... cứu ảnh hưởng nguồn cacbon tới trình lên men tạo màng BC cho chủng Gluconacetobacter Nội dung đề tài 3.1.Khả lên men tạo màng BC chủng vỉ khuẩn Glunacetobacter 3.2.Anh hưởng nguồn cacbon tới trình. .. trình tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter 3.2.1 Ảnh hưởng hàm lượng đường glucose tới trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter 3.2.2 Ảnh hưởng hàm lượng đường saccarose tới trình. .. cầu cho trình nghiên cứu đề tài 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter Đe tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon đến trình tạo màng
TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== oOo ====== NGUYỄN THỊ HÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CACBON TỚI QUÁ TRÌNH TẠO MÀNG BC CHO CHỦNG GLUCONACETOBACTER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh yật Ngưòi hướng dẫn khoa học PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung HÀ NỘI-2015 Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo, PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, Giảng viên chính, tố Thực vật - Vi sinh, Trường Đại hoc Sư phạm Hà Nội 2, người đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu đề tài này. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Thực vật - Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học sư phạm Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, Trung tâm thông tin thư viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận này. CẢM Cuối cùng, Em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, LỜI bạn bè và người thân, những người luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài. Hà Nội, ngày .... Tháng... nẫm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hà Em xin khẳng định đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân em, tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lí thống kê, hoàn toàn không có số liệu sao chép. Đe tài nghiên cứu này không trùng với công trình nghiên cứu cửa tác giả khác. Những kết quả nghiên cứu của các tác giả ác đưa vào trong đề tài đều có trích dẫn đầy đủ chính xác. Hà Nội, ngày.... Tháng.... Năm 2015 Tác giả Nguyễn Thị Hà LỜI CAM MỤC TÙ VIÉT TẮT Được ĐỌC LÀ BC Bacterial Cellulose Cs Cộng sự MTi Môi trường giữu giống MT 2 Môi trường nhân giống MT 3 Môi trường lên men taọ màng GK Glucokinase PGM Phosphoglucomutase PC Plant Cenlulose UGP Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase cs Cellulose synthase g gam STT Sô thứ tự MỞ ĐÀU 1. Lý do chọn đề tài Hiện nay các sản phấm sinh học ngày càng chiếm ưu thế, dần thay thế các sản phẩm hóa học. Màng BC được tạo thành nhờ nuôi cấy vi khuẩn là một sản phấm sinh học có nhiều ứng dụng thiết thực như trong bảo quản thực phẩm thay thế cho túi ni lông thân thiện với môi trường, ứng dụng trong trị bỏng, làm mặt nạ đắp da....Màng BC đã được nghiên cứu trên vi khuấn Acetobacter xylinum. Trong những năm gần đây, tại phòng thí nghiệm Vi sinh-khoa Sinh trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2, đã phân lập được chủng vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng tạo màng BC. Màng BC (Bacterial cellulose) Gluconacetobactercỏ cấu trúc đặc tính gần được tạo ra giống với thực từ vi khuẩn vật, màng này không chứa các hợp chất cao phân tử như ligin, hemicenllulose, peptin, sáp nến. Do đó chúng cóđặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bền chắc, khả năng polymer hóa cao. Trên thế giới Màng BC đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lý nước, làm môi trường cơ chất cho sinh học, làm màng bảo quản thực phẩm... Ở Việt Nam hiện nay, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm tốn, các kết quả ứng dụng Màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm. phát Nguồn dinh dưỡng có vai trò quan trọng đến quá trình sinh trưởng và triển của vi khuẩn Gluconacetobacte, đồng thời ảnh hưởng tới chất lượng màng BC. Trong đó nguồn cacbon có vai trò quyết định. Xuất phát từ lý do đó, tôi chọn đề tài: “Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình tạo màng BC cho vi khuẩn Gluconacetobacter 2. Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình lên men tạo màng BC cho chủng Gluconacetobacter. 3. Nội dung của đề tài 3.1.Khả năng lên men tạo màng BC chủng vỉ khuẩn Glunacetobacter. 3.2.Anh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter. 3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter. 3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng đường saccarose tới quá trình lên men tạo màng BC tử chủng Gluconacetobacter. 3.2.3. Ánh hưởng của hàm lượng nước dừa tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter. 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4.1.Ỷ nghĩa khoa học Nghiên cứu được nguồn cacbon phù hợp đối với quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Glunacetobacter BHN 2 . 4.2.Ỷ nghĩa thực tiễn Nghiên cứu góp phần rút ngăn được thời gian tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Glunacetobacter BHN 2 . 5. Phương pháp nghiên cứu 5.1. Phương pháp vi sinh 5.2. Phương pháp hóa sinh 5.3. Phương pháp toán học 6. Điểm mới của đề tài Đã tạo được màng BC từ chủng Gluconacetobacter sau thời gian 4 ngày trên môi trường nước dừa thích hợp. CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về vi khuấn Gluconacetobacter và màng BC 1.1.1. Phân loại vi khuấrt Gluconacetobacter Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Gluconacetobacter thuộc họ vi khuẩn ,Gluconacetobacter, Acetobacterceae. Họ này Gluconobacter, gồm 6 chi: Acetobacter Acidomonas,Asaia,Kozakia. Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuấn acetic.[20] 1.1.2. Hình thái tế bào học của vi khuẩn Gluconacetobacter Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm, có thế xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ. Te bào vi khuẩn này thường tìm thấy trong dịch, giấm, dịch hoa quả, đất....[17] 1.1.3. Đặc điểm nuôi cấy Trên môi trường thạch đĩa, chủng Gluconacetobacter hình thành khuẩn lạc có kích thước nhỏ đường kính từ l- 2 mm, nhẵn hoặc xù xì, rìa mép của khuẩn lạc bằng phang hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt. Chủng Gluconacetobacter BHN 2 khi nuôi cấy trên môi trường lỏng tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC. Khi nuôi cấy trong điều kiện lắc, sợi cenlulose hình thành ở dạng hạt nhỏ với kích thước không đều và phân tán trong môi trường dinh dưỡng có hình thái khác so với sợi cenlulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh. 1.1.4. Đặc điểm sình lý, sinh hóa của chủng Gluconacetobacter Đặc điểm sinh lý của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng, phát triến ở điều kiện nhiệt độ 25°c - 35°C; pH 4-6. Các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng được trong điều kiện pH thấp, vì vậy có thế bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn Iạ.[ 8 ] Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter bao gồm: Oxy hóa ethanol thành acetic, CƠ 2 H 2 O; Phản ứng catalase dương tính; Chuyến hóa glucose thành acid; Không sinh sắc tố nâu; Tống hợp cenlulose, không tăng trưởng trong môi trường Hoyer.[3] Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuấn Gluconacetobacter STT Đặc điểm Hiện tượng Kết quả 1 Oxy hoá ethanol thành Chuyến hoá môi trường chứa Brom + phenol Blue 0,04% từ màu xanh sang acid acetic màu vàng 2 Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí + — 3 Sinh trưởng trên môi Sinh khối không phát triến 4 5 6 7 trường Hoyer Chuyển hoá glycerol Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau thành dihydroxyaceton lên men Chuyển hoá glucose Vòng sáng xuất hiện xung quanh thành acid khuấn lạc trên môi trường chứa CaCƠ3 Kiểm tra khả năng sinh Không hình thành sắc tố nâu sắc tố nâu Kiếm tra khả năng tổng Váng vi khuấn xuất hiện màu lam hợp cellulose + + — + Đặc điểm màng BC của vi khuẩn Gluconacetobacter 1.2. Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn Gluconacetobacter BHN 2 hình thành nên lớp màng có bản chất là cenlulose, được tập hợp bởi nhiều bó sợi cenlulose liên kết với nhau được gọi là màng Bacterial cellulose hay màng BC. 1.2.1. Cấu trúc của màng BC Màng BC có đường kính bằng 1/100 đường kính cellulose của thực vật (PC - plant cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi một chuỗi polymer Pl,4glucopynanose, có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc, đặc tính thì khác xa nhau[17] Chuỗi polymer P"1,4glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ( subfibril) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo thành sợi lớn( microfibril) , những sợi nhỏ này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo thành dải ribbon . Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1- 9nm. Những rải ribbon được keeos ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết Hidro bằng hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy[ 20 ]. Hình 1.1. Sợi cellulose của cellulose thực vật và màng BC (SEM) 1.2.2. Một số tính chất của màng BC Brown A.J (1886), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra trên môi trường nuôi cấy và thấy có bản chất hemicelluloses. Hemicellulose là những polysaccharide không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính [18] Một số tính chất của màng BC: Độ tinh sạch: màng BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Độ bền cơ học: màng BC có độ bền tinh thế cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, on định về kích thước. Tính hút nước: màng BC có khả năng giữ nước đáng kế( trên 90%), có tính sốp. độ ẩm cao. 1.2.3. Chức năng của cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter Màng BC nằm ở mặt thoáng của môi trường nuôi cấy có tác dụng như một lớp bảo vệ các tế bào vi khuẩn Gỉuconacetobacter trước các nhân tố có hại của môi trường. Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi ta cực tím. Khoảng 25% số tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter được bao bọc bởi màng BC sống sót sau 1 giờ xử lý bằng tia cực tím. Khi tách màng BC ra khỏi tế bào, khả năng sống sót của chúng giảm đáng kế, chỉ còn 3%[2]. Ngoài ra màng BC còn là giá thể chống đỡ cho các tế bào vi khuẩn đồng thời giúp chúng lấy các dinh dưỡng từ môi trường một cách dễ dàng hơn so với khi ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose 1.3. Ánh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter Nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng tới quá trình lên men tạo màng gồm Nguồn cacbon, nguồn nitơ, phospho. Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, tôi đề cập chủ yếu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến quá trình lên men tạo màng BC. Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, thành phần enzim, acid nucleic và các sản phẩm trao đổi chất đổi chất. Do vậy hợp chất hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa quyết định trong đời sống vi sinh vật. Trong đó hàm lượng đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuấn. Đế tránh ở nhiệt độ cao và trong môi trường kiềm bị chuyển hóa khi khử trùng môi trường có chưá đường, người ta chỉ hấp thanh trùng môi trường ở điều kiện áp suất 0.5atm, 110°c. Hiện nay tại Việt Nam và một số quốc gia khác, nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất màng BC là nước dừa. Tùy theo giống dừa mà hình dạng và kích thước và trọng lượng trái dừa khác nhau, trong đó nước dừa chiếm 21 - 25% trọng lượng trái dừa, trung bình trọng lượng trái dừa chiếm khoảng 300ml nước. Trong nước dừa già chứa nhiều carbohydrate, vitamin, axit amin, các chất kích thích sinh trưởng... do đó nước dừa là môi trường thuận lợi cho sư phát triển của vi khuẩn G.BHN 2 . thành phần hóa học của nước dừa được thể hiện trong bảng sau: Bảng 1.2. Thành phần hóa học của nước dừa già Thành phần Tổng hàm lượng chất rắn(%) Đường khử(%) Chất khoáng(%) Protein(%) Chất béo(%) Ph K(mg%) Na(mg%) Ca(mg%) Mg(mg%) P(mg %) Fe(mg%) Cu(mg%) Hàm lượng 5.4 2 0.5 0.1 0.1 5.2 247 48 40 15 6.3 79 26 Nguồn: Satyavati Krishnankutty(1987) Bảng 1.3. Thành phần vitamin có trong nước dừa Thành phần 1. Vitamin nhoms Bi(|ug/ml) Axitnicotinic Axitpantothenic Biotic Riboflavin Axitfolic Piridoxin(B6) Thiamin(Bi) 2. vitamin(mg/ml) Nguồn: the wealth ò Indiaị1950) Hàm lượng(%) 0.64 0.52 0.02 0.01 0.003 Vêt Vêt 23-3.1 Bảng 1.4. Thành phần axỉtamỉn của nước dừa Thành phần Lanine Arginine Axit Aspatic Cystine Axit Glutamic Histidine Leucine Lycine Proline Phenylalanine Serine Tyrosine Hàm lượng (%) 2.41 10.75 3.60 0.97- 1.17 9.76-14.5 1.95-2.05 1.95-4.18 1.95-4.57 1.21 -4.12 1.23 0 59-0.91 2.83-3.00 Nguồn: Pradera và cộng sự nấm 1442 Như vậy nước dừa già là nguyên liệu tự nhiên chứa nhiều yếu tố quan trọng cho sự tạo màng BC. 1.4. Cơ chế tổng hợp màng BC Khi nuôi cấy vi khuấn Gluconacetobacter trong môi trường có nguồn dinh dưỡng đầy đủ( chủ yếu là cacbonhidrate, vitamin Bi, B ,Bi2--- và các chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiên quá trình trao đối chất của mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào bên trong tế bào, một phần nguồn dinh dưỡng này được sử dụng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra môi trường các sợi tơ nhỏ phát triến ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi trương nuôi cấy[22]. Theo tác giả Thiaman (1962) giải thích cách hình thành cenlulose như sau: các tế bào vi khẩn Gỉuconacetobacter khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với axit đế tạo tiền chất nằm ở màng tế bào. 2 Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm trên màng tế bào cùng với enzyme có the polymer hóa glucose thành cellulose. Theo đó, quá trình sinh tống hợp màng BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzym phức hợp xúc tác và các protein điều hoà. Theo tác giả Alina Krystynowicz và cộng sự cho rằng có 4 enzym tham gia xúc tác tống hợp cellulose ở vi khuấn Gluconacettìbacteĩ: Glucokinase (GK), Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS). Trong đó UGP là enzym có vai trò quan trọng nhất. CELLULOSE ▲ cs UDPGlc Glucose Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp cellulose của chủng Gluconacetobacter. 1.5. Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Gluoconacetobacter 1.5.1. Độ pH Vi khuẩn Gluconacetobacter phất triển thuận lợi trên môi trường có độ pH thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ xung thêm axit acetic nhằm axit hóa môi trường, đồng thời axit acetic còn có tác dụng sát khuấn, giúp ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật có hại [19] . 1.5.2. Nhiệt độ Theo Beyger nhiệt độ thích hợp với vi khuấn Gluconacetobacter vào khoảng 25 - 30 độ. Ớ nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và khả năng sinh sản của tế bào vi khuẩn và hiệu suất lên men bị giảm [ 22 ]. 1.5.3. Độ thông khí Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc [22]. Do đó điều kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. 1.5.4. Thòi gian nuôi cay Trong môi trường dinh dưỡng lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn sẽ xuất hiện một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36-48 giờ hình thành lớp màng trong và ngày càng dày. 1.6. ứng dụng của màng BC Màng BC đã thu sự hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: trong công nghệ môi trường, các nhà khoa học dung màng BC làm màng phân tách đế xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng lượng Brown.E.(2007), Jonas và Farad(l 998)[18] đã dùng màng như một chất đặc biệt đế biến đổi độ nhớt, làm các sơi truyền quang, màng BC được sử dụng để sản xuất giấy điện tử có chất lượng cao... Trong công nghệ thực phấm màng BC được sử dụng đế sản xuất thạch dừa, bảo quản thực phẩm thay thế túi nilon. Trong y học màng BC được xem như là một nguồn polymer sinh học mới, được sử dụng đẻ che phủ vết thương nhờ khả năng bền trong môi trường ấm, thấm hút dịch, không gây kích ứng da[23]. 1.7. Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới 1.7.1. Trên thế giới Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter và những ứng dụng của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, 1999, dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown, Jonas và Farad, dùng màng như là một chất đế biến đối độ nhớt, đế làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown đã dùng BC làm vải đặc biệt, Nogiet và cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki và cộng sự (2006) Sirlene M.Costa, dùng màng BC đế sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất đế cố định protein hay cho sắc kí [21]. Đặc biệt, trong y học, người ta đã chế tạo các phức chất (vật liệu composite) từ sự kết hợp giữa cellulose và chitosan hoặc cellulose và polyvinyl, các phức chất này được sử dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu điều trị các bệnh tim mạch [18]. Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng trong phẫu thuật và nha khoa. Ngoài ra, màng BC còn được sử dụng làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ, làm giấy chất lượng cao, microbial cellulose được dùng chế tạo màn hình điện tử, vải nonwoven (vải không qua dệt), thực phẩm phụ gia, làm cơ chất đế cố định protein hay cho sắc kí, .... Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng hình thành cellulose. Nghiên cứu chế tạo màng từ vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sản xuất giấy điện tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Hamlyn và cs (1997), Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004) Wan và Millon (2005), Czaja và cs, (2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí bản quyền về làm màng BC từ Acetobacter xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [23]. 1.7.2. Ỡ Việt Nam Ở Việt Nam những nghiên cứu về Gluconacetobacter và màng BC là khá mới mẻ, các nghiên cứu, công bố liên quan đến Gluconacetobacter, Acetobacter, sự hình thành BC và ứng dụng màng BC còn rất khiêm tốn. Năm 1997 có công trình của Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Mùi nghiên cứu môi trường nước giá đỗ thay thế nước dừa trong sản xuất thạch dừa từ vi khuẩn Acetobacter xỵlinum. Năm 19952000 các công trình nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter và khả năng lên men sinh acid acetic của nhóm tác giả Lê Văn Nhương, Nguyễn Thị Ngọt, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Văn Cách. Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình sinh acid acetic, khả năng tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng BC [3],[6],[7]; gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn. Năm 2000 nghiên cứu của nhóm Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thị Hương, Nguyễn Khắc Thanh, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men cho vi khuấn Acetobacter xylinum ứng dụng vào làm thạch dừa. Năm2003 có nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thuý Hường và Phạm Thành Hố về chọn lọc dòng Acetobacter xylinum thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn. Năm 2006 nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Văn Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan và cộng sự về màng BC từ Acetobacter xylinum tấm dầu mù u dùng trong điều trị bỏng. Năm 2008, có nghiên cứu của Đinh Thị Kim Nhung đã chọn được 1 chủng vi khuấn Acetobacter xylinum NH], khảo sát khả năng tạo tạo màng của chủng này. [5]. Việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ chủng Gluconacetobacter ngày càng được nhiều tác giả quan tâm.. Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ môn Vi Sinh - Ký Sinh, Trường đại học Y Dược học Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu mù u bằng phương pháp lên men. Màng BC có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích ứng da. Chính vì vậy dùng màng sinh học đế ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thương bỏng, tạo điều kiện che phủ sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời gian điều trị và giảm thiếu sẹo xấu trên vùng bỏng sâu[4]. Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã thu nhận màng BC từ vi khuẩn A.Xylinum, ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng. Công tác điều trị bỏng hiện đang sử dụng phương pháp cấy ghép, phẫu thuật, hoặc dùng một số màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitossan, sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng . Theo tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan, màng trị bỏng sinh học BC với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuấn đều có nguồn gốc thiên nhiên. Vì thế, nó không chứa các yếu tố nguy cơ như không có độc tố trực tiếp, không gây dị ứng, không có yếu tố lây lan mầm bệnh, không giải phóng chất lạ vào vết thương. Màng có khả năng diệt 100% vi khuấn thường gây ra các nhiễm trùng vết thương hở da như vết bỏng... Chỉ cần áp sát màng vào vết thương và không cần sử dụng bất cứ thứ gì khác, màng đã có khả năng cản khuẩn, đồng thời, làm vết mau lành do thúc đấy quá trình tạo mô hat[ 6 ]. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1. Thiết bị và hóa chất 2.1.1. Hóa chất - Nguồn đường: glucose, saccarose, fructose. - Nguồn nitơ: - Nguồn nitơ vô cơ: (NH 4 ) 2 SƠ 4 - Nguồn nitơ hữu cơ: pepton - Một số hóa chất vô cơ: KH 2 PO 4 , MgSƠ 4 . 7 H 20 . - Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fushsin, dung dịch lugol 2.1.2. Nước dừa, agar, ... Dụng cụ, thiết bị Trong quá trình tiến hành thí nghiệm tôi đã sử dụng những dụng cụ thiết bị như: Nồi hấp khử trùng Kính hiển vi quang học (olympus CX 41 , Nhật) Tủ sấy (Haraeus, Đức) Box cấy vô trùng (Haraeus, Đức) Cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ) Micropipep (Gilson, Pháp): Nồi hấp khử trùng Kính hiến vi quang học (olympus CX 41 , Nhật) Tủ sấy (Haraeus, Đức) Box cấy vô trùng (Haraeus, Đức) Cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ) Micropipep (Gilson, Pháp) 2.1.3. Môi trường nghiên cửu Acid 2.1.4.1. Môi trường giữ giong ( M T ] ) acetic 2% Glucose: 20g/l Nước Dừa: Pepton:5g/l 1000 ml Rượu etylic 2% MgS0 4 .7H 2 0: 2g/l Agar: 20g/l 2.2. 2.1.4.2. Môi trường nhân giốngịMTĩ) Phươ ng pháp Glucose: 20g/l nghiên Pepton: 5g/l cứu (NH4)2S04:3g/ 2.2.1. l Acid acetic vỉ sinh 2% 2.2.1.1. Phương 2.1.4.3. Môi trường lên menchuấn(MT3) Glucose: 20g/l Phương pháp pháp phân biệt tế bào vi khuân (NH 4 ) 2 S0 4 : 3g/l KH 2 PO 4 : 2g/l Nước máy: 1000 Gluconacetobac ml ter BHN 2 bằng phương pháp nhuộm Gram KH 2 PO 4 : 2g/l MgS0 4 .7H 2 0: 2g/l Nước Dừa: 1000 ml Rượu etylic 2% Vi khuấn Gluconacetobacter BHN 2 là các KH 2 PO 4 : 2g/l vi khuấn Gram âm, do (NH 4 ) 2 S0 4 :3g/l đó có thể phân biệt với vi MgS0 4 .7H 2 0: 2g/l khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép). Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 đem nhuộm tiêu bản theo phương pháp Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần. Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn Gram âm với vi khuấn Gram 2.2.1.3. Phương pháp hoạt hoá giong dương. Neu sau khi nhuộm kép mà tế bào bắt màu Giống từ ống hồng thì đó là vi khuấn Gram âm. Ngược lại nếu tế nghiệm bào bắt màu tím thì đó là vi khuẩn Gram dương. quản trong tủ lạnh, Khả năng bắt màu của vi khuẩm Gram âm và trước Gram dương khác nhau là do chất nguyên sinh của dụng phải hoạt hoá tế bào vi khuấn Gram dương được cấu tạo từ một giống, loại protein đặc biệt chứa muối nucleatmagie có đảm bảo đủ số lượng khả năng tạo màu tím với gentian và lugol tạo ra tế bào vi sinh vật cho một phức chất bền, khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi quá trình lên men. quan sát trên tiêu bản thấy tế bào vi khuẩn Gram Phương dương bắt màu tím của gentian trong khi đó những hoá giống sử dụng vi khuẩn Gram âm không có khả năng tạo phức môi chất bền với thuốc nhuộm gentian và lugol nên dễ chuẩn bị rửa trôi bởi cồn. Do đó, khi nhỏ íucshin lên tế thạch agar, đem hấp bào vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng - màu của thanh trùng ở 121° fucshin [3], [4], [5]. trong 20 phút. Sau 2.2.7.2. đó đem xử lý trong Phương pháp bảo quản chủng giong trên thạch nghiêng được khi bảo đem nhân pháp trường không sử giống hoạt tiếu có đèn tím 15 phút, cấy Các chủng giống sau khi phân lập, được sơ chuyến giống từ ống bộ xác định là Gluconacetobacter BHN2được thạch nghiêng vào và cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ nuôi ấm ở 30°c. Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 4°c vòng/phút dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Cấy truyền và 24giờ [4], [5]. giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 1 tháng một lần [4], [5]. lắc 135 trong 2.2.1.4. Phương pháp lên men tạo màng ngày trong điều kiện Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem thích hợp.Quan sát hấp thanh trùng ở 110°c trong 20 phút đế tránh hiện tượng nếu xung phân rã đường. Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím quanh khuẩn lạc có trong 15 phút. Bố sung vào môi trường dịch giống vòng phân giải canxi đã được hoạt hoá. Nuôi cấy ỏ’ điều kiện tĩnh theo là phản ứng dương dõi sự tạo màng BC. tính (acetat bị oxỉ 2.2.2. 2.2.2.1. hóa, calcium giải phương pháp hóa sinh phóng ra tạo màu Phát hiện hoạt tính catalase Nhỏ một giọt H 2 O 2 3% lên bề mặt khuẩn trắng sữa) , ngược lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi lại là âm tính [1 ]. khuấn đó được coi là có hoạt tính catalase 2.2.2.3. Phát (catalase +). Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không hiệnkhả năng chuyến có hoạt tính catalase (catalase -) [1] hoá glycerol thành 2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá acỉd acetỉc dihydroaceton Sử dụng môi trường sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn. khả năng hình thành Thành phần (g/1): Cao nấm men : lOg dihydroxyaceton từ Canxi glycerol. Chúng tôi acêtat: tiến hành trên môi lOg Thạch Đe phát hiện : 20 g : p 7,0-7,2 Phân phối môi trường vào bình tam giác đem khử trùng ở nhiệt độ 121°c trong 20 phút, để nguội khoảng 40 - 45°c đổ thạch đĩa, cấy vi khuẩn tuyến chọn mới hoạt hóa (18-24 giờ) nuôi từ 6 -7 trường bao gồm Nước máy: lOOOml thành phần sau: Gl yce rol: 4% (g/ 1) C ao nấ m m en : pH : 0,3 % (g/1) Cao ngô: 3% (g/1) CaCƠ 3 : 0,3% (g/1) (NH 4 ) 2 S0 4 : 0,1% (g/1) H 2 Ơ: lOOOml Hấp thanh trùng 121°c trong 10 phút. Đế môi trường nguội cấy giống vi khuấn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 30°c trong vòng 48h. Nhỏ dung dịch Fehling đế kiếm tra sự tạo thành dihydroxyaceton (có sự xuất hiện kết tủa CU2O màu đỏ gạch) [1]. 2.2.2.4. Phương pháp phát hiện khả năng tông hợp cellulose Nuôi cấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN 2 trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ phòng trong 3-4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H 2 S0 4 60% thấy màng chuyển từ màu trắng đục sang màu xanh lam. Qua đó, nhận thấy rằng chủng vi khuấn Gluconacetobacter BHN2 đã được hoạt hóa và thuần chủng lại, đáp ứng được nhu cầu cho quá trình nghiên cứu của đề tài. 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter Đe tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến quá trình tạo màng BC của chủng vi khuấn Gluconacetobacter, chúng tiến hành sử dụng môi trường nghiên cứu tạo màng chuẩn (MT 3 ), sau đó thay đổi hàm lương đường (glucose, sacarose, hàm lượng nước dừa), còn các thành phần khác của môi trường giữ nguyên theo tỷ lệ của môi trường lên màng cơ bản. Sau 5 ngày tiến hành thu màng và so sánh độ dày và khối lượng tươi của màng thu được ở các môi trường thí nghiệm, sau đó chọn ra môi trường có hàm lượng đường cho màng tốt nhất đế sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.4. Phương pháp xác định trọng lượng tuơi của màng BC Sau khi nuôi cấy màng được lấy ra, đế màng ráo nước khoảng 4-5 giờ trên khay nhựa ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Tiến hành cân màng trên cân điện tử. Trọng lượng tươi của màng được tính bằng hiệu số của trọng lượng khay nhựa lúc có và chưa có màng. 2.2.5. Phương pháp toán học Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp sau: Số trung bình cộng: dùng đế tính các giá trị trung bình của các lần lặp lại __ Ị n thí nghiệm. X = ~y, n =1 i Trung bình bình phương các sai lệch: ô = \ ấ (x.=Aí / 2-1 .rV Sai số đại diện của trung bình cộng: ±m = Hệ số biến thiên trung bình cộng: cv = £xlO O Trong đó : M là trung bình cộng các chỉ số acid tạo thành n là số lần thí nghiệm m là sai số đại diện của trung bình cộng lượng acid tạo thành X là chỉ số acid tạo thành trong các lần thí nghiệm CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khả năng lên men tạo màng BC từ chửng vi khuẩn Gluconacetobacter 3.1.1. Đặc điểm hình thái và tế bào học của vi khuẩnGluconacetobacter Chủng vi khuấn Gluconacetobacter BHN 2 được phân lập từ nguồn nguyên liệu bia Hà Nội, tại phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2. Hình 3.1 Chủng giống vi khuấn Hình 3.2. Kết quả nhuộm Gram Gluconacetobacter trên môi trường của vi khuẩn Gluconacetobacter thạch nghiêng Quan sát tế bào vi khuẩn G.BHN 2 dưới kính hiển vi quang học (olympus CX 41 , Nhật) ở độ phóng đại 1000 lần, xác định được vi khuấn G.BHN 2 CÓ dạng hình que thắng hay hơi cong, có thế đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, không sinh bào tử, là vi khuẩn Gram âm. 3.1.2. 3.3. Vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng trên môitrường trường thạch . Hình Vi khuấn Gluconacetobacter trên môi thạchđĩa đĩa Khuẩn lạc của G.BHN 2 có kích thước nhỏ, đường kính khuẩn lạc đạt từ l- 2 mm, tròn, bề mặt nhày, trơn bóng. 3.1.3. Vi khuẩn Gluconacetobacter nuôi cấy trên môi trường lỏng Khi nuôi cấy vi khuấn G.BHN 2 trên môi trường lỏng hình thành lớp màng có màu trắng, bề mặt màng nhẵn và dai. Hình 3.4. Vi khuẩn Gluconacetobacter trên môi trường lỏng 3.1.4. Kiếm tra hoạt tính catalase của chủng Gluconacetobacter Ket quả kiếm tra hoạt tính catalase thu được minh họa ở hình 3.5: Hình 3.5 Hoạt tính catalase của chũng vi khuấn Gluconacetobacter Khi nhỏ H 2 O 2 3% lên bề mặt khuấn lạc thấy có hiện tượng sủi bọt khí, có khí O 2 giải phóng ra, chứng tỏ vi khuan G.BHN 2 có khả năng sinh enzyme catalase. 3.1.5. Kiểm tra khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic. Ket quả thu được như hình 3.6, vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường CaCƠ 3 điều này chứng tỏ có sự xuất hiện của axit gliconic: H + + CaC0 3 —>Ca 2+ + H 2 0 + C0 2 Hình 3.6 vòng phân giải CaCƠ 3 3.1.6. Khảo sát khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Dựa theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Dương Minh Lam và cs, quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacer được tiến hành theo 4 bước cơ bản như sau: Bước l:Nhân giống ị Bước 2: Hoạt hóa ị Bước 3: Lên màng ị Bước 4: Thu màng Cụ thế tôi thực hiện các bước lên màng như sau: Bước 1: Nhân giống Quy trình nhân giống được tiến hành cấy truyền liên tục chủng G.BHN 2 trên môi trường thạch nghiêng. Bước 2: Hoạt hóa Tiến hành hoạt hóa bằng cách thu sinh khối vi khuẩn từ các ống giống G.BHN 2 nuôi trong bình chứa dịch nhân giống cấp 1 theo tỷ lệ 1 ống giống /250ml dung dịch. Sau đó lắc các bình nhân giống cấp 1 trong khoảng thời gian 24h đế thu sinh khối vi khuấn Gluconacetobacter. Hình 3.7. Vi khuấn Gluconacetobacter trên môi trường hoạt hóa Sau thời gian 24 giờ lắc, các bình giống vi khuấn G.BHN 2 CÓ màu trắng đục có hệ sợi trắng lơ lửng trong dung dịch, đó là các sơi cellulose mà vi khuấn sinh ra trong quá trình sinh trưởng. Bước 3 tạo màng Dùng micropipet cấy dịch nhân giống cấp 1 vào môi trường lên men theo tỷ lệ 10ml dịch giống/IOOml môi trường lên men. Tiến hành lên men tĩnh trong 4-7 ngày. Sau khoảng thời gian 4 ngày, thấy xuất hiện lớp màng màu trắng đục trên bề mặt dịch lên men, lóp màng này dai, có độ dày mỏng khác nhau ở các hộp khác nhau. Hình 3.8. Màng BC sau 5 ngày lên men Bước 4: thu màng Dùng cồn 90° bảo quản màng, dùng găng tay cao su vớt màng trong hộp lên men, tiến hành kiểm tra đặc tính của màng. 3.1.7. Kêm tra khả năng tông họp ceỉỉulose Nhỏ dung dịch lugol và H 2 SO 4 60% lên mặt lớp màng BC thấy xuất hiện màu lam. Hình 3.9. Kết quả nhuộm màng BC Qua hình 3.9 có thể kết luận vi khuẩn G.BHN 2 có khả năng hình thành màng cellulose. Như vậy đã lên men tạo màng BC ôn định cho chủng Gluconacetobacter sau thời gian 5 ngày. Một vấn đề tôi đặt ra trong nghiên cứu của mình, chất lượng màng BC của vi khuẩn G.BHN 2 thay đổi như thế nào khi thay đổi nguồn đường trong thành phần dinh dưỡng của môi trường lên men, từ đó cho phép tìm ra hàm lượng đường và nguồn đường thích hợp cho môi trường lên men của vi khuẩn. 3.2. Ảnh hưởng của của nguồn cacbon đến quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuấn Gluconacetobacter Quá trình lên men tạo màng BC từ vi khuấn Gluconacetobacter chịu ảnh hưởng trực tiếp của thành phần môi trường dinh dưỡng đặc biệt là nguồn cacbon. Trong phạm vi nghiên cứu của mình tôi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon là nước dừa, đường saccarose và đường glucose tới quá trình tổng hợp cellulose của chủng Gluconacetobacter. 3.2.1. Anh hưởng của hàm lượng đường glucose tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter Vấn đề ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose đến quá trình lên men tạo màng BC đã được nhiều tác giả nghiên cứu Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2009), gần đây nhất là nghiên cứu của nhóm tác giả Sara M. Santos, Jose M. Carbajo, Juan c. Villar (2013) [24]. Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả trên tôi nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng glucose tới khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN 2 như sau: Sử dụng môt trường MT3 để lên màng với sự thay đổi hàm lượng glucose từ 17g/l tới 23g/l, còn các thành phần còn lại tôi giữ nguyên, sau 7 ngày nuôi cấy tôi cấy, ở ngày thứ 4 màng bắt đầu hình thành. Tiến hành thu màng sau 6 ngày nuôi cấy. Ket quả được trình bày ở bảng 3.1: Bảng 3.1. Ánh hưởng cũa hàm lượng glucose đến màng BC Hàm lượng đường(g/l) Đặc điểm màng BC M±m(g) 17 Màng mỏng, nhẵn, dễ rách 6,57 ± 0,02 18 19 20 22 Màng dày, dai, nhẵn Màng mỏng, dai, nhẵn 23 6,7 ± 0,01 7,99 ± 0,03 7,36+ 0,04 6,15 + 0,03 5,37 + 0,02 Hàm lượng đường(g/l) Khối lương màng BC Í 2Ì ■ khối lượng màng STT -■ hàm lượng I---г STT 1 2 3 4 5 6 mẫ mẫ Hình 3.10. Biểu đề biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng đường 1 2 3 4 5 6 glucose và khối lượng màng BC Dựavào kết quả bảng 3.1 và hình 3.10 và đồ thị 3.11, tôi nhận thấy tỷ lệ màng BC hình thành phụ thuộc rất nhiều vào hàm lượng đường glucose. Neu hàm lượng đường nhỏ hơn 20g/l khối lượng màng BC đạt 6,57g/l, thấp hơn so khối lượng màng BC thu được ở hàm lượng glucose 20g/l. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Trung Kiên(2013) [14]. Do trong quá trình lên men 50% hàm lượng glucose tham ra vào quá trình hình thành màng BC, phần còn lại cung cấp hoạt động sống cho tế bào. Do đó hàm lượng đường glucose quá thâp ( 22 g), lượng glucose sẽ được chuyển hóa thành axit gluconic làm cho pH môi trường giảm, pH quá thấp sẽ làm ức chế sự phát triển của vi khuẩn, ức chế quá trình tạo màng BC, chất lượng màng không đảm bảo. Ket quả nghiên cứu này phù hợp với nhiều kết quả đã đưa ra như tác giả Nguyễn Trung Kiên xác định hàm lượng glucose thích hợp cho vi khuẩn Gluconacetobacter 20g/l [11]. Như vậy, hàm lượng glucose thích hợp cho môi trường lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter là 19g/l, 20g/l/. Hình 3.11. Khối lượng màng BC thu sau 4 ngày 3.2.1. Anh hưởng của hàm lượng đường saccarose tới khả năng lên men tạo màng BC Các nghiên cứu về ảnh hưởng của hàm lượng đường saccarose tới quá trình tạo màng BC còn rất khiêm tốn. Phần lớn các nghiên cứu về ảnh hưởng của hàm lượng đường saccarose tới khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter trong quá trình lên men kombucha. Hàm lượng đượng đường tối đa sử dụng cho quá trình lên men của vi khuẩn là 10 %, do đó đế nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccarose tới quá trình lên men tạo màng BC tôi xây dựng mô hình thí nghiệm như sau: Sử dụng môt trường MT3 để lên màng với sự thay đổi hàm lượng đường saccarose từ 5 g/1 tới 13g/l, còn các thành phần còn lại tôi giữ nguyên, sau 7 ngày nuôi cấy tôi cấy, tôi nhận thấy ở ngày thứ 4 màng bắt đầu hình thành, tiến hành thu màng sau 7 - 1 0 ngày nuôi cấy, tôi tiến hành thu nhận màng. Ket quả được trình bày ở bảng 3.2: Bảng 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng saccarose đến màng BC Hàm lượng saccarose(g/l) Đặc điếm màng BC Khối lượng tươi của màng BC (g) 5 7 8 10 13 Màng mỏng, không nhẵn và dễ bị rách 4,1 5,2 6,3 7,9 5,52 Màng mỏng, dai nhẵn Màng mỏng, khá dai và không nhẵn 10 Khói lượng mãng BC (g) 8 6 ■ hàm lượng đường saccharos 4 2 0 m ST T 1 2 3 45 1 2 3 4 5 Hình 3.12. Biểu đồ biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng đường saccarose và khối lượng màng BC \ Hình 3.13. màng BC thu được sau 7 ngày Từ bảng 3.2, biểu đồ 3.2, hình 3.12, nhân thấy vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sinh trưởng trên môi trường có nguồn đường saccarose, tuy nhiên chất lượng màng BC không được dày và dai so với màng BC thu được từ nguồn đường glucose. Trong môi trường axit đường saccarose được thủy phân thành đường glucose và fructose, là hai dạng đường đơn mà vi khuẩn Gluconacetobacter dễ sử dụng. Hàm lượng đường saccarose tối ưu sử dụng cho môi trường lên men tạo màng 10 g/l. 3.2.2. Anh hưởng của hàm lượng nuớc dừa tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 Việc sử dụng nước dừa là môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn cũng như quá trình tạo màng BC đã được nghiên cứu bởi Trân Như Quỳnh (2009) và Nguyễn Trung Kiên (2013). Dựa theo nghiên cứu của nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Trung Kiên, Nguyễn Thị Mai[l 1], tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lường nước dừa đến khả năng tạo màng BC như sau: Tiến hành lên men tạo màng BC từ chủng vi khuấn Gluconacetobacter trên môi trường MT3, trong đó có sự thay đôi về tỷ lệ nước máy và nước dừa 0%- 100% Sau 6 ngày tiến hành thu màng kết quả như bảng sau: Bảng 3.3. Khối lượng tươi màng BC trên môi trường nước dừa Hàm lượng nước dừa(%) Đặc điểm màng BC M±m(g) 0 25 50 75 100 Mong, dai, nhẵn, min 13.57 + 0.02 15.77 + 0.02 26.47 ± 0.04 25.47 ±0.03 19.08 + 0.04 Màng dày, dai, nhẵn Khối lượng màng3BC hàm lượng nước dừa (%) khôi lượng màng BC tươi (g) 0 25 50 75 _ 80 ^ _ Hàm lương nước dừa 100 8 Hình 3.14. Biểu đề biểu diễn méỉ tương quan giữa hàm lượng nước dừa và khối lượng màng BC tươi Hình 3.15. Màng BC thu được sau 6 ngày trên môi trường nước dừa Từ bảng 3.3, hình 3.11 và biểu đồ 3.3, tôi nhận thấy hàm lượng nước dừa 0% ta vẫn thu được màng BC, có đặc tính mỏng, min, dai. Ở môi trường có hàm lượng nước dừa đạt 50% khôi lượng tươi màng BC tăng lên, màng dày, min, trong, có các đặc tính ưu việt hơn. Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Brown (1992), trong thành phần của nước dừa có nhiều carbohydrate, vitamin, axit amin, các chất khoáng. Do đó nước dừa nguồn cacbon hữu cơ lý tưởng trong thành phần của môi trường lên men thích hợp tạo màng dày, dai, min. Tuy nhiên ở ngoài thị trường nước dừa có giá thành cao, vì vậy chi phí cho quá trình tạo màng BC trên môi trường nước dừa cao. Như vây nước dừa là nguồn nguyên liệu thích hợp sử dụng cho môi trường lên men tạo màng BC dày, dai, mịn, trắng. Hàm lượng nước dừa thích hợp đế tạo màng BC dày, dai, mịn đạt từ 50 - 75%. Ket quả nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với kết quả của các tác giả nghiên cứu trước đó như tác giả Nguyễn Trung Kiên (2013) xác định nước dừa là nguồn nguyên liệu lên men tạo màng BC thích hợp cho chủng Gluconactobacter 1. Kết luận 1.1. Đã tạo được màng BC từ Chủng vi khuẩn Gỉuconacetobacter BHN 2 sau thời gian 5 ngày. 1.2. KÉT LUẬN VÀ KIÉN Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose tới quá trình lên men tạo màng BC, xác định được hàm lượng glucose thích hợp tạo màng BC có chất lượng tốt 19g/l, 20 g/l. 1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng đường saccarose tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn BHN 2 , xác định được hàm lượng đường saccarose lên men tốt là 10 g/l 1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi khuấn BHN 2 , tôi xác định được nước dừa là nguồn nguyên liệu thích hợp sử dụng cho môi trường lên men tạo màng BC có chất lượng tốt và hàm lượng nước dừa thích hợp tạo màng BC dày, dai, mịn là 50 -75%. 2. Kiến nghị Vì điều kiện và thời gian nghiên cứu có hạn, nhiều vấn đề chưa thực hiện được, do đó chúng tôi đề nghị: Cần có những nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của nguồn cacbon đến quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN đế tìm thêm nguồn cacbon mới cho chủng Gluconacetobacter 2 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] . Nguyễn Lân Dũng (1976), Một sổ phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1 - 2 - 3 , Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội. [2] . Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi [3] . Nguyễn Thành Đạt (1999), Cơ sở vi sinh vật học, Tập l,tr. 52309, Nxb ĐHSP Hà Nội. [4] . Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành vỉ sinh vật, tr. 17-92, Nxb giáo dục. [5] . Vũ Thị Minh Đức (2001 ),Thực tập vi sinh vật, tr. 1-50, Nxb ĐHQG Hà Nội. [6] . Nguyễn Thúy Hương (2006), Chọn lọc dùng Gluconacetobacter BHN2 thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuân với quy mô lớn, Luận án tiến sỹ khoa học sinh học, trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh. [7] . Nguyễn Đức Lượng (2000), Công nghệ Vỉ sinh vật, tập 1 - 2 - 3 , tr. 84 - 90, tập l,Nxb Đại học Quốc Gia TP HCM. [8] . Nguyễn Thị Nguyệt (2008). Nghiên cứu vỉ khuẩn Gluconacetobacter B H N 2 cho màng Bacteriaỉ cellulose làm mặt nạ dưỡng da, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học ĐHSP Hà Nội. [9] . Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu một sổ đặc điếm của vi khuân Acetobacter và ứng dụng lên men acetỉc theo phương pháp chìm , Luận án PTS khoa học sinh học ĐHSP Hà Nội. [10] . Đinh Thị Kim Nhung, Dương Minh Lam(2012), ” nghiên cứu định danh chủng vi khuẩn BHN2_21 có khả năng tạo màng Bacterial celluse ( BC) phân lập từ mẫu bia Hà Nội”, Kỷ yểu toàn văn Hội nghị Khoa học lần thứ 8, DHKHTN- ĐHQG thành phố Hồ Chí Minh, ngày 9 và 10 tháng 11, năm 2012. [11] . Nguyễn Trung Kiên (2013 ),Anh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn Gỉuconacetobacter, Luận văn Thạc sĩ khoa Sinh -KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2. [12] . Nguyễn Thị Thùy Vân (2009), Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng tạo màng Bacterial cellulose của vi khuấn Gluconacetobacter B H N 2 phân lập từ một sổ nguồn nguyên liệu ở Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học, trường ĐHSP Hà Nội. [13] . Br Alaban C.A. (1967), Studies on the optimum conditions for ‘nata de coco’ bacterium or ‘nata’ formation in coconut water, The Philippnie Agriculturist, V.45. p. 490-515. [14] . Alexander s.l, Sang K. R (2005). Polysaccharides and polyamides in the food industry, Volume 2. www.wiley..vch. De. p 31-85. [15] . Alina K, Marianna T, Stanislaw B, Emilia K, Aleksander Ma, Andrzej p. (2005), “Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum”, Acta biochimica polonica, Vol. 52, pp. 691698. [16] . own R.M. (1999), Cellulose structure and biosynthesis, Pure Appl. Chem. (5) , p. 765-775. [18] . Brown R.M., Cousins S.K., Krystyna Kudlicka (1992), “Gravity effects on cellulose assembly”, American journal of botany 70 (11), pp. 1247 - 1258. [19] . Brown R.M., Willison J.H., Richardson C.L. (1976), “Cellulose biosynthesis in Acetobacter xylinum: Visualization of the site of synthesis and direct measurement of the in vivo process”, Proceedings of the National Academy of Science, Vol. 73, pp. 4565 — 4569. [20] . Bworn. E. (2007). Bacterial cellulose Thermoplastic polymer nanocomposites. Master of science in chemical engineering, Washington state university. [21] . Barbara s., Sebastian p, Dariusz D; (2008) Characteristics of Bacterial cellulose obtained from Acetobacter xylinum culture for application in [...]... xanh lam Qua đó, nhận thấy rằng chủng vi khuấn Gluconacetobacter BHN2 đã được hoạt hóa và thuần chủng lại, đáp ứng được nhu cầu cho quá trình nghiên cứu của đề tài 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter Đe tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến quá trình tạo màng BC của chủng vi khuấn Gluconacetobacter, chúng tiến hành... cứu của mình, chất lượng màng BC của vi khuẩn G.BHN 2 thay đổi như thế nào khi thay đổi nguồn đường trong thành phần dinh dưỡng của môi trường lên men, từ đó cho phép tìm ra hàm lượng đường và nguồn đường thích hợp cho môi trường lên men của vi khuẩn 3.2 Ảnh hưởng của của nguồn cacbon đến quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuấn Gluconacetobacter Quá trình lên men tạo màng BC từ vi khuấn Gluconacetobacter. .. Gluconacetobacter chịu ảnh hưởng trực tiếp của thành phần môi trường dinh dưỡng đặc biệt là nguồn cacbon Trong phạm vi nghiên cứu của mình tôi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon là nước dừa, đường saccarose và đường glucose tới quá trình tổng hợp cellulose của chủng Gluconacetobacter 3.2.1 Anh hưởng của hàm lượng đường glucose tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter Vấn đề ảnh hưởng của hàm... lỏng không có mạng lưới cellulose 1.3 Ánh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter Nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng tới quá trình lên men tạo màng gồm Nguồn cacbon, nguồn nitơ, phospho Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, tôi đề cập chủ yếu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến quá trình lên men tạo màng BC Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, thành phần enzim, acid nucleic... đường glucose đến quá trình lên men tạo màng BC đã được nhiều tác giả nghiên cứu Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2009), gần đây nhất là nghiên cứu của nhóm tác giả Sara M Santos, Jose M Carbajo, Juan c Villar (2013) [24] Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả trên tôi nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng glucose tới khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN... trọng cho sự tạo màng BC 1.4 Cơ chế tổng hợp màng BC Khi nuôi cấy vi khuấn Gluconacetobacter trong môi trường có nguồn dinh dưỡng đầy đủ( chủ yếu là cacbonhidrate, vitamin Bi, B ,Bi2 - và các chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiên quá trình trao đối chất của mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào bên trong tế bào, một phần nguồn dinh dưỡng này được sử dụng cho quá trình. .. năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Dựa theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Dương Minh Lam và cs, quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacer được tiến hành theo 4 bước cơ bản như sau: Bước l:Nhân giống ị Bước 2: Hoạt hóa ị Bước 3: Lên màng ị Bước 4: Thu màng Cụ thế tôi thực hiện các bước lên màng như sau: Bước 1: Nhân giống Quy trình nhân... 90° bảo quản màng, dùng găng tay cao su vớt màng trong hộp lên men, tiến hành kiểm tra đặc tính của màng 3.1.7 Kêm tra khả năng tông họp ceỉỉulose Nhỏ dung dịch lugol và H 2 SO 4 60% lên mặt lớp màng BC thấy xuất hiện màu lam Hình 3.9 Kết quả nhuộm màng BC Qua hình 3.9 có thể kết luận vi khuẩn G.BHN 2 có khả năng hình thành màng cellulose Như vậy đã lên men tạo màng BC ôn định cho chủng Gluconacetobacter. .. công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình sinh acid acetic, khả năng tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng BC [3],[6],[7]; gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn Năm 2000 nghiên cứu của nhóm Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thị Hương, Nguyễn Khắc Thanh, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men cho. .. cơ chất đế cố định protein hay cho sắc kí, Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng hình thành cellulose Nghiên cứu chế tạo màng từ vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sản xuất giấy điện tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là dùng trong ngành dược phẩm