện được sự thụ tinh giữa tinh trùng và trứng thì tinh trùng phải được xử lý để làm thay đổi tính chất sinh lý, được gọi là khả năng hóa (capacitation), nhưng khi sử dụng virut Sendai để kích thích thì không cần khả năng hóa vẫn thực hiện được sự thụ tinh

+ Sự điều hòa tổng hợp ADN và ARN trong tế bào lai: Khi sử dụng các dạng tế bào soma có đặc tính hoạt hóa hay bất hoạt khác nhau về tổng hợp ADN và ARN trong nhân để tạo tế bào lai, thấy rằng:

 Tế bào có hoạt tính càng cao tham gia vào tế bào lai sẽ kích thích nhân tế bào không có hoạt tính, hoặc có hoạt tính thấp tổng hợp ADN và ARN càng tích cực hơn (trừ trường hợp tế bào ít hoạt tính có kích thước lớn hơn nhiều so với tế bào hoạt tính cao, hoặc khi tế bào heterocaryon được tạo thành từ các tế bào quá già)

 Nhân không có hoạt tính hoặc hoạt tính thấp sẽ đạt mức tổng hợp ADN và ARN như ở nhân có hoạt tính

Tín hiệu phát động sự tổng hợp ADN và ARN đến từ tế bào chất của tế bào có hoạt tính cao và không mang tính đặc trưng mô hoặc loài

lai tương tự như ở tế bào bình thường Nhiều gen là bất hoạt trong các tế bào không

có hoạt tính vẫn giữ trạng thái bất hoạt trong tế bào lai chứng tỏ chúng không mang tính ngược chiều, nhưng nhiều gen bất hoạt đã trở lại hoạt động trong tế bào lai chứng tỏ chúng có tính ngược chiều Những công trình cấy ghép nhân hoặc nhân bản

vô tính từ tế bào soma chứng tỏ tùy loại tế bào, tùy mức độ và giai đoạn biệt hóa mà tính ngược chiều của hoạt động gen thể hiện khác nhau từ các gen riêng lẻ, các họ gen hay toàn bộ genom

+ Biến đổi của bộ nhiễm sắc thể trong tế bào lai: Phân tích bộ nhiễm sắc thể của tế bào lai có tầm quan trọng trong việc xác định các tế bào dung hợp có thực sự là

tế bào lai hay không và cho phép ta nghiên cứu nhiều vấn đề về cấu trúc, tập tính của nhiễm sắc thể như là cấu trúc hiển vi chứa thông tin di truyền của tế bào Bằng phương pháp đánh dấu nhiễm sắc thể và phương pháp tế bào học khác như xây dựng kiểu nhân, nhuộm cắt băng cũng như phương pháp lai ADN… người ta đã làm sáng tỏ nhiều vấn đề di truyền và biến dị của tế bào lai soma

 Trong tế bào lai khác loài, khi 2 bộ nhiễm sắc thể của 2 tế bào bố mẹ kết hợp lại với nhau sẽ xảy ra sự biến mất một số nhiễm sắc thể của một trong hai bộ hoặc

của cả hai bộ nhiễm sắc thể Ví dụ: Khi lai giữa tế bào người và chuột nhắt thì bộ nhiễm sắc thể của người sẽ bị mất, lai giữa chuột nhắt và chuột cống thì cả hai bộ nhiễm sắc thể cùng đều bị mất một số nhiễm sắc thể Sự giữ lại hoặc loại thải nhiễm sắc thể nào trong bộ nhiễm sắc thể bố mẹ trong tế bào lai xảy ra không phải ngẫu nhiên mà chắc chắn tuân theo các cơ chế tương tác giữa hai bộ gen trong trạng thái

tế bào chất chung của tế bào lai và với môi trường nuôi cấy in vitro

 Trong tế bào lai xảy ra sự biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể Các tế bào bố mẹ được sử dụng để tạo tế bào lai có thể ở các giai đoạn khác nhau của chu kỳ tế bào, khi các tế bào bố mẹ dung hợp tạo thành tế bào lai chứa một nhân dung hợp thống nhất với hai hoặc vài bộ nhiễm sắc thể, thường quan sát thấy sự biến đổi cấu trúc trong các nhiễm sắc thể như sự đông đặc hóa, đứt đoạn,… Các nhiễm sắc thể bị đông đặc hoặc đứt mảnh sẽ bị loại thải qua các kỳ phân bào của tế bào lai

+Sự biểu hiện của gen thành các tính trạng kiểu hình ở tế bào lai:

 Khi ta cho lai hai loại tế bào soma khác loài in vitro ta thu được tế bào lai heterocaryon chứa hai nhân hoặc vài nhân riêng biệt, về sau các nhân trong heterocaryon dung hợp tạo nên một nhân độc nhất chứa tổ hợp các bộ nhiễm sắc thể trong một tế bào lai được gọi là syncaryon Các heterocaryon có thể tồn tại rất lâu hoặc chết đi hoặc biến thành syncaryon Người ta theo dõi số phận và đời sống của các tế bào lai qua các đặc tính như biểu hiện của hệ gen thành các tính trạng kiểu hình để đánh dấu, chủ yếu là tổng hợp protein, các enzyme, sự tạo thành các siêu cấu trúc, sự biệt hóa tế bào về hình thái và một số đặc tính sinh lý, sinh hóa khác như phản ứng với các tác nhân kích thích, sự sinh sản và phát triển,…

nhiễm sắc thể thường, hoặc các gen trên nhiễm sắc thể giới tính, đặc biệt là nhiễm sắc thể X

 Để nghiên cứu quá trình biệt hóa tế bào lai, người ta thường sử dụng tế bào bố

mẹ, đặc biệt là các tế bào ung thư hoặc các tế bà của các chủng quần biệt hóa cao, ổn định như limpho, tế bào sợi, tế bào gốc hồng cầu,…

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật không chỉ được phục vụ cho nghiên cứu về di truyền học, tế bào học, sinh lý học, phân loại học,… mà còn phục vụ cho công nghệ tế bào

b.Nhân bản vô tính

Nhân bản vô tính là một quá trình tạo ra một tập hợp các cơ thể giống hệt nhau

về mắc di truyền và giống bố (hoặc mẹ) ban đầu bằng phương thức sinh sản vô tính Nhân bản vô tính dựa trên các nguyên tắc chung:

- Tế bào động vật có tính toàn năng nhờ đó từ tế bào soma củng có thể tạo nên một cơ thể hoàn chỉnh đồng thời tế bào động vật (tách từ mô) có thể được nuôi cấy trến các loại môi trường dinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng cách tăng số lượng và kích thước tế bào

- Tế bào động vật từ một tế bào trưởng thành củng có thể quay trở lại trạng thái bào thai để rồi phát triển thành cơ thể mới

- Mọi tế bào của một cơ thể đa bào đều xuất từ một tế bào hợp tử ban đầu qua phân bào nguyên nhiễm, do đó nhân của chúng hoàn toàn giống hệt về mặt di truyền

c Kỹ thuật chuyển nhân:

Trong nhân của tế bào soma có chứa 2n NST, chứa hệ gen quy định nên tất cả các tính trạng của cơ thể giống như bộ NST của hợp tử Qua quá trình phát triển, từ hợp tử sẽ phân bào và biệt hóa để cho ra các tế bào và mô khác nhau Quá trình biệt hóa là thể hiện sự hoạt động biệt hóa trong hệ gen theo thời gian và không gian của phôi đang phát triển dưới sự kiểm soát của các yếu tố nội bào và ngoại bào Nhân còn

ít biệt hóa thì càng có nhiều tiềm năng biệt hóa, vì vậy sử dụng tế bào gốc để nhân bản

vô tính là dễ thực hiện hơn so với tế bào đã biệt hóa Bình thường người ta tách nhân

từ tế bào cho (tế bào soma) và đem cấy chuyển vào tế bào trứng chưa thụ tinh đã bị lấy hoặc hủy nhân để tạo nên một tế bào 2n giống như hợp tử chứa nhân của tế bào soma

và tế bào chất của tế bào trứng Vì nhân 2n của tế bào cho đã biệt hóa đến một mức độ nhất định nào đó do tế bào chất của nó quy định phù hợp với thời gian và không gian phát triển của phôi Khi nhân này được cấy chuyển vào tế bào chất của trứng là môi trường giống với hợp tử thì nhân sẽ tái biệt hóa trở lại trạng thái như nhân của hợp tử

và hệ gen của nó sẽ hoạt hóa theo đúng chương trình phát triển do các nhân tố của trứng điều khiển

Những thành công của nhân bản vô tính bằng cấy nhân được thực hiện ở ếch, bằng cách sử dụng nhân của các tế bào soma lấy ở giai đoạn phôi Năm 1952, lần đầu tiên, hai nhà khoa học tai Philadelphia là R Briggs và T King đã nhân bản vô tính con

nòng nọc bằng kỹ thuạt chuyển cấy nhân từ tế bào phôi nang ếch Từ những năm 1960,

J Gordon đã nhân bản vô tính thành công con ếch trưởng thành từ nhân tế bào ruột nòng nọc và về sau là từ nhân của tế bào ruột ếch Đến nay người ta đã thành công trong việc nhân bản vô tính nhiều động vật như cá và cả động vật có vú

* Tóm tắt quy trình nhân bản bằng phưong pháp chuyển nhân gồm các bước sau:

1 Lấy tế bào trứng của cơ thể “mẹ”, hút bỏ nhân đơn bội

2 Lấy tế bào thân trưởng thành (máu, da ) của cá thế sẽ nhân bản, đồng bộ hóa chu trình tế bào của tế bào này, hút lấy nhân lưỡng bội

3 Đưa nhân lưỡng bội vào trong trứng đã hút bỏ nhân nói trên (bằng tiêm trực tiếp hoặc bằng kích thích xung điện) để tạo nên “họp tử” hay “phôi vô tính”

4 Kích thích để “hợp tử” tiếp tục phát triển và phân chia tạo nên khối blastocyst

5 Kích thích để “hợp tử” tiếp tục phát triển và phân chia tạo nên khối blastocyst

6 Sau đó khối blastocyst này có thể được :

+ Nuôi cấy trong labo nhằm đế lấy tế bào gốc, qua đó có thế tạo ra các clone tế bào gốc phôi mang gen giống với cơ thể cho tế bào thân (Mục đích nhân bản trị liệu) + Hoặc đem cấy vào tử cung của một “mẹ nuôi” để cho phát triển thành bào thai, qua đó có thế tạo nên một “bản sao” giống hệt cơ thế cho nhân tế bào thân (Mục đích nhân bản vô tính động vật/người)

Nhân bản vô tính động vật có vú:

Đối với động vật có vú là động vật thụ tinh trong và phôi phát triển trong dạ con của mẹ dưới sự nuôi dưỡng qua nhau thai Vì vậy, kỹ thuật nhân bản vô tính khó khăn và phức tạp hơn các loài động vật khác rất nhiều Từ những năm 1960-1980, các nhà khoa học đã thành công trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm để tạo nên phôi người và cấy chuyển phôi vào dạ con người mẹ và sinh ra em bé được gọi là em bé sinh ra từ ống nghiệm (Em bé đầu tiên là Brown, 1978, tại Anh)

Kết hợp kỹ thuật chuyển nhân với kỹ

thuật thụ tinh trong ống nghiệm từ 1983, người

ta đã nhân bản thành công đối với chuột từ nhân

lấy ở giai đoạn phôi nang, và từ 1984 – 1986 đã

thực hiện thành công ở bò, cừu,… từ nhân lấy ở

giai đoạn phôi Trước năm 1992, các nhà khoa

học cho rằng, đối với động vật có vú chỉ có thể

nhân bản vô tính thành công với nhân lấy từ giai đoạn phôi, còn đối với nhân của tế bào soma trưởng thành thì không thể thực hiện được vì tính biệt hóa của chúng là không thể đảo ngược Tuy nhiên, sự kiện tháng 2/1997, khi báo chí công bố con cừu Dolly ra đời (ngày 5 tháng 7 năm 1996) bằng kỹ thuật nhân bản vô tính với nhân lấy từ

tế bào tuyến vú của cừu mẹ trưởng thành 6 năm tuổi do I Wilmut, Campbel và cộng

sự ở Viện Roselin (Scottland) thực hiện Tế bào được thu nhận từ sinh thiết tuyến vú của một cừu cái giống Finn Dorset ở giai đoạn 3 tháng cuối của thai kỳ, lúc tế bào đang tăng sinh và biệt hóa Các tế bào này được nuôi cấy, sau đó được đưa vào môi trường rất nghèo huyết thanh nhằm làm ngừng hoàn toàn chu kỳ tế bào Đồng thời, một trứng của cừu cái giống Scottish Blackface (Đầu đen) có chu kỳ tế bào ngừng ở

kỳ giữa giảm phân II, bị hút bỏ bộ nhiễm sắc thể đơn bội cùng với thể cực và một ít tế bào chất, phần còn lại của trứng được chuyển vào môi trường nuôi cấy ở 370C, hoạt hóa bằng một xung điện rồi cho kết hợp với tế bào tuyến vú của Finn Dorset bằng một loạt xung điện khác Kết quả tạo thành một phôi

Phôi này được đưa vào nuôi cấy tự nhiên trong ống dẫn trứng đã thắt của một cừu cái khác Khi phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu hay phôi nang, chúng được cấy vào tử cung của cừu cái mang, từ phôi này phát triển thành cừu Dolly Điều đáng chú ý là trong số 277 phôi được tạo ra ban đầu, đến giai đoạn phôi nang chỉ còn 29 và chỉ có 1 trong số đó phát triển được thành cừu con Cừu Dolly đã sống được 6 năm tuổi nhưng những phân tích trên tế bào chứng minh rằng nó đã 12 năm tuổi

Quy trình nhân bản vô tính cừu DOLLY :

* Kỹ thuật Roslin (1996):

Do Ian Wilmut và Keith Campbell ở viện Roslin (Scotland) dùng để nhân bản cừu Dolly

Đầu tiên tế bào cho thông tin di truyền lấy từ tuyến vú của một cừu mẹ

Tế bào nay sao đó được nuôi cấy nhân lên trên in vitro nhằm tạo ra nhiều bản sao nhân tế bào Sau đó một tế bào được lấy ra khỏi nuôi cấy và động bộ hóa chu trình tế bào bằng cách đế đói trong môi trường thiếu dinh dường (lượng chất dinh dưỡng chỉ vừa đủ giữ cho tế bào không chết) Trong điều kiện này tế bào tắt tất cả các gen hoạt động tế và chuyến vào pha ngủ GO Loại bỏ nhân của tế bào trứng chưa thụ tinh lấy từ một cừu “mẹ nuôi”, đặt tế bào trứng này sát vách tế bào cho (đã đưa về pha GO) Sau khi rút nhân trứng từ 1 đến 8 tiếng, cho một dòng điện chạy qua hai tế bào này, shock

có tác dụng hòa tế bào trứng (đã bỏ nhân) và tế bào cho nhân với nhau, đồng thời khởi động tế bào mới tạo thành phát triển thành phôi Neu phôi đó sống, nó được cho phát triển trong khoảng 6 ngày và cuối cùng được đặt vào tủ’ cung “mẹ nuôi” cho phát triển

thành thai và sinh sản như bình thường Kỹ thuật tạo ra cừu Dolly có tỉ lệ thành công 1/277

* Kỹ thuật Honolulu :

Kỹ thuật này được Teruhiko Wakayama và Ryuzo Yanagimachi ở đại học tống họp Hawai giới thiệu năm 1998 Kỹ thuật của Honolulu hiệu quả hơn nhiều (thành công 3 lần trong mỗi 100 lần thực hiện) so với kỹ thuật của Roslin (thành công 1 lần trong

277 lần thực hiện)

Wakayama thực hiện đồng bộ hóa chu trình tế bào bằng phương pháp khác với Wilmut Wilmut dùng tế bào tuyến vú, một tế bào phải được đưa vào giai đoạn GO Wakayama ban đầu dùng ba loại tế bào: các tế bào Sertoli (tế bào lát ống tinh hoàn), các tế bào não, và các tế bào gò trứng (cumulus cells) Bình thường trong cơ thế cả hai loại tế bào Sertoli và tế bào não đã được duy trì ở pha GO và các tế bào gò trứng hầu như luôn ở pha GO hoặc GI (trạng thái ngủ hay tình trạng ẩn dật)

Các trứng chuột chưa thụ tinh được dùng để nhận nhân cho Sau khi loại bỏ nhân, đưa nhân tế bào cho vào trong tế bào trứng bằng tiêm nhân trục tiếp Nhân của tế bào cho được lấy ngay trong vài phút khi tế bào thân được lấy từ cơ thể chuột Khác với kỹ thuật Roslin, kỳ thuật Honolulu không nuôi cấy tế bào thân Sau một giờ, tế bào trứng chấp nhận nhân mới Trứng được đế yên thêm 5-6 giờ nữa rồi đưa vào ủ trong môi trường nuôi cấy hóa học (có chứa chất cytochalasin B) đế khởi động tế bào phân chia Môi trường này có vai trò giống shock điện nhưng diễn ra êm ái hơn và ít gây tốn thương tế bào hơn Sau khi được khởi động, trứng này sẽ phát triên thành phôi, phôi này sau đó được cấy vào tử cung “mẹ nuôi” cho mang thai và sinh nở bình thường

Kỹ thuật Honolulu thành công nhất với các tế bào gò trứng (cumulus cell), vì lý do này các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào sử dụng tế bào này Kỹ thuật Honolulu được cho là ưu việt hon kỹ thuật Roslin và đã được ứng dụng rộng rãi đê nhân bản vô tính các động vật khác

Một số khác biệt giữa kỹ thuật Roslin và Honolulu

Tế bào cho:

- Là tế bào tuyến vú, cần được đưa về

giai đoạn GO

Được nuôi cấy nhân lên ngoài cơ thể

Tế bào cho:

- Là tế bào tự nhiên đã ở trạng thái ngủ (giai đoạn GO hoặcc GI): các tế bào cumulus, tế bào não, tế bào sertoli

Dùng ngay, không nuôi cấy ngoài cơ thể

- Đưa nhân tế bào cho vào tế bào nhận

bằng shock điện

- Đưa nhân tế bào cho vào tế bào nhận bằng tiêm trục tiếp

- Đồng thời với nhận nhân trứng được

dòng điện hoạt hóa luôn

- Trúng sau nhận nhân (“thụ tinh”) được

để yên (không có kích thích nào khác)

5-6 giờ để cho phép chấp nhận nhận mới

và có thời gian tái lập trình nhân tế bào

- Hoạt hóa tế bào phân chia phát triển

thành phôi bằng shock điện

- Hoạt hóa tế bào phân chia phát triển thành phôi bằng ủ trong môi trường hóa học có chứa cytochalasin B

- Tỷ lệ nhân bản thành công cừu Dolly

Cấy ghép mô, cơ quan:

Với công nghệ nuôi cấy tế bào, người ta đã nuôi cấy thành công gần như tất

cả mọi bộ phận trên cơ thể con người như mũi, tai, xương, gân, thậm chí cả tim, phổi, não trong phòng thí nghiệm theo đơn đặt hàng từ các bệnh viện Giống như việc sản xuất các phụ tùng thay thế của xe hơi hay máy vi tính, giới khoa học gọi đây là "thuật giả kim phân tử của thế kỷ 21"

Một vòng dạo quanh các "xưởng chế tạo linh kiện thay thế"

Tại một phòng thí nghiệm ở Aberdeen (Anh) Các bác sĩ sau gần nửa tháng làm việc và chờ đợi đã vừa "chế tác" thành công một chiếc mũi dành cho cô gái xinh đẹp người Nigeria 20 tuổi Cô bị mất chiếc mũi dọc dừa của mình trong ca phẫu thuật ung thư vòm miệng Cách làm của các bác sĩ ở đây như sau: thoạt đầu, họ nuôi cấy miếng sụn mũi mới dưới da cánh tay cô gái Khi nó phát triển đến kích thước thích hợp, họ

tách nó ra và sau đó sẽ ghép nó vào vị trí mũi cũ trong ca phẫu thuật chỉnh hình mặt cho cô gái sắp được tiến hành Tương tự, trong phòng thí nghiệm này, người ta cũng đang thử nghiệm tái tạo "hai trái đào tiên" cho nạn nhân của ung thư vú

hành xong một cuộc làm mới một mẩu khuỷu tay cho một người đàn ông 37 tuổi sau khi ông bị mất nó vì tai nạn giao thông Người ta đã lấy vài ba tế bào xương đơn chiếc của nạn nhân cấy vào hỗn hợp polimer rồi ghép nó vào vị trí bị khuyết nơi khuỷu tay nạn nhân Sau thời gian 3 tháng, tế bào sinh sôi nảy nở và hình thành nên mẩu khuỷu tay y như đã mất, nó hoàn thiện tới mức, bệnh nhân - một họa sĩ chuyên nghiệp - lại có thể vẽ tranh như bình thường

Các nhà công nghệ sinh học thuộc hãng Bio Tissue của Đức từ lâu đã nổi tiếng với kỹ thuật sản xuất những khớp nối của ngón tay Tại đây, những khớp nối này được nuôi cấy hàng loạt trong các ống nghiệm Người ta đã sử dụng mẫu sụn và xương lấy

từ xương sườn và khớp háng Sau thời gian 3 tuần, trên khuôn mẫu đã hình thành khớp nối mới, sau đó các bác sĩ phẫu thuật thuộc đại học ở Freiburg ghép thành công cho bệnh nhân bị tai nạn hay bị bệnh phong

hiện như nấm sau mưa trên toàn thế giới "Ngoài mô, sụn, xương, tại những cơ sở đó, người ta còn tạo ra không ít cơ quan nội tạng như: gan, mật, thận, tim, phổi " - TS Stanislaw Wronky - nhà thần kinh học Ba Lan, người đầu tiên trên thế giới nuôi cấy thành công đường tiết niệu nhân tạo tiết lộ Cách đây 3 năm, các bác sĩ địa phương đã ghép sản phẩm đầu tiên cho cậu bé 15 tuổi Sản phẩm thứ 2 được ghép cho một người đàn ông 24 tuổi - "cả hai đến nay đều hoạt động không có gì phải chê trách" - TS Wronky khẳng định Chính ông cũng đã tiến hành các công trình nghiên cứu nuôi cấy

da cho các bệnh nhân bị bỏng Ngay trong năm nay, ông đang triển khai chương trình nuôi cấy thành mạch và các động mạch nhân tạo

Rõ ràng, với những gì vừa được chứng kiến, người ta có thể thấy rằng khoa học và y học đã bắt đầu một kỷ nguyên mới với một gương mặt mới trong đó nhân tố

có thể làm thay đổi toàn bộ gương mặt ấy chính là những nhà sinh học tế bào Chỉ với vài ba tế bào gốc và những ống nghiệm, họ có thể tạo ra những "phiên bản" của sự sống giống y như nguyên bản

"Chúng tôi sẽ có đủ khả năng tái tạo dường như tất cả các mô và bộ phận cơ thể bị thương tổn, thậm chí cả toàn bộ cánh tay" - Jay Vacanti ở Boston tuyên bố Hiện tại trong khuôn khổ dự án quốc tế mang tên LIFE (Living Implants From Engineering), những thử nghiệm nuôi cấy cơ tim đầu tiên đã được tiến hành với cả hai tâm thất và van tim Các chuyên gia khẳng định rằng, muộn nhất trong 10 năm tới, công trình sẽ hoàn thành Những thí nghiệm gây choáng váng cho nhiều người của GS Makoto Asashima ở Đại học tổng hợp Tokyo là chứng cứ thuyết phục về điều đó: trong phòng làm việc của ông, không ít cơ quan nội tạng đang từng ngày lớn lên trong ống nghiệm không khác gì hạt ngô hạt đỗ Để nuôi cấy chúng, GS Makoto sử dụng tế bào gốc có khả năng phát triển thành hầu hết các mô của cơ thể: da, xương, não, gan, hoặc tim Nhà bác học người Nhật Bản này đổ vào ống nghiệm những chất dinh dưỡng thích hợp như protein và các hormon tăng trưởng (thành phần của chúng được giữ bí mật tuyệt đối), tiếp theo ông đưa vào đó vài ba tế bào gốc Những tế bào phôi gốc này

sẽ tự hình thành ra mô bất kỳ, tùy thuộc vào "khuôn mẫu" mà chúng được nuôi cấy Khi tế bào bắt đầu hình thành những dạng mô cụ thể, chúng sẽ được đặt vào giữa hai lớp phôi dinh dưỡng khác nhau Sau một thời gian nhất định, từ những ống nghiệm sẽ xuất hiện các bộ phận thay thế mà ông cần Trước đó không ai nghĩ rằng lại có thể dễ dàng nuôi cấy những cơ quan phức tạp đến như thế ngay trong điều kiện phòng thí nghiệm Điều ngạc nhiên lớn hơn là những cơ quan đó lại có thể hoạt động bình thường, thậm chí còn rất "trơn tru" khi được thay thế vào cơ thể sống Sắp tới đây, các bệnh viện lớn có thể sẽ không còn phải đau đầu đi tìm kiếm những nguồn hiến, tặng

mô và nội tạng cơ thể nữa Thay vì cấy ghép các mô nội tạng lấy từ thi thể người chết, các bác sĩ có thể đặt hàng với các phòng thí nghiệm và trung tâm sinh học, nơi sản xuất hàng loạt những gì họ cần!

"Thuật giả kim" này cũng hứa hẹn sẽ tạo nên một cuộc cách mạng trong việc điều trị các bệnh thuộc hệ thần kinh trung ương Dẫu thực tế vẫn chưa có ai thử nuôi cấy não người trong ống nghiệm nhưng khoa học đã thành công trong nỗ lực ghép tế bào não nhân tạo TS Michele Levesque - nhà phẫu thuật thần kinh học ở Los Angeles

đã tiến hành ca cấy ghép đầu tiên như thế cho người đàn ông 50 tuổi mắc bệnh liệt rung Ông đã khoan xương hộp sọ bệnh nhân và lấy ra vài ba chục tế bào gốc Chúng được nhân lên (tới khoảng 6 triệu) và được tiêm thêm một chất hóa học đặc biệt để biến chúng thành tế bào có khả năng sản xuất ra dopamin Sau khi cấy lô tế bào đã

được "tân trang" này vào não, nồng độ hormon dopamin trong não bệnh nhân tăng lên gần 60% 6 tháng sau ca cấy ghép, sức khỏe bệnh nhân đã được cải thiện rõ rệt và 3 năm sau, bệnh nhân không còn bất cứ dấu hiệu nào của căn bệnh Thật là một điều kỳ diệu!

Ghép thành công tế bào sừng tự thân nuôi cấy

xuất nhiều động vật chuyễn gen để sản xuất protein, sản xuất mô để ghép vào cơ thế người sau đây là một vài ví dụ

Nhân bản vô tính tạo phôi người, nuôi phôi người để lấy tế bào gốc Tế bào gốc

là các tế bào còn non, có thể phân hoá thành nhiều loại tế bào khác nhau như tế bào máu, tế bào não và tế bào xương Chúng giúp điều trị một loạt các chứng bệnh như Alzheimer, đái đường, ung thư, máu trắng, Parkinson, viêm gan B hay đột quỵ

Sử dụng tế bào gốc của phôi người để nghiên cứu các phương pháp điều trị bệnh mới Đây có lẽ sẽ là bước ngoặt lớn trong lịch sử y học thế giới Theo các nhà khoa học, việc áp dụng phôi có thể mở ra khả năng chữa trị các loại bệnh thoái hoá gene như bệnh bạch cầu và bệnh tim

hiệu quả, ít tốn kém so với nhiều phương pháp trong điều trị bỏng Lần đầu tiên, Viện bỏng Quốc gia đã điều trị thành công cho một bệnh nhân nhờ ghép tế bào sừng tự thân nuôi cấy

Thông tin này được BS Đinh Văn Hân, Viện Bỏng quốc gia báo cáo tại Hội nghị Bỏng và Phẫu thuật tạo hình toàn quốc lần thứ IX, diễn ra trong hai ngày 3 - 4/3/2009 tại Hà Nội

thì trị liệu tế bào là một giải pháp lý tưởng Tuy nhiên, trước đây, các tế bào biểu mô được nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh, cần có chi phí rất cao, quy trình nuối cấy phức tạp Vì thế, các bác sĩ Viện bỏng Quốc gia đã thử nghiệm phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường không huyết thanh với mục tiêu tạo tấm

tế bào sừng tự thân nuôi cấy để điều trị bỏng và vết thương lâu liền Đây là biện pháp đơn giản, rẻ tiền hơn rất nhiều so với phương pháp nói trên

Để có được thành công này, các bác sĩ đã tiến hành nuôi cấy trên 17 mẫu da lấy

từ người tình nguyện và 7 mẫu da lấy từ bệnh nhân bỏng BS Hân cho biết, sau khi vệ

sinh vùng cho da, lấy 3 - 4cm2 da toàn lớp, da này đã được bảo quản trong môi trường huyết thanh, sau đó tiến hành tách tế bào sừng và tiến hành nuôi cấy Kết quả cho thấy, các mẫu da tự nguyện có tỷ lệ mọc tế bào sừng ở tuần thứ 1, thứ 2 đều cao hơn bệnh nhân bỏng, với tỷ lệ lần lượt là 70,5%, 57,2% Còn tỷ lệ cấy chuyển tế bào sừng thành công ở người tình nguyện và bệnh nhân bỏng lần lượt là 91,25%, 100%

sừng tự thân trên bệnh nhân bỏng

Bệnh nhân được chọn là Đỗ Khương V, 22 tuổi, bị bỏng lửa xăng 56% độ 3, 4

quả ghép da đạt khoảng 76%, phần còn lại bệnh nhân được ghép tế bào sừng

Ngày thứ 3 sau ghép, các tấm tế bào có độ bám rất tốt trên vết thương Đến ngày thứ 12 sau ghép, tỷ lệ thành công khoảng 80% Như vậy, sau 12 ngày điều trị bằng cấy ghép tế bào sừng tự thân, vết thương cơ bản đã khỏi

TS Nguyễn Viết Lượng, Trưởng phòng Kế hoạch tổng hợp Viện Bỏng quốc gia cho rằng, dù chỉ mới là ca đầu tiên, nhưng thành công trên này cho thấy, phương pháp tác lọc, nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường không huyết thanh cho kết quả tốt

để tách lớp tế bào sừng Đây là phương pháp đơn giản, ít tốn kém hơn phương pháp nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh Hơn nữa, phương pháp này phù hợp với các labo nghiên cứu tế bào hiện có tại Việt Nam Vì vậy, Viện bỏng sẽ tiếp tục hoàn thiện quy trình nuôi cấy, mở rộng trong nghiên cứu lâm sàng để ứng dụng trong điều trị bỏng và vết thương lâu liền, đem lại hiệu quả điều trị tốt nhất cho bệnh nhân bỏng

khoảng gần 7.000 bệnh nhân Ngoài sử dụng các phương pháp điều trị truyền thống, y học cổ truyền dân tộc, trong những năm qua, Viện Bỏng đã ứng dụng hơn 30 kỹ thuật tiên tiến vào điều trị bỏng như: cắt bỏ hoại tử, ghép da sớm, ghép da đồng loại, ghép

da mảnh siêu nhỏ, điều trị nhiễm độc, kỹ thuật nuôi dưỡng sớm đem lại hiệu quả điều trị tốt nhất cho bệnh nhân bỏng

Hình 3: Bệnh nhân bỏng sẽ có thêm cơ hội điều trị khi kỹ thuật mới này tiếp tục được nghiên cứu, ứng dụng rộng vào thực tế (Ảnh:Hồng Hải)

Nuôi cấy tế bào trong mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất:

Người ta có thể chủ động tạo ra các hư hại đặc trưng trên tế bào bằng các chất độc, từ đó phát hiện ra các bào quan bị ảnh hưởng và xác định các cơ chế sinh hóa và phân tử của quá trình chuyển hóa chất độc

Nuôi cấy tế bào để sản xuất chế phẩm sinh học:

Tế bào động vật nuôi cấy cũng đã được ứng dụng trong việc sản xuất các chế phẩm sinh học Các vaccine virus sản xuất từ tế bào động vật nuôi cấy đã có những đóng góp cho lĩnh vực y tế cộng đồng trên thế giới mà điển hình nhất là hiệu quả ngừa bệnh đậu mùa và chứng bại liệt ở trẻ em, trong ngành thú y là vaccine ngừa bệnh lở mồm long móng ở gia súc Để sản xuất vaccine, người ta cho nhiễm và nhân virus trong tế bào nuôi cấy để đạt đến mật độ tối đa Sau đó, virus được ly trích và xử lý bằng các tác nhân gây bất hoạt trước khi sử dụng làm vaccine

Nuôi cấy tế bào trong độc chất học

Người ta có thể chủ động tạo ra các hư hại đặc trưng trên tế bào bằng các chất độc, từ đó phát hiện ra các bào quan bị ảnh hưởng và xác định các cơ chế sinh hóa và phân tử của quá trình chuyển hóa chất độc

tạo ra những động vật biến đổi gen và dùng các sinh vật này sản xuất những sản

phẩm không truyền thống, phục vụ cho nhu cầu của con người: nguồn thuốc (động

vật sản xuất hormone, protein máu… từ sữa, trứng, máu… cho người và động vật; nguồn tế bào, mô và cơ quan sống phục vụ cho trị liệu dị ghép (xenotransplantation); tạo mô hình động vật thí nghiệm phục vụ cho nghiên cứu bệnh lí, dược lí và độc học; tạo nguồn thực phẩm cho người và động vật cùng các sản phẩm hữu dụng khác

(vaccine, sợi )

Động vật biến đổi gen là những động vật đã được làm thay đổi đặc tính di truyền không thông qua sự giao phối tự nhiên hay tái tổ hợp tự nhiên của cá gen Quá trình tạo nên các động vật biến đổi gen được gọi là quá trình biến đổi gen động vật Có nhiều cách khác nhau để làm biến đổi gen của động vật: chuyển gen (transgenesis), bất hoạt gen (knock out), thay thế gen (knock in), công nghệ NST (chromosome engineering), gây đột biến (bằng tia phóng xạ, hóa chất, virus chọn lọc dòng) hay kỹ thuật nhân bản…

năng sinh sản bình thường để phát triển thế hệ các động vật chuyển gen tiếp theo, khả năng sản xuất của chúng rất linh động, số lượng sản phẩm phụ thuộc vào số lượng cá thể hay bầy đàn Đặc biệt, các động vật này có khả năng tự duy trì nguồn năng lượng, nguồn nguyên vật liệu cho chính bản thân chúng

3.1.5 Các ưu điểm của nuôi cấy tế bào động vật :

- Hệ thống tế bào động vật là các « nhà máy tế bào » thích hợp cho việc sản xuất các phân tử phức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị và

chuẩn đoán

- Các tế bào động vật đáp ứng được quá trình hậu dịch mã chính xác đối với các

sản phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical)

- Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen (biến nạp một gen bình thường vào trong tế bào soma mang gen tương ứng bị khiếm khuyết để chửa bệnh

do sự khiếm khuyết đó gây ra) Các mục đích chính của liệu pháp này là các bệnh ung thư, hội chứng suy giảm miển dịch (HIV), chứng viêm khớp, các bệnh tim

mạch và xơ hóa u nang

- Sản xuất các tế bào động vật để dùng làm cơ chất in vitro trong nghiên cứu độc

chất học và dược học

- Phát triển công nghệ mô hoặc phát sinh cơ quan để sản xuất các cơ quan thay

thế nhân tạo-sinh học/các dụng cụ trợ giúp, chẳng hạn :

 Da nhân tạo để chửa bỏng

3.1.6 Một số hạn chế của nuôi cấy tế bào động vật :

Mặc dù tiềm năng ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật là rất lớn, nhưng việc nuôi cấy một số lượng lớn tế bào động vật thường gặp các khó khăn :

tế bào vi sinh vật

 Tốc độ sinh trưởng của các tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật vì thế, sản lượng của chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian giài thường gặp nhiều khó khăn hơn

 Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế bào dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật, và kết quả là chúng rất dễ bị biến dạng và vỡ

đầy đủ, và môi trường nuôi cấy thường đồi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền

một cơ thể đơn bào riêng biệt như vi sinh vật

 Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt

3.2 Chuyển gen _ Công nghệ gen

3.2.1 Khái niệm:

Chuyển gen (transgenesis) là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào trong gennome của một cơ thể đa bào, sau đó đoạn DNA ngoại lai này sẽ được truyền lại cho tất cả tế bào kể cả tế bào mầm và di truyền lại cho thế hệ sau Vì vậy, thuật ngữ chuyển gen chỉ dùng cho động vật và thực vật Nấm men, vi khuẩn và các tế bào nuôi cấy mang một đoạn DNA ngoại lai được gọi là tế bào tái tổ hợp hoặc tế bào biến nạp

Gen chuyển (transgene) là gen ngoại lai được chuyển từ cơ thể này sang cơ thể khác nhờ kỹ thuật di truyền Các gen chuyển để tạo đông vật, thực vật có nguồn gốc từ các sinh vật khác nhau: động vật, thực vật, vi sinh vật và kể cả con người

Động vật chuyển gen (GMO) là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào DNA gennome của nó nhằm mục đích phục vụ cho con người, gen ngoại lai này được chuyền lại cho tất cả tế bào kể cả tế bào mầm Việc chuyển gen ngoại lai vào tế bào động vật chỉ thành công khi các gen này di truyền lại cho các thế hệ sau

3.2.2 Mục đích:

Bằng các kỹ thuật tiên tiến của Công nghệ sinh học hiện đại, phương pháp chuyển gen được sử dụng phổ biến với mục đích như sau:

học; động vật có sức chống chịu tốt ( bệnh tật, sự thay đổi của điều kiện môi trường…): vật nuôi có tốc độ lớn nhanh, hiệu xuất sử dụng thức ăn cao, có năng suất chất lượng tốt

cứu các bệnh ở người và nhanh chóng tìm ra các giải pháp điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, AIDS, thần kinh, tim mạch và các bệnh di truyền ở người…

vật như: tạo ra những giống cây trồng kháng sâu bệnh có chứa các gen cải tiến…

3.2.3 Đối tượng chuyển gen:

Động vật chuyển gen thường được thao tác trên:

 Tế bào trứng đã thụ tinh

3.2.4 Các kỹ thuật chuyển gen:

a Kỹ thuật điện xung

Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng

để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào Trong phương pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào

Sơ đồ màng phospholipid kép

Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác kỵ nước của phospholipid kép và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau khi bị rối loạn (Purves, 2001) Vì vậy, một xung điện chớp nhoáng có thể gây ra rối loạn ở các vị trí của màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân cực có thể đi qua, nhưng sau đó màng có thế đóng kín lại nhanh chóng và tế bào không bị ảnh hưởng gì cả Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho vào trong một cuvette nhựa có điện cực (Hình dưới)

Cuvette nhựa có điện cực