Phát triển quy trình nhân giống in vitro hoa cẩm chướng đơn (dianthus mix)

... tài Phát triển quy trình nhân giống in vitro hoa cẩm chƣớng đơn (Dianthus Mix) Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình nhân nhanh giống hoa cẩm chƣớng đơn (Dianthus Mix) kỹ thuật nuôi cấy in vitro. .. trƣởng cẩm chƣớng in vitro - Ra rễ tạo in vitro hoàn chỉnh - Rèn luyện vƣờn ƣơm - Khảo sát sinh trƣởng phát triển hoa cẩm chƣớng đơn giống Mix đƣợc nhân kỹ thuật nuôi cấy in vitro Ý nghĩa khoa học... tài Nguyễn Thị Thanh Vân LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu đề tài Phát triển quy trình nhân giống in vitro hoa cẩm chƣớng đơn (Dianthus Mix) kết riêng em dƣới hƣớng dẫn thầy PGS.TS

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN THỊ THANH VÂN PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO HOA CẨM CHƢỚNG ĐƠN (DIANTHUS MIX) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Lê Văn Sơn HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận em đã đƣợc nhận sự giúp đỡ tận tình của tập thể và cá nhân. Trƣớc tiên em xin gửi lời cám ơn chân thành đến thầy Lê Văn Sơn và La Việt Hồng đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin trân trọng cám ơn ban lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật Khoa Sinh - KTNN, Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện tốt nhất cho em thực hiện đề tài. Em xin cảm ơn những lời động viên, quan tâm, khích lệ và giúp đỡ của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian nghiên cứu. Em xin chân trọng cám ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực hiện đề tài Nguyễn Thị Thanh Vân LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài “Phát triển quy trình nhân giống in vitro hoa cẩm chƣớng đơn (Dianthus Mix)” là kết quả của riêng em dƣới sự hƣớng dẫn của thầy PGS.TS. Lê Văn Sơn, số liệu đạt đƣợc là trung thực và không trùng lặp với các công trình đã công bố. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực hiên đề tài Nguyễn Thị Thanh Vân MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài.................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu............................................................................. 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................................ 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................. 3 4.1. Ý nghĩa khoa học........................................................................................................ 3 4.2.Ý nghĩa thực tiễn ......................................................................................................... 3 NỘI DUNG ............................................................................................... 4 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 4 1.1.ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÂY HOA CẨM CHƢỚNG ..................... 4 1.1.1. Đặc điểm phân loại ......................................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm sinh học ........................................................................... 4 1.1.3. Điều kiện sinh thái của cây hoa cẩm chƣớng [2] ............................ 5 1.2. GIÁ TRỊ KINH TẾ CỦA NGÀNH SẢN XUẤT HOA TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM ........................................................................... 7 1.2.1. Sản xuất hoa trên thế giới ............................................................... 7 1.2.2. Sản xuất hoa ở Việt Nam ................................................................ 8 1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẢNH ......................................... 12 1.3.1. Nhân giống bằng chồi chính hoặc chồi bên .................................. 14 1.3.2. Nhân giống bằng chồi bất định ..................................................... 15 1.4. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẨM CHƢỚNG......................... 17 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................ 19 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................. 19 2.1.1. Mẫu vật.......................................................................................... 19 2.1.2. Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................... 19 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm...................................................... 19 2.1.3.1. Thiết bị.................................................................................................................. 19 2.1.3.2. Dụng cụ ................................................................................................................ 19 2.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy...................................................................... 20 2.1.5: Điều kiện nuôi cấy ........................................................................ 20 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 20 2.2.1 Phƣơng pháp khử trùng .................................................................. 20 2.2.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm ..................................................... 21 2.2.3. Phƣơng pháp phân tích số liệu ....................................................................... 27 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 28 3.1. TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU ......................................................... 28 3.2. GIAI ĐOẠN TÁI SINH VÀ NHÂN NHANH CHỒI THÔNG QUA SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CHỒI NÁCH .................................................. 32 3.3. RA RỄ TẠO CÂY CẨM CHƢỚNG IN VITRO HOÀN CHỈNH. .. 35 3.4. ẢNH HƢỞNG CỦA NƢỚC DỪA ĐẾN SINH TRƢỞNG PHÁT TRIỂN CỦA CÂY. ................................................................................. 41 3.5. RÈN LUYỆN CÂY THÍCH NGHI VỚI MÔI TRƢỜNG VÀ KHẢO SÁT SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY HOA CẨM CHƢỚNG ĐƢỢC GIỐNG IN VITRO NGOÀI ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN.48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 52 1. Kết luận ............................................................................................... 52 2. Kiến nghị ............................................................................................. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................... 53 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT α-NAA α - Napthalene acelic acid BAP Thạch ND 6 - benzyl amino purin ĐC Công thức CT Đối chứng Agar  - indole - acetic acid MS Indode - 3 - butyric acid H2O2 Hydro peroxide (nƣớc oxy già) HgCl2 Thủy ngân Clorua MS Murashige and Skoog, 1962 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Ảnh hƣởng của nồng độ khử trùng đến tạo vật liệu in vitro... 30 Hình 3.2: Mẫu sạch sau 7 ngày. .............................................................. 31 Hình 3.3: Mẫu và chồi in vitro sạch........................................................ 31 Hình 3.4: Ảnh hƣởng của BAP đến quá trình tái sinh chồi bên của cây cẩm chƣớng in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy).............................................. 33 Hình 3. 5: Sự tạo chồi dƣới ảnh hƣởng của BAP ................................... 34 Hình 3.8: Ảnh hƣởng α-NAA đến sự hình thành số lƣợng rễ của cây. .. 37 Hình 3.9: Ảnh hƣởng của α-NAA đến chiều dài rễ của cây. .................. 37 Hình 3.10: Ảnh hƣởng α-NAA ở các công thức khác nhau trong nghiên cứu. .......................................................................................................... 39 Hình 3.11: Rễ ở nồng độ α-NAA 0,2 mg/l (sau 7 ngày nuôi cấy) .......... 40 Hình 3.12: Chiều dài rễ ở nồng độ α-NAA 0,2 mg/l (sau 7 ngày nuôi cấy). ......................................................................................................... 40 Hình 3.13: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự phát triển chồi của cây. .... 43 Hình 3.14: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự tạo chồi. ........................... 43 Hình 3.15: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự tạo rễ. ............................... 44 Hình 3.16: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến trọng lƣợng tƣơi. .................. 44 Hình 3.17: Chiều cao cây nuôi cấy trong môi trƣờng MS đối chứng sau 6 tuần. ......................................................................................................... 45 Hình 3.18: Chiều cao cây nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc dừa 5% - 6 tuần. ......................................................................................................... 46 Hình 3.19: Chiều cao cây nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc dừa 25% - 6 tuần. ......................................................................................................... 46 Hình 3.20: Khối lƣợng tƣơi cây cẩm chƣớng ở môi trƣờng MS - 9 tuần.47 Hình 3.21: Khối lƣợng tƣơi cây cẩm chƣớng ở nƣớc dừa 5% - 9 tuần. . 47 Hình 3.22: Khối lƣợng tƣơi cây cẩm chƣớng ở nƣớc dừa 25% - 9 tuần. 48 Hình 3.23: Ảnh hƣởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trong vƣờn ƣơm. ........................................................................................................ 49 Hình 3.24: Một số hình ảnh rèn luyện cây thích nghi với môi trƣờng tự nhiên. ....................................................................................................... 50 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Danh mục thiết bị thí nghiệm. .................................................. 19 Bảng 2.2: Các công thức thí nghiệm xác đinh hiệu quả của chất khử trùng. ................................................................................................................... 21 Bảng 2.3: Các công thức nghiên cứu ảnh hƣởng của BAP đến sự tái sinh chồi. ........................................................................................................... 23 Bảng 2.4: Các công thức nghiên cứu ảnh hƣởng của α-NAA đến sự tạo rễ của cây ...................................................................................................... 24 Bảng 2.5: Các công thức nghiên cứu ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây hoa cẩm chƣớng đơn giống Mix. ................ 25 Bảng 2.6: Công thức nghiên cứu sự thích nghi của cây in vitro qua các giá thể. ............................................................................................................. 26 Bảng 3.1: Hiệu quả khử trùng bề mặt của dung dịch javel đến tạo vật liệu in vitro. ...................................................................................................... 29 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của BAP đến quá trình tái sinh chồi bên của cây cẩm chƣớng in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy). .............................................. 32 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của α-NAA đến quá trình tạo rễ cây cẩm chƣớng Mix (sau 7 ngày nuôi cấy). ....................................................................... 36 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy đến một số chỉ tiêu sinh trƣởng của cây cẩm chƣớng in vitro......................... 41 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trong vƣờn ƣơm. ................................................................................................................... 48 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Cây cẩm chƣớng (Dianthus carryophyllus) thuộc họ Cẩm chƣớng (caryophyllaceae) có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản. Họ Cẩm chƣớng với khoảng từ 82 đến trên 120 chi với khoảng 3.000 loài [16]. Họ này phổ biến rộng khắp thế giới cây cẩm chƣớng chủ yếu là thân thảo, một số loài trong họ Cẩm chƣớng đƣợc trồng làm cây cảnh vì có màu sắc đẹp. Cẩm chƣớng có thể trồng để cắt hoa hoặc trồng trong các chậu nhỏ để trong nhà, trong công viên. Ở Việt Nam trong những năm gần đây xuất khẩu hoa tƣơi đã trở thành một ngành sản xuất có thu nhập cao và ổn định cho ngƣời sản xuất. Tuy nhiên xuất khẩu hoa tƣơi đòi hỏi phải có những điều kiện chặt chẽ từ giống, gieo trồng, chăm sóc…đến thu hoạch, công nghệ bảo quản, đóng gói, vận chuyển, an toàn thực phẩm và thị trƣờng nhập khẩu. Trong điều kiện hiện nay, ít có doanh nghiệp Việt Nam có thể đáp ứng đƣợc các yêu cầu này vì hoa xuất khẩu đòi hỏi mẫu mã đẹp, kích thƣớc đồng đều, đặc biệt là sạch bệnh. Vì vậy, để có đƣợc những giống hoa sạch bệnh thì hƣớng vận dụng các công nghệ cao nhƣ nuôi cấy mô; kỹ thuật canh tác và bảo vệ thực vật tiên tiến; áp dụng công nghệ nhà lƣới có mái che sáng đang đƣợc áp dụng rộng rãi ở một số cơ sở sản xuất nhƣ Đà Lạt và một số vùng khác. Nuôi cấy mô và tế bào đã có những đóng góp quan trọng để cải tiến giống cây trồng và còn nhiều tiềm năng ứng dụng trong tƣơng lai. Trong một vài năm gần đây, vi nhân giống đã trở thành một kỹ thuật đầy hứa hẹn để nhân nhanh và mở rộng sản xuất của những đối tƣợng thực vật đƣợc con ngƣời chọn lựa. Vi nhân giống thực tế là phiên bản thu nhỏ của nhân dòng đƣợc thực hiện trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật vi nhân giống hay nhân giống in vitro đƣợc thực hiện dựa trên khái niệm về tính toàn năng của tế bào 1 đƣợc nhà khoa học Harberlandt đƣa ra. Mỗi tế bào của cơ thể thực vật đều có tính toàn năng, chẳng hạn nhƣ khả năng phát triển thành cây mới dƣới điều kiện nuôi cấy cụ thể. Tính đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc hình thành, đặc biệt là ở các nƣớc đang phát triển, nơi có nhân công rẻ. Các quy trình vi nhân giống đã đƣợc phát triển trên nhiều đối tƣợng cây cảnh, chẳng hạn nhƣ cây hoa lay ơn [10], [15], hoa hồng, [30], [37], hoa cúc [33], [35], hoa cẩm chƣớng [21], [26] và cây hoa lan [7], [13]. Giống hoa cẩm chƣớng Dianthus Mix là một trong những giống hoa đẹp đang đƣợc trồng khá phổ biến ở khu vực Mê Linh – Hà Nội, nhu cầu về giống tốt, sạch bệnh là rất lớn. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu sản xuất thì cần thiết phải có một qui trình nhân giống có hiệu quả cao, đáp ứng thị trƣờng, chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài “Phát triển quy trình nhân giống in vitro hoa cẩm chƣớng đơn (Dianthus Mix)”. 2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình nhân nhanh giống hoa cẩm chƣớng đơn (Dianthus Mix) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Tạo vật liệu khởi đầu in vitro từ đốt thân của cây cẩm chƣớng ngoài tự nhiên. - Tái sinh và nhân nhanh cây hoa cẩm chƣớng thông qua phát triển chồi chính và chồi nách. - Tìm hiểu ảnh hƣởng của nƣớc dừa bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy tới một số chỉ tiêu sinh trƣởng của cây cẩm chƣớng in vitro. - Ra rễ tạo cây con in vitro hoàn chỉnh. - Rèn luyện cây con ngoài vƣờn ƣơm. 2 - Khảo sát sinh trƣởng và phát triển của cây hoa cẩm chƣớng đơn giống Mix đƣợc nhân bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần bổ sung các qui trình nhân giống các loại cây trồng bằng kĩ thuật in vitro. 4.2.Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần đƣa ra qui trình nhân nhanh hoa cẩm chƣớng đơn Mix tạo ra nguồn giống cho sản xuất. 3 NỘI DUNG Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÂY HOA CẨM CHƢỚNG 1.1.1. Đặc điểm phân loại Cây cẩm chƣớng (Dianthus carryophyllus) thuộc họ Cẩm chƣớng (Caryophyllaceae) có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản. Họ Cẩm chƣớng với khoảng từ 82 đến trên 120 chi với khoảng 3.000 loài [16]. Họ này phổ biến rộng khắp thế giới này chủ yếu là cây thân thảo, đa dạng nhất tại khu vực ôn đới, với một vài loài sinh sống trong miền núi tại khu vực nhiệt đới. Một vài thành viên của họ đƣợc biết đến nhiều nhất có các loài cẩm chƣớng (Dianthus), nhiều loài đƣợc trồng làm cây cảnh. 1.1.2. Đặc điểm sinh học a. Đặc điểm hệ rễ cây hoa cẩm chƣớng: Cẩm chƣớng có bộ rễ chùm, phát triển rất mạnh vào vụ chính để hút nƣớc, dinh dƣỡng. Chiều dài của rễ 15-20 cm. Khi vun gốc, cây cẩm chƣớng sẽ ra rễ phụ ở các đốt thân. Rễ phụ cùng với rễ chính tạo thành bộ rễ khoẻ mạnh để giữ cây và hút thức ăn nuôi cây tƣơi tốt, ra hoa nhiều, đẹp và thơm. b. Đặc điểm thân cây hoa cẩm chƣớng: Thân thảo, nhỏ, mảnh mai, thân mang nhiều đốt và rất dễ gãy ở các đốt. Thân cẩm chƣớng thƣờng có màu xanh nhạt, bao phủ 1 lớp phấn trắng xung quanh có tác dụng quan trọng chống thoát hơi nƣớc và bảo vệ cây khỏi bị sâu bệnh hại. Trên mỗi đốt mang lá và mầm nách. c. Đặc điểm bộ lá cây hoa cẩm chƣớng: Lá kép, mọc từ các đốt thân. Lá mọc đối, phiến lá dày, hình mũi mác, mép lá trơn. Mặt lá nhẵn, không có độ 4 bóng. Trên mặt lá có phủ một lớp phấn trắng, mỏng và mịn. Lớp phấn trắng có tác dụng làm giảm bốc hơi nƣớc. d. Đặc điểm hoa cây cẩm chƣớng: Cây cẩm chƣớng có 2 dạng: Hoa đơn và hoa kép. Hoa mọc đơn, từng chiếc một. Hoa nằm ở đầu cành và mang nhiều màu sắc. Ngay cả trên một hoa cẩm chƣớng kép cũng có từ 2 màu khác nhau trở lên. Nụ hoa có đƣờng kính 2-2,5 cm. Hoa khi nở hoàn toàn có đƣờng kính khoảng 5-8 cm. Hạt cẩm chƣớng nhỏ, nằm trong quả. Mỗi quả thƣờng có từ 100- 600 hạt. e. Công dụng y học: Hoa cẩm chƣớng còn đƣợc cho là có tác dụng chống nhiễm trùng, chống co thắt, trợ tim, loàm thoát mồ hồi và bổ trợ thần kinh (Chopra et al, 1986). Ngoài ra, nụ hoa và hoa trị chứng khó tiêu, sinh nở khó, lợi tiểu. Lá làm thuốc cho trẻ nhỏ chữa bệnh về ruột, các lá già nghiền ra chữa bệnh về mắt. 1.1.3. Điều kiện sinh thái của cây hoa cẩm chƣớng [2] - Đất trồng: Cẩm chƣớng ƣa đất thịt nhẹ, tơi xốp, nhiều mùn, giàu dinh dƣỡng, đất thoát khí, giữ ẩm tốt nhƣng không ứ nƣớc. pH thích hợp từ 6-7, độ ẩm 60-70%. - Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho hoa cẩm chƣớng sinh trƣởng và phát triển tốt là 18oC – 25oC. Nếu nhiệt độ vƣợt qua ngƣỡng thích hợp này, cây sẽ sinh trƣởng và phát triển kém, cho hoa với chất lƣợng kém, màu sắc không tƣơi, tuổi thọ trung bình giảm… - Ánh sáng: Ánh sáng thích hợp 1500-11000 lux, tối thích 2000-2500 lux. Trong quá trình phân hoá mầm hoa, nếu cƣờng độ ánh sáng cao > 11000 lux, cây sẽ có hoa sớm; nếu cƣờng độ ánh sáng thấp < 1000 lux cây sẽ có hoa muộn. - Độ ẩm: Độ ẩm thích hợp 60-70 % , tối thích 70 %. Độ ẩm tƣơng đối của không khí và đất ảnh hƣởng trực tiếp đến sự quang hợp và hô hấp của cây 5 cẩm chƣớng. Nếu độ ẩm đƣợc ổn định sẽ tạo điều kiện cho cây hút dinh dƣỡng và muối khoáng thuận lợi, cây sinh trƣởng tốt, năng suất và phẩm chất hoa cao. - Dinh dƣỡng: Nếu thiếu dinh dƣỡng cây sẽ còi cọc, hoa nhỏ và sâu bệnh hại dễ xâm nhập và phát triển. Nếu bón phân không cân đối, thừa dinh dƣỡng đạm, cây phát triển vóng cao, dễ bị lốp đổ và khả năng chống chịu kém. + Đạm: Có tác dụng thúc đẩy quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây, tham gia vào cấu tạo diệp lục. Thiếu đạm cây sinh trƣởng kém, cho hoa nhỏ, nhanh tàn, lá vàng úa, nếu thiếu trầm trọng cây sẽ ngừng sinh trƣởng và chết. Tuy nhiên, thừa đạm cây sẽ mọc um tùm, lá nhiều và yếu ớt dễ phát sinh bệnh. Hoa cũng yếu dễ bị gục ngã và nhanh tàn. + Lân: Giúp cho bộ rễ cây phát triển khoẻ mạnh là tiền đề cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây sau này. Lân giúp cho hoa bền, đẹp. Thiếu lân lá thƣờng có màu tím, màu tím từ mép lá lan dần vào bên trong. Hoa nhỏ, chóng tàn, màu sắc nhợt nhạt. Trong quá trình sinh trƣởng của cây, cây cần lân nhiều vào giai đoạn sinh trƣởng sinh thực tức là khi ra hoa kết quả. Vì vậy, cần phải hiểu nhu cầu của cây để cung cấp lân vào các giai đoạn hợp lý. + Kali: Giúp cho cây cứng cáp, chống chịu tốt với điều kiện bất lợi của môi trƣờng và sâu bệnh hại. Cây cần kali nhiều vào lúc ra hoa, giúp cành hoa cứng cáp, màu sắc hoa tƣơi, bền lâu. Nếu thiếu kali thì đầu chóp lá già, bắt đầu vàng và chết khô, sau đó là phần thịt lá . + Canxi: Giúp cho cây chống chịu tốt với điều kiện bất lợi. Thiếu canxi trên lá non xuất hiện những đốm màu xanh nhạt, nghiêm trọng hơn là bị chết khô. 6 1.2. GIÁ TRỊ KINH TẾ CỦA NGÀNH SẢN XUẤT HOA TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.2.1. Sản xuất hoa trên thế giới Ngành trồng hoa đƣợc bắt đầu từ những năm 1800 ở nƣớc Anh khi mà cây hoa đƣợc trồng trên những cánh đồng mênh mông [39]. Ngày nay, ngành trồng hoa là một trong những ngành công nghiệp chính ở cả nƣớc đang và đã phát triển. Sản xuất của ngành trồng hoa trên thế giới tăng nhanh với tốc độ 10% trên năm. Hiện này có trên 50 quốc gia đã chủ động sản xuất hoa ở quy mô công nghiệp. Tổng diện tích của ngành trồng hoa trên thế giới (tính cả diện tích đƣợc bảo vệ và diện tích không đƣợc bảo vệ) khoảng 628.972 ha. Trong số các nƣớc trồng và sản xuất hoa, Hà Lan, Mỹ, Nhật Bản, Italia, Đức và Canada là những nƣớc sản xuất hoa lớn nhất thế giới, đặc biệt là hoa cắt cành. Một số nƣớc đang phát triển ngành trồng hoa (gồm cả trồng và xuất khẩu) nhƣ Columbia, Hàn Quốc, Kenya, Itxaren, Ecuado, Ba Lan, Etiopia, Costarica, Thái Lan, Ấn Độ, Trung Quốc, Zimbabue và Mexia. Trung Quốc với 286.068 ha, Ấn Độ với 161.000 ha đang là hai nƣớc có diện tích trồng hoa cắt cành chủ yếu trên thế giới, Vùng Châu Á-Thái Bình Dƣơng chiếm khoảng 75% tổng diện tích trồng hoa của thế giới [32]. Châu Âu, Mỹ và Nhật Bản là những nƣớc tiêu thụ hoa lớn nhất. Các siêu thị tiêu thụ hoa ở các nƣớc lớn lần lƣợt là Đức (22%), Mỹ (15%), Pháp (10%), Anh (10%), Hà Lan (9%), Nhật Bản (6%), Thụy Sĩ (5%) và Italia (5%). Trong trƣờng hợp hoa cắt cành, tính trên khả năng tiêu dùng thì Nhật Bản là quốc gia sử dụng nhiều hoa nhất thế giới, sau đó là Châu Âu và Mỹ. Cả Liên minh Châu Âu tiêu thụ trên 50% lƣợng hoa của thế giới, trong đó Đức là quốc gia đóng vai trò chủ yếu, sau đó là Anh, Pháp và Italia [12]. Mức thƣơng mại toàn cầu hàng năm đƣợc công bố vào khoảng trên 100 tỷ đô la. Trong đó hoa cắt cành chiếm phần lớn lợi nhuận, sau đó là hoa trồng 7 chậu, cây giống, củ hoa… Ở các nƣớc phát triển của Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Á chiếm trên 90% sản lƣợng thƣơng mại của ngành trồng hoa. Đức là quốc gia nhập khẩu chủ yếu trong khi đó Hà Lan là nƣớc xuất khẩu hoa chủ yếu, sau đó là Colombia, Italia, Itxaren. Các nƣớc Châu Á-Thái Bình Dƣơng là những nƣớc cung cấp hoa chủ yếu cho Nhật Bản và Hồng Kông. Sản phẩm xuất khẩu của ngành trồng hoa tính cả thế giới vào khoảng 17 tỷ đô la (2007). Hoa cắt cành tƣơi và hoa trang trí (bằng bộ lá) ƣớc tính chiếm khoảng 49,1% (khoảng 8,31 tỷ đô la), thực vật tƣơi, củ và cành giâm chiếm khoảng 50,9% (khoảng 8,60 tỷ đô la) vào năm 2007. Trong đó, hoa hồng chiếm khoảng 70% sản lƣợng hoa thƣơng mại. Hà Lan là nƣớc có ngành công nghiệp hoa phát triển vào bậc nhất thế giới, ƣớc tính sản lƣợng thƣơng mại của ngành trồng hoa nƣớc này vào khoảng 49,6% (tƣơng đƣơng 8,56 tỷ đô la) tổng giá trị của ngành hoa xuất khẩu của thế giới năm 2007. Colombia là nƣớc xuất khẩu hoa lớn thứ hai trên thế giới, chiếm khoảng 6,5% (tƣơng đƣơng 1,12 tỷ đô la). Đức là nƣớc nhập khẩu hoa lớn nhất trên thế giới khoảng 2,59 tỷ đô la, sau đó là Anh (1,89 tỷ đô la), Mỹ (1,81 tỷ đô la), Hà Lan vừa là nƣớc sản xuất vừa là nƣớc nhập khẩu hoa, hàng năm Hà Lan nhập khoảng 1,55 tỷ đô la, Pháp nhập khoảng 1,43 tỷ đô la [32]. Trong số các sản phẩm của ngành trồng hoa đƣợc các nƣớc nhập khẩu thì hoa hồng là loại hoa chủ yếu đƣợc nhập khẩu bởi các nƣớc Châu Âu, ngoài ra còn nhập khẩu các loại hoa mùa hè, hoa vùng nhiệt đới và hoa lan. Nhật Bản là một nƣớc nhập khẩu hoa lớn nhất ở vùng Châu Á-Thái Bình Dƣơng. 1.2.2. Sản xuất hoa ở Việt Nam Thực trạng của ngành sản xuất hoa và cây cảnh ở Việt Nam Hoa tƣơi xuất khẩu của các nƣớc Đông Nam Á nói chung và Việt Nam nói riêng khó có thể thâm nhập vào thị trƣờng khu vực Bắc Mỹ hoặc Trung Âu vì các thị trƣờng này đã có truyền thống nhập khẩu hoa tƣơi từ các khu 8 vực khác nhƣ vùng Nam Mỹ và Trung Mỹ, các nƣớc Nam Âu, Itxaren và Châu Phi. Những thị trƣờng này cũng khá xa về khoảng cách địa lý nên chi phí vận chuyển sẽ không phải là lợi thế. Các yếu tố liên quan đến việc đạt đƣợc những mục tiêu trung hạn này chỉ có thể là giá cả và các dịch vụ khách hàng. Đối với xuất khẩu hoa, mục tiêu ngắn hạn là phát triển sang các nƣớc Châu Á nhƣ Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Singapore... Những thuận lợi khi bán hàng cho những nƣớc này chính là vị trí địa lý gần, các yêu cầu vận chuyển và chi phí cho việc bảo quản sau khi thu hoạch thấp và sự liên hệ để tìm khách hàng thƣờng có thể dựa vào các mối quan hệ kinh doanh hiện tại. Thị trƣờng trong nƣớc rộng lớn và phong phú, bên cạnh đó tiềm năng xuất khẩu cũng đầy hứa hẹn, hoa và cây cảnh Việt Nam nếu đƣợc tổ chức tốt từ khâu sản xuất, quảng bá đến tiêu thụ sẽ tạo tiềm lực kinh tế lớn cho ngành sản xuất nông nghiệp Việt Nam trong tiến trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng. Với khí hậu và thổ nhƣỡng thuận lợi để có thể trồng đƣợc nhiều loại hoa và cây cảnh, hiện Việt Nam đang sở hữu một nguồn tài nguyên hoa rất đa dạng, từ các loại hoa xứ nhiệt đới đƣợc trồng ở các vùng đồng bằng đến hoa xứ lạnh trồng trên các cao nguyên nhƣ Lâm Đồng, Pleiku và vùng núi nhƣ Sapa, Hoàng Liên Sơn...Sự phát triển của ngành hoa Việt Nam trong thời gian qua đã mang lại cho các sản phẩm hoa của Việt Nam sự đa dạng và chất lƣợng vƣợt bậc so với thời gian trƣớc. Phương hướng phát triển sản xuất và xuất khẩu hoa tươi thời kỳ đến 2015 Đời sống tinh thần ngày càng đƣợc coi trọng hơn, sản phẩm hoa và cây cảnh cũng có vai trò quan trọng trong cuộc sống khi thu nhập và nhu cầu thẩm mỹ của ngƣời dân ngày càng cao. 9 Dự kiến đến năm 2015 vùng hoa TP Hồ Chí Minh có 1500 ha, diện tích tập trung chính ở các huyện Củ Chi, Thủ Đức; diện tích hoa đƣợc trồng theo quy trình công nghệ cao chiếm tỷ lệ lớn (khoảng 60-70% diện tích). Vùng Đông Nam Bộ: Dự kiến đến năm 2015 vùng hoa Lâm Đồng 3000 ha, diện tích tập trung chính ở TP Đà Lạt (chiếm 1/3 diện tích toàn tỉnh); chủ yếu hoa ôn đới đƣợc trồng theo quy trình công nghệ cao. Vùng Tây Nguyên: Dự kiến đến năm 2015 vùng hoa hàng hoá tập trung ở Vùng Trung du Miền núi Bắc bộ có khoảng 500 ha, tập trung chính ở Lào Cai, Hà Giang, Sơn La. Vùng Trung du Miền núi Bắc bộ: Dự kiến đến năm 2015 Hà Nội có 3000 ha, diện tích tập trung chính ở huyện Từ Liêm (Tây Tựu), Đông Anh, Quận Tây Hồ, Mê Linh v.v Sản xuất của ngành hoa ở Việt Nam Đà Lạt là vùng sản xuất hoa nổi tiếng và là vùng có tiềm năng lớn nhất về sản xuất hoa của cả nƣớc. Hiện nay công ty TNHH Đà Lạt - Hasfarm 100% vốn nƣớc ngoài đang áp dụng công nghệ sản xuất hoa tiên tiến với qui mô diện tích 15 ha sản xuất trong nhà kính và 2 ha nhà thép; có hệ thống tự động điều chỉnh nhiệt độ, ẩm độ, hệ thống tƣới nhỏ giọt bằng nguồn nƣớc sạch hòa tan với phân bón, thuốc bảo vệ thực vật. Các chủng loại hoa Công ty Đà Lạt - Hasfarm đang sản xuất bao gồm hoa hồng, cúc, cẩm chƣớng, ly ly, đồng tiền và lá hoa trang trí. Sản lƣợng hoa xuất khẩu sang các nƣớc Hồng Kông, Nhật, Đài Loan, Singapore... chiếm 55%, phần còn lại dành cho tiêu thụ nội địa. Hiện nay, sản xuất hoa ở nƣớc ta đƣợc thực hiện bởi 2 đối tƣợng chính: Nông dân sản xuất tự phát theo xu hƣớng nhu cầu thị trƣờng trong nƣớc và bởi các doanh nghiệp tƣ nhân trong nƣớc, liên doanh với nƣớc ngoài hoặc 100% vốn nƣớc ngoài sản xuất hoa chủ yếu cho xuất khẩu. Hoa tiêu thụ trong 10 nƣớc chủng loại đa dạng và cung cấp ra thị trƣờng theo mùa vụ, chất lƣợng từ thấp đến cao, giá cả vừa phải, hiệu quả kinh tế không cao, sản xuất nhỏ lẻ và thiếu ổn định. Các doanh nghiệp sản xuất hoa xuất khẩu lƣợng hoa nhiều hơn mang tính hàng hoá, chất lƣợng hoa cao hơn và đƣợc sản xuất trong điều kiện kỹ thuật cao, sản phẩm đƣợc tiêu thụ theo hợp đồng. Hiện nay, Việt Nam đã xuất khẩu đƣợc các sản phẩm hoa cắt cành nhƣ hồng, phong lan, cúc, đồng tiền, cẩm chƣớng, ly ly, sao tím...sang Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Nhật bản, Singapore. Australia, Ả rập; vạn niên thanh, mai chiếu thủy, mai cảnh... sang Trung Quốc, Hoa Kỳ, Nhật Bản. Tuy nhiên, số lƣợng xuất khẩu không nhiều, với doanh thu hơn 10 triệu USD/năm. Sở dĩ, sản phẩm hoa, cây cảnh của Việt Nam khó thâm nhập thị trƣờng thế giới là do chủng loại, chất lƣợng, kích cỡ không đồng đều, chƣa đáp ứng đƣợc thị hiếu của khách hàng quốc tế. Trong khi đó, tiêu thụ trong nƣớc lại có xu hƣớng chạy theo mùa vụ (rằm, lễ, Tết, các ngày kỷ niệm) là chính. Sản xuất và xuất khẩu hoa tƣơi đòi hỏi phải có những điều kiện chặt chẽ từ giống, gieo trồng, chăm sóc…đến thu hoạch, công nghệ bảo quản, đóng gói, vận chuyển, an toàn thực phẩm và thâm nhập vào các kênh phân phối của thị trƣờng nhập khẩu. Trong điều kiện hiện nay, ít có doanh nghiệp Việt Nam có thể đáp ứng đƣợc các yêu cầu này. Vì vậy, trƣớc mắt cần tập trung phát triển một số loại hoa Việt Nam có tiềm năng xuất khẩu và tƣơng đối dễ đáp ứng yêu cầu của đối tác nƣớc ngoài. Về ứng dụng công nghệ cao: Đã đƣợc cải thiện đáng kể, nhƣ thay đổi cơ cấu giống, nuôi cấy mô, kỹ thuật canh tác và bảo vệ thực vật tiên tiến; áp dụng công nghệ nhà lƣới có mái che sáng... Tuy nhiên, sự thay đổi này diễn ra không đồng đều giữa các vùng sản xuất vì nhiều lý do (khí hậu thời tiết, trình độ thâm canh, khả năng đầu tƣ, khả năng tiếp cận kỹ thuật tiến bộ và thị 11 trƣờng…). Đà Lạt có thể coi là địa bàn có tiến bộ nhanh nhất trong cả nƣớc về phát triển sản xuất hoa cắt cành Kỹ thuật trồng hoa: Ở nhiều nơi vẫn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm và phƣơng pháp nhân giống cổ truyền nhƣ gieo từ hạt, trồng từ củ, mầm, nhánh. Các phƣơng pháp này dễ trồng, giá thành cây giống thấp nhƣng chất lƣợng giống không cao, dễ bị thoái hóa, làm giảm chất lƣợng hoa vì vậy tuy chủng loại hoa của Việt Nam khá phong phú nhƣng thiếu giống hoa đẹp, chất lƣợng cao. Về quy mô và tổ chức sản xuất: Hầu hết những cơ sở sản xuất hoa cắt cành ở nƣớc ta còn ở quy mô nông hộ nhỏ, tổ chức sản xuất đơn lẻ, với diện tích trung bình từ 2.000 đến 3.000 m2/hộ. Hộ sản xuất hoa lớn cũng chỉ từ 1 đến 2 ha. Ở quy mô sản xuất này không thể áp dụng những kỹ thuật tiến bộ nhƣ nhà kính, nhà lƣới, sân bãi, mặt bằng, dây chuyền chế biến, bảo quản vận chuyển lạnh…để đƣa ngành sản xuất hoa trở thành sản xuất công nghiệp. Từng hộ nông dân sản xuất cá lẻ, thiếu hợp tác là trở ngại lớn cho việc tạo nguồn hàng hóa lớn và đa dạng với chất lƣợng cao, đồng nhất. Trên thực tế, đã có nhiều hợp đồng xuất khẩu không thể thực hiện đƣợc do không thể tổ chức cung cấp sản phẩm theo yêu cầu, trong khi tiềm năng sản xuất là rất lớn [38]. 1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẢNH Sản xuất thƣơng mại các loại cây trang trí (cây cảnh, cây hoa…) đang phát triển trên thế giới. Đây là một ngành mang lại lợi nhuận cao và không ngừng phát triển trong hai thập kỉ qua, hứa hẹn là một ngành công nghiệp tiềm năng trong tƣơng lai [18]. Quá trình nhân giống và cải tiến chất lƣợng sản phẩm cây cảnh chẳng hạn nhƣ kiểu lá, màu hoa, mùi hƣơng, độ bền của sản phẩm đang là những mục tiêu quan trọng của ngành công nghiệp này. 12 Nuôi cấy mô và tế bào đã có những đóng góp quan trọng để cải tiến giống cây trồng và còn nhiều tiềm năng ứng dụng trong tƣơng lai. Trong một vài năm gần đây, vi nhân giống đã trở thành một kỹ thuật đầy hứa hẹn để nhân nhanh và mở rộng sản xuất của những đối tƣợng thực vật đƣợc con ngƣời chọn lựa. Vi nhân giống thực tế là phiên bản thu nhỏ của nhân dòng đƣợc thực hiện trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật vi nhân giống đƣợc thực hiện dựa trên khái niệm về tính toàn năng của tế bào đƣợc nhà khoa học Harberlandt đƣa ra. Mỗi tế bào của cơ thể thực vật đều có tính toàn năng, chẳng hạn nhƣ khả năng phát triển thành cây mới dƣới điều kiện nuôi cấy cụ thể. Nền công nghiệp cây cảnh đã đƣợc ứng dụng rất nhiều phƣơng pháp nhân giống in vitro nhằm mở rộng quá trình nhân giống ở quy mô công nghiệp. Tính đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc hình thành, đặc biệt là ở các nƣớc đang phát triển, nơi có nhân công rẻ. Các quy trình vi nhân giống đã đƣợc phát triển trên nhiều đối tƣợng cây cảnh, chẳng hạn nhƣ cây hoa lay ơn [10], [15], hoa hồng [30], [37], hoa cúc [33], [35], hoa cẩm chƣớng [21], [26] và cây hoa lan [7], [13]. Quá trình vi nhân giống là một quá trình phức tạp, đƣợc phân chia thành ba nhóm phƣơng pháp chính: 1/ Nhân giống bằng chồi chính hoặc chồi bên 2/ Nhân giống bằng cách phát sinh chồi bất định 3/ Quá trình phát sinh phôi sôma Hai phƣơng pháp nhân giống đầu tiên có cây con đƣợc hình thành thông quá trình phát sinh cơ quan: Các chồi đơn cực đƣợc hình thành (cực chồi), sau đó các chồi này đƣợc chuyển sang môi trƣờng ra rễ để hình thành nên cực còn lại (cực rễ). Ngƣợc lại, quá trình phát sinh phôi sôma dẫn đến sự hình thành 13 phôi lƣỡng cực thông qua một số bƣớc tƣơng tự nhƣ quá trình phát triển của phôi hữu tính. Tất cả các phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để sản xuất cây cảnh trong điều kiện in vitro. 1.3.1. Nhân giống bằng chồi chính hoặc chồi bên Chồi chính và chồi bên ở trạng thái nghỉ hoặc trạng thái hoạt động, tùy thuộc vào trạng thái sinh lý của mẫu. Vi nhân giống thông qua hình thành chồi chính hoặc chồi bên là một trong những kỹ thuật tốt nhất để nhân nhanh giống cây trồng bởi vì sự ổn định di truyền của các dòng đƣợc nhân ra. Một đỉnh chồi và một chồi bên khi đƣợc sinh trƣởng trong điều kiện có nồng độ cytokinin cao thƣờng phát triển chồi bên tạo thành cụm chồi, từ đó có thể đƣợc nhân lên thành các cụm chồi theo cách tƣơng tự. Quá trình nhân lên này có thể là vô hạn, từ đó có hàng triệu cây giống có thể đƣợc nhân lên từ một chồi chính hoặc chồi bên. Phƣơng pháp này có độ di truyền ổn định cao bởi vì các tế bào của mô phân sinh đồng nhất lƣỡng bội, các tế bào có độ đồng đều cao. Hệ số nhân giống bằng kỹ thuật này khác nhau, tùy thuộc vào kiểu gen và lƣợng cytokinin sử dụng. Theo tác giả Udom và cộng sự (2009), hệ số nhân chồi từ đoạn thân trƣởng thành của cây hoa hồng lai Rosa hybrida trên môi trƣờng bổ sung BAP (13,2 µM) kết hợp với NAA (0,022 µM) cho tỷ lệ hình thành số chồi trên mẫu là cao nhất [34]. Còn tác giả Waseem và cộng sự (2009) đƣa ra quy trình nhân giống in vitro cây hoa cúc từ đỉnh chồi trên môi trƣờng bổ sung IAA với nồng độ 0,48 µM cho tỷ lệ hình thành chồi cao nhất (86,6%) [35]. Sự hình thành đa chồi cũng đƣợc nghiên cứu trên đối tƣợng hoa hồng Rosa rugosa từ đốt thân trên môi trƣờng MS có bổ sung BAP (2,2 µM) + NAA (0,054 µM) + GA3 (2,0 µM) với lƣợng đƣờng sacarozơ 3% [37]. Tác giả Haouala và cộng sự (2012) đã phát triển một quy trình để nhân giống in vitro cây hoa lay ơn từ chồi đỉnh trên môi trƣờng MS có bổ sung IBA (2,46 µM) và BAP (9,84 µM) [15]. Trên đối tƣợng cây hoa cúc, tác giả Nalini 14 (2012) đƣa ra kết luận sự hình thành chồi từ chồi đỉnh trên môi trƣờng MS có bổ sung Kinetin (13,85 µM) và IAA (9,6 µM) [29]. Tác giả Shirdel và cộng sự (2013) thông báo quá trình nhân dòng cây hoa hồng Rosa canina từ chồi bên trên môi trƣờng MS có bổ sung BAP (26,4 µM) là phù hợp nhất [30]. 1.3.2. Nhân giống bằng chồi bất định Có rất nhiều loại cây cảnh đã đƣợc nhân giống in vitro thành công bằng việc hình thành các chồi bất định. Các chồi bất có thể đƣợc: - Phát triển trực tiếp từ các loại mẫu nhƣ rễ, thân, cuống lá, phiến lá và các bộ phận của hoa. - Phát triển gián tiếp từ mô sẹo callus thu đƣợc từ các nguồn mẫu thực vật. Việc lựa chọn loại mẫu và hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng thực vật là hai nhân tố quan trọng nhất trong quá trình phát sinh chồi bất định. Phát triển trực tiếp từ nguồn mẫu thực vật: Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Kantia và cộng sự (2002) đã đƣa ra một quy trình phát sinh chồi bất định có hiệu quả cao từ lá cây hoa cẩm chƣớng Dianthus chinensis đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung BAP (13,2 µM) kết hợp với NAA (7,35 µM) [19]. Tác giả Martin và cộng sự (2003) đã tái sinh trực tiếp chồi từ phiến lá của hai giống hoa hồng môn (Anthurium andraeanum) cắt cành, hiệu quả tái sinh chồi cao nhất là 67% từ lá với hệ số đạt 7 chồi/mẫu [27]. Nhóm nghiên cứu của tác giả Chen và cộng sự (2004) cũng phát triển một quy trình nhân giống hiệu suất tái sinh trực tiếp chồi từ lá của cây lan Paphiopedilum. Ba công thức nghiên cứu (2,4-D 4,52 µM; TDZ 22,71 µM và 2,4-D (4,52 µM) kết hợp TDZ (4,54 µM)) đã cho số chồi trung bình/mẫu cao từ mẫu lá [7]. Nhóm nghiên cứu Waseem và cộng sự (2009) đã chứng minh ảnh hƣởng của các loại auxin đến khả năng tái sinh chồi bất định trực tiếp từ mảnh lá của cây hoa cúc [35]. Quá trình phát sinh cơ quan đã đƣợc thực nghiệm trên một 15 số loại cây cảnh, ví dụ các tế bào sôma của cây thuốc lá cảnh [8], cây san hô xanh (Euphorbia tirucalli) [14], cây Hygrophila polysperma [22]. - Phát triển gián tiếp thông qua mô callus Tác giả Kantia và Kithari (2002) đã nghiên cứu quá trình hình thành chồi bất định trên môi trƣờng MS có bổ sung BAP (2,2 µM) và 2,4-D (4,87 µM) từ mô sẹo callus đƣợc hình thành nhiều trên bề mặt lá của loài cẩm chƣớng Dianthus chinesis [19]. Nhóm nghiên cứu Smaranda (2005) đã thực hiện quá trình vi nhân giống gián tiếp của cây hoa cúc thông quá nuôi cấy callus thu đƣợc từ các đốt thân [31]. Kaviani và cộng sự (2011) đã hoàn chỉnh một quy trình cảm ứng hình thành callus và hình thành chồi và rễ từ mẫu lá ở cây Matthiola incana [23]. - Phát sinh phôi sôma Sự hình thành cấu trúc lƣỡng cực chứa cả mô phân sinh chồi và mô phân sinh rễ tƣơng tự nhƣ quá trình phát triển phôi hữu tính (đƣợc hình thành từ hợp tử). Các thể phôi này có thể phát triển thành thực vật đủ chức năng dƣới điều kiện thích hợp. Theo nhóm nghiên cứu Tanaka (2004), sự phát sinh phôi sôma cao nhất từ mẫu lá của cây hoa cúc (Dendranthema grandiflorum) trên môi trƣờng MS có chứa IAA (57,08 mM) + kinetin (0,465 mM) [33]. Phôi đƣợc phát sinh trên môi trƣờng không chứa kinetin. Tác giả Kumar và cộng sự (2002) đã thông báo rằng sốc nhiệt cảm ứng quá trình phát sinh phôi sôma ở mô sẹo callus đƣợc nuôi cấy và tái sinh cây từ callus nuôi cấy ở một số loài Tricyrtis [25]. Tác giả Datta và cộng sự (2001) đã phát sinh trực tiếp phôi sôma từ mẫu là các cánh hoa hình tia ở chi hoa cúc trên môi trƣờng MS có bổ sung 2,4 - D và BAP [9]. 16 1.4. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẨM CHƢỚNG Nhóm nghiên cứu Brar và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của TDZ và BAP đến quá trình tạo đa chồi từ chồi bên ở các giống cẩm chƣớng khác nhau (Dianthus caryophyllus) [6]. Số chồi đƣợc tạo ra phụ thuộc vào bản chất và nồng độ của cytokinin đƣợc sử dụng. Giống cẩm chƣớng Barlo II Nora có số chồi cao nhất trên môi trƣờng MS bổ sung BAP nồng độ 8,8 µM BAP. Với kết quả tƣơng tự, nhóm nghiên cứu của tác giả Ali và cộng sự (2008) cho rằng môi trƣờng MS bổ sung BAP 4,4 µM có hiệu quả tạo đa chồi lớn nhất từ nguồn mẫu là mô phân sinh đỉnh chồi sau 7 ngày nuôi cấy [3]. Nhóm nghiên cứu của Kharrazi và cộng sự (2011) đã đánh giá ảnh hƣởng các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đến quá trình tạo đa chồi từ chồi bên ở cây hoa cẩm chƣớng, kết quả là trên môi trƣờng có bổ sung BAP 4,4 µM + NAA 1,47 µM cho số chồi/mẫu cao nhất, đạt 5 chồi/mẫu [24]. Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Altvorst và cộng sự (1992) đã hoàn chỉnh quy trình phát sinh chồi bất định từ mẫu lá in vitro của cây hoa cẩm chƣớng. Số chồi bất định cao nhất trên môi trƣờng chứa BAP 4,4 µM và NAA 2,205 µM [4]. Tác giả Watad và cộng sự (1996) đã đƣa ra phƣơng pháp tái sinh cây cẩm chƣớng hoàn chỉnh trên môi trƣờng có bổ sung TDZ (4 mg/l) và NAA (7,35 µM) [36]. Nhóm nghiên cứu Arici và cộng sự (2009) đã phát triển một quy trình để vi nhân giống in vitro cây hoa cẩm chƣớng, hệ số tái sinh chồi tốt nhất trên môi trƣờng có bổ sung BAP 4,4 µM và NAA 0,36 µM [5]. Kanwar và Kumar (2009) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của các loại chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, nguồn mẫu và tƣơng tác giữa chúng lên quá trình hình thành chồi in vitro từ callus của cây hoa cẩm chƣớng, đã có trên 27 loại môi trƣờng nuôi cấy đã đƣợc nghiên cứu, chỉ môi trƣờng chứa riêng lẻ 17 TDZ 2 mg/l và zeatin hoặc kết hợp giữa TDZ hoặc zeatin với NAA với sự có mặt của IAA mới có khả năng biệt hóa các cụm callus, trong đó, môi trƣờng có bổ sung TDZ 2 mg/l kết hợp IAA 4,8 µM cho hệ số tái sinh chồi cao nhất từ mô sẹo callus [20]. Một quy trình hiệu quả đã đƣợc phát triển và hoàn thiện để tái sinh cây hoàn chỉnh thông qua phát sinh phôi sôma ở cây hoa cẩm chƣơng từ nụ hoa đã cảm ứng thành callus [26]. Năm 2006, tác giả Karami và cộng sự đã nghiên cứu một phƣơng pháp hiệu quả để phát sinh phôi sôma ở cây hoa cẩm chƣớng và nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng saccarozơ đến quá trình này. Tỷ lệ cao nhất phát sinh phôi sôma là môi trƣờng có bổ sung đƣờng saccarozơ ở 9% và 12% có bổ sung 2,4-D 9 µM và BAP 0,8 µM [21]. Tác giả Iantcheva và cộng sự (2008) đã công bố quá trình phát sinh phôi sôma từ mẫu lá của cây hoa cẩm chƣớng. Phôi sôma khỏe thu đƣợc trên môi trƣờng hình thành phôi có bổ sung BAP 2,2 µM và casein hydrolysate 250mg/l ở cây hoa cẩm chƣớng [17]. Kết quả tƣơng tự vậy, tác giả Frey và cộng sự (1991) đã phát triển quy trình tối ƣu để cảm ứng quá trình phát sinh phôi sôma từ callus trên môi trƣờng MS có bổ sung 2,4-D 3,0 µM [11]. 18 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Mẫu vật Hoa cẩm chƣớng đơn Mix (Dianthus carryophyllus) đƣợc chọn làm vật liệu thí nghiệm và do Phòng Sinh lý thực vật (Khoa Sinh-KTNN, ĐHSPHN 2) cung cấp. 2.1.2. Thời gian và địa điểm thực hiện Đề tài nghiên cứu đƣợc thực hiện tại Phòng Sinh lý thực vật trƣờng ĐHSPHN 2 từ tháng 11-2013 đến tháng 9-2014. 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 2.1.3.1. Thiết bị Bảng 2.1: Danh mục thiết bị thí nghiệm. Tên thiết bị Hãng sản xuất Cân kĩ thuật GM612, Đức Máy đo pH HM30G/TOA, Đức Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAYAMA, Nhật Tủ lạnh Hitachi 31AG5D, Thái lan Máy cất nƣớc hai lần Trung Quốc Buồng cấy vô trùng AV – 110/TELSTAR Máy khuấy từ gia nhiệt ARE/VELP, Italia Cân phân tích CP224S, Đức Tủ ấm UNIVERSAL 320R/ HETTICH, Đức 2.1.3.2. Dụng cụ Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, vỉ xốp nuôi cấy,… 19 2.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy Các nghiên cứu in vitro thƣờng sử dụng môi trƣờng nuôi cấy cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) MS + 30g saccarozơ+ 7,5 g agar + các chất điều hòa sinh trƣởng. Môi trƣờng thạch đƣợc đựng trong bình thủy tinh hoặc túi nilon. pH môi trƣờng: 5,8. Môi trƣờng đƣợc khử trùng trong nồi vô trùng ở 117oC với thời gian 15 phút. 2.1.5: Điều kiện nuôi cấy Toàn bộ các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện nhân tạo. Cƣờng độ ánh sáng: 1500-2000 lux. Thời gian chiếu sáng theo chu kỳ: 12 giờ/ ngày. Nhiệt độ: 27oC. Độ ẩm : 60-70%. 2.2 .PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phƣơng pháp khử trùng Ngoài tủ cấy vô trùng: Từ đoạn thân cây hoa, cắt thành đoạn 3-4 cm bao gồm cả chồi nách. Sau đó, lau sạch bằng cồn, rửa bằng nƣớc rửa bát, cho chảy dƣới vòi nƣớc sạch. Trong tủ cấy vô trùng: + Chuẩn bị: nƣớc cất, bình đựng, Fancol 50ml, giấy thấm đã khử trùng. + Làm sạch mẫu: Rửa lại bằng nƣớc cất, lắc cồn 70o trong 2 phút khử trùng sơ bộ. Sau đó rửa lại từ 3-5 lần bằng nƣớc cất vô trùng và đặt lên môi trƣờng MS đựng sẵn trong bình tam giác. 20 2.2.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Giai đoạn vật liệu khởi đầu - Mục đích: Tạo đƣợc mẫu sạch in vitro. - Mẫu vật: Cây cẩm chƣớng chăm sóc , sàng lọc ở trong Phòng Sinh lý thực vật (ĐHSPHN 2) cao khoảng 15-20 cm, sau đó cắt những đoạn thân dài 3-5 cm. - Phƣơng pháp tiến hành: Theo các công thức bảng 2.2. - Môi trƣờng nuôi cấy: MS + 3% sacarozơ + 7,5 g agar, pH 5,8. - Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại đƣợc thực hiện ở các công thức trong bảng 2.2. Bảng 2.2: Các công thức thí nghiệm xác đinh hiệu quả của chất khử trùng. Công Chất xử lý/thời gian thức ĐC Xử lý sơ bộ CT1 Xử lý sơ bộ + Javel 5% (v/v)/5 phút CT2 Xử lý sơ bộ + Javel 5% (v/v)/10 phút CT3 Xử lý sơ bộ + Javel 5% (v/v)/15 phút CT4 Xử lý sơ bộ + Javel 10% (v/v)/5 phút CT5 Xử lý sơ bộ + Javel 10% (v/v)/10 phút CT6 Xử lý sơ bộ + Javel 10% (v/v)/15 phút CT7 Xử lý sơ bộ + Javel 15% (v/v)/5 phút CT8 Xử lý sơ bộ + Javel 15% (v/v)/10 phút CT9 Xử lý sơ bộ + Javel 15% (v/v)/15 phút - Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu sạch , tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống , tỷ lệ mẫu chết sau 7 ngày theo dõi. 21 + Tỷ lệ mẫu sạch (mẫu vô trùng): ô + Tỷ lệ mẫu nhiễm: + Tỷ lệ mẫu vô trùng nhƣng chết: Thí nghiệm 2: Giai đoạn tái sinh và nhân nhanh cẩm chướng thông qua sự phát triển của chồi chính và chồi nách - Mục đích: Tìm ra nồng độ BAP thích hợp cho sự phát triển chồi ngủ. - Mẫu vật: Vật liệu khởi đầu đã có sẵn. - Phƣơng pháp tiến hành: Từ vật liệu khởi đầu cắt những đoạn dài khoảng 1-2 cm, nuôi cấy trên môi trƣờng nghiên cứu theo bảng 2.3. - Môi trƣờng: MS cơ bản( 3% sacarozơ+ 7,5 g agar, pH5,8) bổ sung BAP có nồng độ thay đổi 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg.L-1. Điều kiện chiếu sáng 2000 lux, chu kỳ 12 giờ/ngày, độ ẩm 70%. Thí nghiệm đƣợc tiến hành ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, yếu tố ngoại cảnh gần nhƣ tƣơng đối theo các công thức trong bảng 2.3. 22 Bảng 2.3: Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự tái sinh chồi. Công thức Nồng độ BAP (mg/l) CT1 0,0 mg/l CT2 0,5 mg/l CT3 1,0 mg/l CT4 1,5 mg/l CT5 2,0 mg/l - Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi/mẫu, chiều cao chồi trong 4 tuần sau nuôi cấy. 23 Thí nghiệm 3: Giai đoạn ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh - Mục đích: Tạo rễ hoàn chỉnh cây in vitro ở nồng độ tối ƣu nhất. - Mẫu vật: Chồi in vitro có sẵn. - Phƣơng pháp tiến hành: Lấy chồi in vitro những đoạn dài 2-3 cm, kích thƣớc tƣơng đối nhau, nuôi cấy trong môi trƣờng đã nghiên cứu MS cơ bản+ 3% saccarrozơ+ 7,5g agar, pH 5,8, bổ sung α-NAA ở những nồng độ khác nhau theo bảng 2.4. Bảng 2.4: Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến sự tạo rễ của cây . Công thức Nồng độ α-NAA (mg/l) CT1 0,0 mg/l CT2 0,1 mg/l CT3 0,2 mg/l CT4 0,3 mg/l CT5 0,4 mg/l - Chỉ tiêu theo dõi: Ngày ra rễ, số rễ, chiều dài rễ sau 7 ngày nuôi cấy. 24 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro - Mục đích: Ảnh hƣởng của nồng độ nƣớc dừa đến chỉ tiêu sinh trƣởng của cây. - Mẫu vật: Chồi in vitro có chiều dài 1-2 cm. - Phƣơng pháp tiến hành: Từ nguyên liệu nuôi cấy trong môi trƣờng MS cơ bản+ 3% sacarozơ+ 7,5g agar, pH 5,8, bổ sung nƣớc dừa ở các nồng độ khác nhau theo công thức trong bảng 2.5. Bảng 2.5: Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa cẩm chướng đơn giống Mix. Nồng độ nƣớc dừa (% Công thức v/v) CT1 0 CT2 10 CT3 15 CT4 20 CT5 25 - Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây (cm), số chồi/mẫu, số rễ/mẫu, khối lƣợng tƣơi của cụm chồi (gam) ở các thời điểm 3, 6 và 9 tuần nuôi cấy. 25 Thí nghiệm 5: Rèn luyện cây thích nghi với môi trường - Mục đích: Tìm ra giá thể thích hợp nhất đƣa cây rèn luyện thích nghi với môi trƣờng tự nhiên. - Nguyên liệu: Cây con in vitro trong ống nghiệm có chiều cao 2-3 cm. - Phƣơng pháp nghiên cứu: Lấy cây con in vitro trong ống nghiệm, rửa sạch agar sau đó ƣơm trong các giá thể nghiên cứu theo các công thức trong bảng 2.6. Bảng 2.6: Công thức nghiên cứu sự thích nghi của cây in vitro qua các giá thể. Công thức Giá thể CT1 Xơ dừa CT2 Trấu hun CT3 Cát sạch CT4 Xơ dừa+ trấu hun CT5 Cát sạch + đất phù sa - Chỉ tiêu theo dõi: số cây sống sót qua 4 tuần chăm sóc. + Tỷ lệ % số cây sống sót 26 Thí nghiệm 6: Khảo sát sinh trưởng và phát triển của cây cẩm chướng được giống in vitro ngoài điều kiện tự nhiên. - Mục đích: Đánh giá về hình thái, sinh trƣởng, màu sắc hoa, kích thƣớc hoa của cây in vitro so với cây tự nhiên. - Nguyên liệu: Cây thích nghi với điều kiện môi trƣờng đƣợc trồng trong Vƣờn thực nghiệm, Khoa Sinh-KTNN, ĐHSPHN 2. 2.2.3. Phƣơng pháp phân tích số liệu Các số liệu thực nghiệm đƣợc xử lý theo chƣơng trình Excel 2007 với tham số thống kê: Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ tin cậy (α=0,05) theo Nguyễn Văn Mã và cộng sự (2013). 27 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU Tạo vật liệu khởi đầu cho các nghiên cứu in vitro đóng vai trò rất quan trọng, quyết định tới các nghiên cứu tiếp theo. Mẫu thực vật ngoài tự nhiên thƣờng nhiễm rất nhiều loại vi sinh vật, phổ biến nhất là vi khuẩn (khoảng 75% vi khuẩn Gram dƣơng, còn lại là vi khuẩn Gram âm), nấm, nấm men, vé bét cỡ nhỏ… chúng gây ảnh hƣởng tới sinh trƣởng của mẫu in vitro (Leifert C et al, 1991). Có rất nhiều tác nhân đƣợc sử dụng để tiêu diệt nguồn bệnh này nhƣ HgCl2, javel, kháng sinh… Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào bản chất của tác nhân khử trùng, thời gian phơi nhiễm với các tác nhân khử trùng và tuổi mẫu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng dung dịch javel để khử trùng đốt thân của cây hoa cẩm chƣớng đơn. Sau khi khử trùng sơ bộ, mẫu sẽ đƣợc lắc trong dung dịch javel với các nồng độ và thời gian khác nhau. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1. 28 Bảng 3.1: Hiệu quả khử trùng bề mặt của dung dịch javel đến tạo vật liệu in vitro. Công thức Số mẫu ban đầu Mẫu sạch Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu sống (%) chết (%) nhiễm (%) CT1 30 23,3 16,7 60,0 CT2 30 43,4 20,0 36,7 CT3 30 73,4 16,7 10,0 CT4 30 46,7 26,7 26,6 CT5 30 46,6 23,4 30,0 CT6 30 33,3 40,0 26,7 CT7 30 20,0 53,3 26,7 CT8 30 16,7 73,4 10,0 CT9 30 13,3 86,7 0,0 29 Tỷ lệ mẫu sạch sống % 100 Tỷ lệ mẫu sạch chết 90 Tỷ lệ mẫu nhiễm 80 70 60 50 40 30 20 10 0 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 Công thức Hình 3.1: Ảnh hƣởng của nồng độ khử trùng đến tạo vật liệu in vitro. Từ bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy: Hiệu quả khử trùng của javel đối với đốt thân cẩm chƣớng đơn dao động trong khoảng 5%-10 phút đến 10%-10 phút. Công thức sử dụng javel 5% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch-sống cao nhất, đạt 73,4%. Trong khi đó, sử dụng dung dịch javel cao đến 15% thƣờng cho số mẫu sạch cao, tuy nhiên số mẫu sống lại giảm. Còn khi sử dụng javel ở nồng độ thấp (5%) và thời gian xử lý ngắn (5 phút) cho thấy ít hiệu quả, tỷ lệ mẫu nhiễm cao. Vậy, nồng độ javel thích hợp nhất để tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân cẩm chƣớng đơn là 5% trong 15 phút, mẫu sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng vô trùng sau 7 ngày xử lý. 30 Hình 3.2: Mẫu sạch sau 7 ngày. Hình 3.3: Mẫu và chồi in vitro sạch. 31 3.2. GIAI ĐOẠN TÁI SINH VÀ NHÂN NHANH CHỒI THÔNG QUA SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CHỒI NÁCH Việc nhân chồi in vitro có vai trò quan trọng trong việc tạo ra lƣợng lớn cây con in vitro làm nguyên liệu cho các quá trình nhân giống tiếp theo. Đây là quá trình quan trọng và cũng có thể nói đây là nhiệm vụ của nhân giống vô tính. Theo Brar và cộng sự (1996) hiệu quả tạo đa chồi lớn nhất từ nguồn mẫu là mô phân sinh đỉnh chồi sau 7 ngày nuôi cấy và phụ thuộc vào bản chất của loại cytokinin đƣợc sử dụng. …). Cytokinin là nhóm phytohocmon thứ 3 đƣợc tìm thấy năm 1963, nhóm chất có tác dụng hoạt hóa sự phân chia tế bào có ý nghĩa quan trọng trong nuôi cấy mô.Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng BAP, một loại chất điều hòa sinh trƣởng thực vật thuộc nhóm cytokinin để tạo cụm chồi từ đỉnh sinh trƣởng. Sau nghiên cứu thu đƣợc bảng 3.2. Bảng 3.2: Ảnh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh chồi bên của cây cẩm chướng in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy). Nồng độ BAP Số mẫu ban Số chồi thu đầu đƣợc Hệ số nhân ĐC 0,0 mg/l 100 130 1,30 ± 0,22a CT1 0,5 mg/l 100 205 2,05 ± 1,21b CT2 1,0 mg/l 100 610 6,10 ± 1,31c CT3 1,5 mg/l 100 295 2,95 ± 0,76d CT4 2,0 mg/l 100 235 2,35 ± 1,71d *Trong cùng một cột, chữ cái khác nhau (a,b,c,d…) thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05. 32 Hệ số nhân 7 6.1 6 Hệ số nhân 5 4 2.95 3 2.35 2.05 2 1.3 1 0 CT1 CT2 CT3 CT3 CT5 Công thức Hình 3.4: Ảnh hƣởng của BAP đến quá trình tái sinh chồi bên của cây cẩm chƣớng in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy). Phân tích kết quả bảng 3.2 và hình 3.4 cho thấy BAP có ảnh hƣởng tích cực đến sự phát sinh chồi bên của cây hoa cẩm chƣớng in vitro. Cụ thể ở công thức có bổ sung BAP 1,0 mg.L-1 (CT3) cho hệ số nhân cao nhất, đạt 6,10 ± 1,31 trong khi đó hệ số nhân thấp nhất ở công thức đối chứng 1,30 ± 0,22. Các công thức còn lại (môi trƣờng có bổ sung BAP 0,5; 1,5 và 2,0 mg.L-1) cho hệ số nhân dao động trong khoảng từ 2,05 đến 2,95. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của tác giả Ali và cộng sự (2008) khi nhân nhanh cẩm chƣớng thì môi trƣờng MS có bổ sung BAP nồng độ 4,4 µM (1 mg.L-1 ) cho hệ số nhân cao nhất. Kết của nghiên cứu này cũng cho thấy với nồng độ BAP đƣợc sử dụng là 1 mg.L-1 cho hệ số nhân cao hơn so với nghiên cứu của nhóm tác giả Kharrazi và cộng sự (2011) cũng trên đối tƣợng cây hoa cẩm chƣớng có hệ số nhân là 5,0 chồi/mẫu. 33 Hình 3. 5: Sự tạo chồi dƣới ảnh hƣởng của BAP. 34 Hình 3.6: Lá cẩm chƣớng Hình 3.7: Chồi nách hoa cẩm đơn trong môi trƣờng BAP 1 mg/l chƣớng đơn trong môi trƣờng (4 tuần nuôi cấy). BAP 1 mg/l (4 tuần nuôi cấy). 3.3. RA RỄ TẠO CÂY CẨM CHƢỚNG IN VITRO HOÀN CHỈNH. Rễ là bộ phận thiết yếu của cây. Nó có tác dụng hút nƣớc, muối khoáng và chất dinh dƣỡng để thực hiện các quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây. Sự hình thành rễ bất định là một bƣớc quan trọng trong vi nhân giống. Một công thức nghiên cứu sự hình thành rễ bất định tốt là công thức cho phần trăm số mẫu hình thành rễ cao và có hệ thống rễ tốt, ngoài ra còn số rễ/chồi, chiều dài rễ và không có mô sẹo hình thành, giúp cây in vitro hoàn chỉnh có thể sinh trƣởng tốt khi đƣợc trồng ra đất. Để kích thích tạo rễ cho chồi (đốt thân), các auxin thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ IAA (Idol acetic acid), IBA (Idol butyric acid), NAA (Naphthalen acetic acid)... Trong đó, NAA là chất đƣợc 35 sử dụng phổ biến để tạo rễ ở cả nghiên cứu ex vitro và in vitro, do α-NAA là một chất rất ổn định (Dunlap, Kresovich, McGee, 1986). Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng NAA để kích thích tạo rễ cho chồi cẩm chƣớng in vitro. Bảng 3.3: Ảnh hưởng của α-NAA đến quá trình tạo rễ cây cẩm chướng Mix (sau 7 ngày nuôi cấy). Nồng độ αNAA (mg.L-1) Số mẫu Số rễ/mẫu TN Chiều dài rễ (cm) Tỷ lệ ra rễ (%) ĐC 0,0 100 3,75 ± 0,98a 2,34 ± 0,17a 42 CT 1 0,1 100 11, 46 ± 2,01a 5,83 ± 1,77b 100 CT 2 0,2 100 12,02 ± 1,28a 6,70 ± 1,79b 100 CT 3 0,3 100 6,34 ± 1,22b 1,70 ± 0,57c 65 CT 4 0,4 100 3,45 ± 1,18c 0,27 ± 0,11d 47 *Trong cùng một cột, chữ cái khác nhau (a,b,c,d…) thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05. 36 Số lƣợng 14 11.46 12 12.02 10 Số rễ/mẫu 8 6.34 6 3.75 4 3.45 2 0 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Công thức Hình 3.8: Ảnh hƣởng α-NAA đến sự hình thành số lƣợng rễ của cây. 8 cm 6.7 7 5.83 6 Chiều dài rễ(cm) 5 4 3 2.34 1.7 2 1 0.27 0 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Công thức Hình 3.9: Ảnh hƣởng của α-NAA đến chiều dài rễ của cây. 37 Phân tích kết quả cho thấy, α-NAA có tác dụng kích thích sự ra rễ ở chồi cẩm chƣớng in vitro. Môi trƣờng MS có bổ sung NAA nồng độ 0,1 và 0,2 (mg.L-1) cho kết quả tốt nhất về số rễ/mẫu, đạt lần lƣợt là 11,46 và 12,02 (Hình 3.8) và chiều dài rễ đạt lần lƣợt là 5,83 cm và 6,70 cm (Hình 3.9), trong khi đó môi trƣờng có bổ sung α-NAA có nồng độ cao hơn CT3 và CT4 (0,3 và 0,4 mg.L-1) thì số rễ lại giảm, chỉ đạt 6,34 và 3,45 và chiều dài rễ cũng giảm theo, chỉ đạt 1,70 cm và 0,27 cm. Ở công thức đối chứng, rễ xuất hiện muộn hơn và sinh trƣởng chậm hơn so với các công thức nghiên cứu. Auxin đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng hình thành rễ (Frooq, 2008). Theo tác giả Salehi (2008), sự ra rễ in vitro của cẩm chƣớng phụ thuộc vào loại chất điều hòa sinh trƣởng thực vật và kiểu gen, không có môi trƣờng ra rễ in vitro chung cho tất cả các giống cẩm chƣớng. Theo tác giả Ali và cộng sự (2008), NAA ở nồng độ 1 mg.L-1 bổ sung vào môi trƣờng MS là phù hợp nhất cho quá trình ra rễ. Tuy nhiên, ở nghiên cứu của chúng tôi, nồng độ α-NAA bổ sung thấp hơn rất nhiều, dao động trong khoảng 0,1-0,2 mg.L-1, liên quan đến kiểu gen của cẩm chƣớng đơn giống Mix. ĐC 38 1 2 3 4 Hình 3.10: Ảnh hƣởng α-NAA ở các công thức khác nhau trong nghiên cứu. ĐC- Sự phát triển của rễ ở môi trƣờng MS. 1- Sự phát triển của rễ ở nồng độ α-NAA 0,1 mg/l. 2- Sự phát triển của rễ ở nồng độ α-NAA 0,2 mg/l. 3- Sự phát triển của rễ ở nồng độ α-NAA 0,3 mg/l. 4- Sự phát triển của rễ ở nồng độ α-NAA 0,4 mg/l. 39 Hình 3.11: Rễ ở nồng độ α-NAA 0,2 mg/l (sau 7 ngày nuôi cấy) Hình 3.12: Chiều dài rễ ở nồng độ α-NAA 0,2 mg/l (sau 7 ngày nuôi cấy). 40 3.4. ẢNH HƢỞNG CỦA NƢỚC DỪA ĐẾN SINH TRƢỞNG PHÁT TRIỂN CỦA CÂY. Nhiều nghiên cứu về sinh trƣởng, phát sinh hình thái in vitro của thực vật có sử dụng nƣớc dừa bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy cho kết quả tốt, do trong nƣớc dừa có chứa các axit amin, vitamin, khoáng chất và các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật nhƣ auxin và cytokinin, giúp kích thích sự phát triển của thực vật (George và Sherrington, 1984). Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát ảnh hƣởng của nƣớc dừa bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy MS đến sinh trƣởng của cây hoa cẩm chƣớng giống Mix in vitro. Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro Nồng độ nƣớc dừa bổ sung CT 1 CT 2 0% 5% Thời KL tƣơi gian Chiều cao Số nuôi cấy chồi (cm) chồi/mẫu 3 2,83±0,57 1,33±0,27 1,50±0,03 0,11±0,01 6 4,50±0,50 1,50±0,30 4,17±0,97 0,24±0,03 9 6,33±0,07 1,6±0,30 5,75±0,92 0,50±0,06 3 4,42±0,24 3,67±0,17 5,00±0,12 0,17±0,01 Số rễ/mẫu cụm chồi (tuần) 41 (g) của CT 3 CT 4 CT 5 0% 20% 25% 6 7,25±0,28 5,00±0,08 8,67±1,67 0,38±0,08 9 9,17±0,47 11,6±0,53 14,25±1,10 1,09±0,05 3 3,75±0,08 4,00±0,18 5,00±1,25 0,19±0,03 6 7,83±0,37 4,50±0,17 9,00±1,21 0,24±0,03 9 9,50±0,31 12,00±0,35 8,25±1,02 1,08±0,08 3 3,67±0,87 4,83±0,57 5,67±0,27 0,33±0,02 6 5,17±0,27 13,00±0,04 11,20±0,22 0,62±0,06 9 10,00±1,08 13,2±1,17 8,50±0,13 1,54±0,12 3 4,08±1,74 4,17±1,97 0,17±0,04 0,19±0,06 6 6,50±0,60 6,17±1,97 6,50±0,17 0,52±0,01 9 9,75±2,58 16,6±1,03 6,50±0,33 1,75±0,05 42 . cm 12 10 CT1 8 CT2 CT3 6 CT4 CT5 4 2 0 3 tuần 6 tuần 9 tuần Thời gian Hình 3.13: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự phát triển chồi của cây. Số lƣợng chồi/mẫu 18 16 14 CT1 12 CT2 10 CT3 8 CT4 6 CT5 4 2 0 3 tuần 6 tuần 9 tuần Thời gian Hình 3.14: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự tạo chồi. 43 Số lƣợng rễ/mẫu 16 14 12 CT1 10 CT2 CT3 8 CT4 CT5 6 4 2 0 3 tuần 6 tuần Thời gian 9 tuần Hình 3.15: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến sự tạo rễ. gam 2 1.8 CT1 1.6 CT2 1.4 CT3 1.2 CT4 1 CT5 0.8 0.6 0.4 0.2 0 3 tuần 6 tuần 9 tuần Thời gian Hình 3.16: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến trọng lƣợng tƣơi. 44 Phân tích bảng 3.4 cho thấy nƣớc dừa bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy làm tăng một số chỉ tiêu ở chồi cẩm chƣớng đơn in vitro. Mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào nồng độ và thời gian nuôi cấy. Sau 9 tuần nuôi cấy, môi trƣờng bổ sung nƣớc dừa từ 5-25% đều cho kết quả về chiều cao của chồi và số chồi/mẫu tốt. Cụ thể, chiều cao chồi dao động từ 9,17 cm ở CT 2 đến 10,00 cm ở CT4, trong khi đối chứng chỉ đạt 6,55 cm (Hình 3.13). Số chồi/mẫu cũng dao động từ 11,6 (CT 1)-16,6 (CT4) (Hình 3.14). Tuy nhiên, số rễ hình thành lại cho kết quả ngƣợc lại, cao nhất ở CT1 có 14,25. Các công thức còn lại (kể cả đối chứng) dao động từ 5,75 (CT1-ĐC) đến 8,50 (Hình 3.15). Khối lƣợng tƣơi của cụm chồi cũng tăng lên khi cụm chồi sinh trƣởng trong môi trƣờng có bổ sung nƣớc dừa, tốt nhất ở CT 4 và CT 5, khối lƣợng tƣơi của cụm đạt 1,54 g và 1,75 g. Ở CT 2 và CT 3 đạt lần lƣợt là 1,09 g và 1,08 g. CT1 (ĐC) chỉ đạt 0,50 g (Hình 3.16). Hình 3.17: Chiều cao cây nuôi cấy trong môi trƣờng MS đối chứng sau 6 tuần. 45 Hình 3.18: Chiều cao cây nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc dừa 5% - 6 tuần. Hình 3.19: Chiều cao cây nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc dừa 25% - 6 tuần. 46 Hình 3.20: Khối lƣợng tƣơi cây cẩm Hình 3.21: Khối lƣợng tƣơi cây chƣớng ở môi trƣờng MS - 9 tuần. cẩm chƣớng ở nƣớc dừa 5% - 9 tuần. Hình 3.22: Khối lƣợng tƣơi cây cẩm chƣớng ở nƣớc dừa 25% - 9 tuần. 47 3.5. RÈN LUYỆN CÂY THÍCH NGHI VỚI MÔI TRƢỜNG VÀ KHẢO SÁT SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY HOA CẨM CHƢỚNG ĐƢỢC GIỐNG IN VITRO NGOÀI ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN. Đƣa cây ra giá thể là giai đơạn cuối cùng của quá trình nhân giống trong giai đoạn này đƣa cây từ môi trƣờng nhân tạo ra môi trƣờng tự nhiên việc lựa chọn giá thể phù hợp với sự sinh trƣởng là rất quan trọng. Mỗi giá thể có đặc tính khác nhau. Mỗi loại cây trồng ở giai đoạn này phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh khác nhau. Nhìn tổng quan thì giá thể tốt là giá thể có độ ẩm tốt, thoát nƣớc tốt và có khả năng cung cấp chất dinh dƣỡng cho cây trong giai đoạn thích ứng với môi trƣờng tự nhiên. Vì vậy , cần có giá thể phù hợp với sự phát triển của cây trong giai đoạn này. Sự ảnh hƣởng của giá thể nghiên cứu thể hiện trong bảng 3.5. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trong vườn ươm. Số Số cây Tỷ lệ sống mẫu sống (%) 100% xơ dừa 100 75 75,0 Xơ dừa:Trấu hun (1:1) 100 80 80,0 100% trấu hun 100 82 82,0 100% cát sạch 100 91 91,0 Cát sạch: Đất phù sa(1:1) 100 88 88,0 Loại giá thể 48 % Tỷ lệ sống (%) 100 91 90 80 80 88 82 75 70 60 50 40 30 20 10 0 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Công thức Hình 3.23: Ảnh hƣởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trong vƣờn ƣơm. Kết quả theo dõi tỷ lệ cây thích nghi với môi trƣờng tự nhiên sau 4 tuần cho thấy hầu hết các giá thể đƣợc nghiên cứu đều cho tỷ lệ cây sống cao, dao động từ 75-91%. Trong đó tốt nhất là ở CT sử dụng 100% cát sạch, cho tỷ lệ sống đến 91% (Hình 3.23). Cây sau khi đƣợc rèn luyện thích nghi tiếp tục đƣợc đƣa ra nhà lƣới để trồng, theo dõi các đặc điểm về hình thái, sinh trƣởng và phát triển, kết quả cho thấy cây sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng, không có biến dị về hình thái, hoa có màu sắc đẹp so với cây mẹ ban đầu. 49 Hình 3.24: Một số hình ảnh rèn luyện cây thích nghi với môi trƣờng tự nhiên. 50 PHỤ LỤC ẢNH Hoa cẩm chƣớng sau khi ra Cắt mẫu trong buồng cấy vô vƣờn ƣơm. trùng. Pha môi trƣờng nuôi cấy. Kiểm tra mẫu trên dàn cây. Dàn cây nuôi cấy. 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Từ kết quả nghiên cứu chúng tôi đƣa ra kết luận sau: + Khử trùng sơ đốt thân cẩm chƣớng trong dung dịch javien 5% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch cao nhất. + Nồng độ BAP 1mg/l cho hệ số chồi là tốt nhất. + Cây con hoàn chỉnh tạo ra ở môi trƣờng cơ bản có bổ sung α-NAA 0,2 mg/l cho hiệu quả tốt. + Sự ảnh hƣởng của nƣớc dừa ở nồng độ khác nhau là khác nhau đối với từng chỉ tiêu sinh trƣởng. + Cát sạch cho thấy là giá thể giúp cây non thích nghi tốt ở giai đoạn đƣa ra vƣờn ƣơm. 2. Kiến nghị Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu trong thời gian thực tập chúng tôi có những kiến nghị sau: + Tiếp tục nghiên cứu phƣơng pháp khử trùng mẫu với các hóa chất khác và trên nhiều bộ phận khác. + Tiếp tục nghiên cứu cải tiến, hoàn thiện môi trƣờng nhân giống in vitro cây cẩm chƣớng đơn giống Mix để đạt hiệu quả cao nhất. + Thực hiện hợp tác với các Sở Khoa học Công nghệ, các trung tâm giống cây trồng để chuyển giao công nghệ. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013). Phƣơng pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật. Nxb ĐHQG Hà Nội. 2. Quyết định số 1251/QĐ-SNN ngày 13/12/2012 V/v Ban hành tạm thời quy trình canh tác một số loại cây trồng trên địa bàn tỉnh Lâm Đồng. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 3. Ali A, Afrasiab H, Naz H, Rauf M, Iqbal J (2008). “An efficient protocol for in vitro propagation of carnation (Dianthus caryophyllus)”. Pak. J. Bot. 40(1): 111-121. 4. Altvorst V, Koehorst H, Bruinsma T, Dons J (1994). “Improvement of adventitious shoot formation from Carnation leaf explants”. Plant cell and tissue organ culture. 37:87- 90. 5. Arici S.E, Koc N.K (2009). “Regeneration and agrobacteriummediated transformation studies in carnation(Dianthus caryophyllus L. cv. Turbo)”. African Journal of Biotechnology. 8 (22):6094-6100. 6. Brar M (1996). “Effect of Thidiazuron and Benzylaminopurine on in vitro shoot proliferation of carnation (Dianthus caryophyllus L.)”. In vitro. 31 (3, Part 2): 61A. 7. Chen T, Tsung J, Chang W (2004). “Plant regeneration through direct shoot bud formation from leaf cultures of Paphiopedilum orchids”. Plant cell Tissue and Organ Culture. 76:11-15. 8. Colijin C, Kool A, Nikamp H (1979). “Induction of root and shoot formation from root meristems and shoot tips of Petunia hybrid”. Protoplasma. 99:335-340. 53 9. Datta S.K, Chakrabarty D, Saxena M, Mandal A.K.A, Biswas A.K (2001). “Direct shoot regeneration from florets of chrysanthemum cultivars”. Indian Journal of Genetics. 61:373-376. 10. Emek Y, Erdag B (2007). “In vitro propagation of Gladiolus anatolicus (boiss.) stapf”. Pak. J. Bot.39(1):23-30. 11. Frey L, Janick J (1991). “Organogenesis in Carnation”. J. Amer Soc. Hort. Sci. 116(6): 1108-1112. 12. Getu M (2009). “Ethiopia floriculture and its impact on the environment. Regulations, Supervision and Compliance”. Mizan Law Rev. 3(2):242. 13. Gow W.P, Chen J.T, Chang W.C (2008). “Influence of growth regulators on direct embryo formation from leaf explants of Phalaenopsis orchids”. Acta Physiol.Plantarum 30:507-512. 14. Guohua M, Jaime A, Teixeira S, Wu G (2011). “Direct adventitious shoot formation from apical shoot explants of Euphorbia tirucalli”. J Plant Growth Regul. 30:114-116. 15. Haouala F, Salhi I (2012). “Axillary budding and rooting of Gladiolus (Gladiolus grandiflorus Hort.) in salt stress conditions”. Afr. J. Hort. Sci. 6:101-110. 16. Harbaugh D.T, Nepokroeff M, Rabeler R.K, Mc Neill J, Zimmer E.A, Wagner W.L (2009). “A new lineage-based tribal classification of the family Caryophyllaceae”. Int. J. Plant Sci. 171(2):185–198. 17. Iantcheva A, Vlahova M, Atanassova B, Atanassov A (2005). “Plant regeneration via direct organogenesis and somatic embryogenesis of two new Bulgarian spray Carnation cultivars”. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 19(3): 15-19. 54 18. Jain S.M (2002). “Feeding the world with induced mutations and biotechnology”. Proc. Int. Nuclear Conference 2002 – Global trends and Perspectives. Seminar 1: Agriculture and Bioscience. Bangi, Malaysia: MINT; 2002. p.1. 19. Kantia A, Kothari S (2002). “High efficiency adventitious shoot bu formation and plant regeneration from leaf explants of Dianthus chinensis L.”. Scientia Horticulturae. 96:205- 212. 20. Kanwar J.K, Kumar S (2009). “Influence of growth regulators and explants on shoot regeneration in carnation”. Hort. Sci. 36:140-146. 21. Karami O, Deljou A, Kordestani G (2007). “Secondary somatic embryogenesis of Carnation (Dianthus caryophyllus L.)”. Plant Cell Tissue and Organ culture. 92:273-280. 22. Karats M, Aasim M, Cinar A, Dogan M (2013). “Adventitious shoot regeneration from leaf explants of dwarf hygro (Hygrophilis polysperma Roxb.)”. The Scientific World Journal. Nguồn http://www.hindawi.com/journals/tswj/2013/680425/ 23. Kaviani B, Hesar A.A, Kharabian-Masouleh A (2011). “In vitro propagation of Matthiola incana (Brassicaceae) - An ornamental plant”. Plant Omics Journal. 4(7):435-440. 24. Kharrazi M, Nemati H, Tehranifar A, Bagher A, Sharifi A (2011). “In vitro culture of Carnation (Dianthus caryophyllus L.) focusing on the problem of Vitrification”. J. Biol. Eviromental Sciences. 5(13):1-6. 25. Kumar A, Palni L.M, Sood A, Sharma M (2002). “Heat-shock induced somatic embryogenesis in callus cultures of gladiolus in the presence of high sucrose”. J Hortic Sci Biotechol. 77:73-78. 55 26. Lee M.M, Nam K, Kyoung E, Hi S, Park Y (1997). “Biochemical character stics of S-adenosylmethionine decarboxylase from Carnation(Dianthus caryophyllus L.)petals”. J.Plant Biol. 40(2):80-88. 27. Martin K.P, Joseph D, Madassery J, Philip V.J (2003). “Direct shoot regeneration from lamina explants of two commercial cut flower cultivars of Anthurium andraeanum Hort. In Vitro Cellular & Developmental Biologyplant. 39(5):500-504. DOI: 10.1079/IVP2003460. 28. Murashige T, Skoog F (1962). “A revised medium for rapid growth and bioassayswith tobacco tissue cultures”. Plant Physiol. 15:473-497. 29. Nali ni R (2012). “Micropropagation of Chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium) using shoot tip as explants”. Internatioal Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences. 2(2):62-66. 30. Shirdel M, Azar A, Matloobi M, Nahandi F (2012). “Effect of nodal position and growth regulators on in vitro growth of Dog Rose (Rosa canina)”. Journal of Ornamental and horticulture plants. 3(1):9-17. 31. Smaranda V.T (2005). ““In vitro” multiplication of chrysanthemum morifolium ramat”. Scientific Annals of Alexandru Ioan Cuza University of Iasi. New Series, Section 2. Vegetal Biology. 32. Starman T.W, Cerny T.A, MacKenzie A.J (1995). “Productivity and profitability of some field-grown specialty cut flowers”. HortScience. 30:1217-1220. 33. Tanaka Y, Kastumoto Y, Brugliera F, Mason J (2004). Plant Cell Tissue and Organ Culture. 80:1-24. 34. Udom N, Kanchanapoom K, Kamnoon K (2009). “Micropropagation from cultured nodal explants of rose (Rosa hybrid L. cv.Perfume Delight, Songklanakarin”. J. Sci. Technology. 31(6):583-586. 56 35. Waseem K, Khant M, Jaskant Q, Jilani M, Sohail M (2009). “Effect of different auxins on the regeneration capability of Chrysanthemum leaf discs”. International Journal of agriculture and biology. 11(4):468-472. 36. Watad A, Ahroni A, Zuker A, Shejtman H, Nissim A, Vainstein A (1996). “Adventitious shoot formation from carnation stem segments”. Scientia Horticulturae. 65:313-320. 37. Xing W, Bao M, Qin H, Ning G (2010). “Microopropagation of Rosa rugosa through axillary shoot proliferation”. Acta Biologica Cracoviensa Series Botanica. 52(2):69-75. TÀI LIỆU INTERNET 38. www.rauquavietnam.vn 39. Wikipedia (2009). Floral Industry.http://en.wikipedia.org/wiki/Floral_industry. June, 2010). 57 (Accessed 2nd [...]... đang phát triển, nơi có nhân công rẻ Các quy trình vi nhân giống đã đƣợc phát triển trên nhiều đối tƣợng cây cảnh, chẳng hạn nhƣ cây hoa lay ơn [10], [15], hoa hồng [30], [37], hoa cúc [33], [35], hoa cẩm chƣớng [21], [26] và cây hoa lan [7], [13] Quá trình vi nhân giống là một quá trình phức tạp, đƣợc phân chia thành ba nhóm phƣơng pháp chính: 1/ Nhân giống bằng chồi chính hoặc chồi bên 2/ Nhân giống. .. triển quy trình nhân giống in vitro hoa cẩm chƣớng đơn (Dianthus Mix) 2 Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình nhân nhanh giống hoa cẩm chƣớng đơn (Dianthus Mix) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro 3 Nhiệm vụ nghiên cứu - Tạo vật liệu khởi đầu in vitro từ đốt thân của cây cẩm chƣớng ngoài tự nhiên - Tái sinh và nhân nhanh cây hoa cẩm chƣớng thông qua phát triển chồi chính và chồi nách - Tìm hiểu ảnh hƣởng... cây hoa lan [7], [13] Giống hoa cẩm chƣớng Dianthus Mix là một trong những giống hoa đẹp đang đƣợc trồng khá phổ biến ở khu vực Mê Linh – Hà Nội, nhu cầu về giống tốt, sạch bệnh là rất lớn Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu sản xuất thì cần thiết phải có một qui trình nhân giống có hiệu quả cao, đáp ứng thị trƣờng, chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài Phát triển quy trình nhân giống in vitro hoa cẩm chƣớng đơn. .. tới một số chỉ tiêu sinh trƣởng của cây cẩm chƣớng in vitro - Ra rễ tạo cây con in vitro hoàn chỉnh - Rèn luyện cây con ngoài vƣờn ƣơm 2 - Khảo sát sinh trƣởng và phát triển của cây hoa cẩm chƣớng đơn giống Mix đƣợc nhân bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro 4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần bổ sung các qui trình nhân giống các loại cây trồng... phát sinh chồi bất định từ mẫu lá in vitro của cây hoa cẩm chƣớng Số chồi bất định cao nhất trên môi trƣờng chứa BAP 4,4 µM và NAA 2,205 µM [4] Tác giả Watad và cộng sự (1996) đã đƣa ra phƣơng pháp tái sinh cây cẩm chƣớng hoàn chỉnh trên môi trƣờng có bổ sung TDZ (4 mg/l) và NAA (7,35 µM) [36] Nhóm nghiên cứu Arici và cộng sự (2009) đã phát triển một quy trình để vi nhân giống in vitro cây hoa cẩm chƣớng,... hạn nhƣ khả năng phát triển thành cây mới dƣới điều kiện nuôi cấy cụ thể Tính đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc hình thành, đặc biệt là ở các nƣớc đang phát triển, nơi có nhân công rẻ Các quy trình vi nhân giống đã đƣợc phát triển trên nhiều đối tƣợng cây cảnh, chẳng hạn nhƣ cây hoa lay ơn [10], [15], hoa hồng, [30], [37], hoa cúc [33], [35], hoa cẩm chƣớng [21],... nƣớc d Đặc điểm hoa cây cẩm chƣớng: Cây cẩm chƣớng có 2 dạng: Hoa đơn và hoa kép Hoa mọc đơn, từng chiếc một Hoa nằm ở đầu cành và mang nhiều màu sắc Ngay cả trên một hoa cẩm chƣớng kép cũng có từ 2 màu khác nhau trở lên Nụ hoa có đƣờng kính 2-2,5 cm Hoa khi nở hoàn toàn có đƣờng kính khoảng 5-8 cm Hạt cẩm chƣớng nhỏ, nằm trong quả Mỗi quả thƣờng có từ 100- 600 hạt e Công dụng y học: Hoa cẩm chƣớng còn... triển một quy trình để nhân giống in vitro cây hoa lay ơn từ chồi đỉnh trên môi trƣờng MS có bổ sung IBA (2,46 µM) và BAP (9,84 µM) [15] Trên đối tƣợng cây hoa cúc, tác giả Nalini 14 (2012) đƣa ra kết luận sự hình thành chồi từ chồi đỉnh trên môi trƣờng MS có bổ sung Kinetin (13,85 µM) và IAA (9,6 µM) [29] Tác giả Shirdel và cộng sự (2013) thông báo quá trình nhân dòng cây hoa hồng Rosa canina từ chồi... bằng kĩ thuật in vitro 4.2.Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần đƣa ra qui trình nhân nhanh hoa cẩm chƣớng đơn Mix tạo ra nguồn giống cho sản xuất 3 NỘI DUNG Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÂY HOA CẨM CHƢỚNG 1.1.1 Đặc điểm phân loại Cây cẩm chƣớng (Dianthus carryophyllus) thuộc họ Cẩm chƣớng (Caryophyllaceae) có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản Họ Cẩm chƣớng với... thực vật là hai nhân tố quan trọng nhất trong quá trình phát sinh chồi bất định Phát triển trực tiếp từ nguồn mẫu thực vật: Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Kantia và cộng sự (2002) đã đƣa ra một quy trình phát sinh chồi bất định có hiệu quả cao từ lá cây hoa cẩm chƣớng Dianthus chinensis đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung BAP (13,2 µM) kết hợp với NAA (7,35 µM) [19] Tác giả Martin và cộng sự