Báo cáo thực hành lý sinh

Báo cáo thực hành lý sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

KHOA Y DƯỢC

- -BÁO CÁO THỰC HÀNH

LÝ SINH

Giáo viên hướng dẫn: TS.Hoàng Văn Huệ

Lớp : YK09 ĐC (Nhóm 1) Đăklăk, ngày 27 tháng 05 năm 2010

BÀI 1:XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN TẾ BÀO HỒNG CẦU I.Yêu cầu:

 Phân biệt các loại môi trường ngoài

 Phản ứng của tế bào hồng cầu với các loại môi trường trên

 Xác định thành phần nào của tế bào hồng cầu làm cho nó thay đổi hình dạng

 Xác định được nồng độ bền bằng cách nào

II.Lý thuyết

Cấu trúc màng tế bào hồng cầu giống các loại màng sinh chất khác gồm 3 lớp kép Ngoài

ra ở bề mặt bên trong của màng tế bào hồng cầu có tồn tại mạng lưới spectrin có nguồn gốc là các protein dạng sợi có trọng lượng là 200.000 – 220.000 daltol

Hình 1.1 Mạng lưới spectrin ràng buộc với các sợi actin ngắn

Nhờ có mạng lưới này mà tế bào hồng cầu có thể thay đổi hình dạng (co tròn hay duỗi dài) giúp chúng đi qua các mao mạch nhỏ

Hình 1.2 Tế bào hồng cầu qua các mao mạch nhỏ

Đối với tế bào hồng cầu già hoặc những tế bào hồng cầu bị thoái hóa chức năng thì khả năng co bị suy giảm vì vậy chúng lọt qua các mao mạch kiểm soát rồi bị tiêu hủy ở lách

Sự thay đổi của các loại tế bào hồng cầu phụ thuộc vào môi trường ngoài Có 3 loại môi trường ngoài:

 Ưu trương: Tế bào hồng cầu bị teo lại

 Đẳng trương: Tế bào hồng cầu bền vững

 Nhược trương: Tế bào hồng cầu trương lên tới một nồng độ nào đó thì màng tế bào không còn khả năng giữ vững bị vỡ và giải phóng chất nội bào gọi là hiện

tượng huyết tiêu

Hình 1.3 Các tế bào trong máu Hình 1.4 Hiện tượng huyết tiêu

Nhiệm vụ thực hành: Xác định nồng độ nhược trương lớn nhất bằng bao nhiêu chưa đủ gây ra hiện tương huyết tiêu thì nồng độ đó chính là nồng độ bền

III.Hóa chất và dụng cụ

 Ống nghiệm, pipette, máy ly tâm

 Dung dịch NaCl 1%, nước cất, máu chống đông

IV Cách tiến hành

 Pha 10 dung dịch với 10 nồng độ khác nhau thay đổi từ 0% đến 0,9%, thể tích của mỗi ống nghiệm là 10 ml

 Thả vào mỗi ống nghiệm một giọt hồng cầu

 Đảo nhẹ ống 2 lần rồi cố định trong 30 phút

 Đem ly tâm với tốc độ 2500 vòng/phút trong 5 phút

 Lấy ra đọc kết quả

V Kết quả, giải thích

Các ống từ 1 đến 6 có màu từ đỏ đậm tới nhạt dần

Nguyên nhân: do nồng độ NaCl trong môi trường nhiều hơn so với trong tế bào hồng cầu làm cho nước đi vào làm thề tích tế bào tăng, chúng trương phồng lên rồi bị vỡ ra, và giải phóng các chất ra ngoài môi trường gây ra hiện tượng huyết tiêu

Lượng nước đi vào các ống nghiệm giảm dần từ ống 1 đến ống 6 (vì nồng độ NaCl tăng dần từ ống 1 đến ống 6 và thể tích ở mỗi ống nghiệm không đổi) nên các tế bào trong ống 1 bị vỡ nhiều nhất làm cho dung dịch có màu đậm nhất Ngược lại ở ống 6 tuy nước đi từ môi trường vào trong tế bào nhưng chưa đủ để gây ra hiện tượng huyết tiêu tức là tế bào hồng cầu trương lên tới mức tối đa nhưng chưa vỡ

Các ống 7,8 hồng cầu không bị vỡ ra lắng xuống đáy dung dịch trong suốt dần

Ống 9: dung dịch thu được trong suốt, lượng nước đi ra và đi vào tế bào là như nhau, do có sự cân bằng nồng độ NaCl trong và ngoài màng tế bào Dung dịch thu được trong ống 9 là dung dịch đẳng trương

BÀI 2: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ALBUMIN, GLOBULIN, PROTEIN TỖNG SỐ

TRONG HUYẾT THANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHÚC XẠ KẾ

I Mục đích thí nghiệm

Xác định hàm lượng Albumin và Globulin có trong huyết thanh,từ đó xác định hệ số tương quan K

II.Cơ sở lí thuyết

Thành phần chủ yếu của máu người bao gồm: Hồng cầu, hợp chất vô cơ và các chất

Khi hồng cầu lắng tạo thành huyết thanh gồm: các chất vô cơ, hữu cơ, proteinalbumin, protein globulin

Hình 2.1 Nhân albumin huyết thanh Hình 2.3 Globulin

 Có nhiều phương pháp xác định

 Phương pháp khúc xạ kế là phương pháp dùng xác định chiết xuất của dung dịch

 Khúc xạ kế là một hệ thống quang học gồm thấu kính và lăng kính

 Khi ánh sáng qua lăng kính sẽ xảy ra hiện tượng phản xạ, khúc xạ ánh sáng.Vì vậy khúc

xạ kế hoạt động dựa trên hiện tượng phản xạ toàn phần, điều chỉnh góc tới sao cho thu được hiện tượng phản xạ toàn phần và khi xác định được góc phản xạ toàn toàn phần thì xác định được chiết suất rồi suy ra được hàm lượng phần trăm của các chất

Cách đo chiết suất:

 Nhỏ dung dịch vào giữa 2 lăng kính một vài giọt dung dịch cần đo

 Điều chỉnh góc quay lăng kính sao cho trong thị trường quan sát thấy 2 vùng sáng tối rõ nét

 Mắt nhìn vào thị trường của kính có 2 miền sáng tối Sử dụng ốc điều khiển để chỉnh sao cho ranh giới không bị nhòa rồi đưa ranh giới tới điểm giữa của vạch chữ X rồi đọc giá trị chiết suất ở thị trường quan sát số 2

 Sau đó quan sát trên thị trường thứ 2 có 2 thang đo Số chỉ của thang đo chính là chiết suất của dung dịch đem đo

Hình 2.3 Thị trường có 2 miền sáng tối Hình 2.4 Thị trường có thang đo

III.Dụng cụ

 Khúc xạ kế

 Máy li tâm

 5 ống nghiệm có đánh số từ 1đến 5

 Dung dịch acid axetic 0,04N,dung dịch (NH4)2SO4 bão hoà ,nước cất

 Dung dịch huyết thanh

IV.Cách tiến hành

Cho hoá chất vào các ống nghiệm sau đó đo chiết suất của dung dịch thu được đồng thời

đo chiết suất của dung dịch huyết thanh và nước cất cụ thể như sau :

 Ống nghiệm 1: Cho 1ml huyết thanh + 1ml acid axetic lắc đều đem đun sôi cách thuỷ trong

30 giây, rồi lấy ra để nguội Sau đó li tâm 10 phút với 2500 vòng/phút sẽ thu được dịch trong suốt không chứa globulin, do globulin đã tác dụng với acid axetic tạo kết tủa Đem

đo chiết suất của dung dịch trong suốt, kí hiệu n1.

 Ống nghiệm 2: Cho 1ml huyết thanh + 1ml (NH4)2SO4 bão hòa lắc đều sẽ thấy kết tủa trắng Sau đó li tâm 3000 vòng/phút trong 30 phút Thu được dịch trong suốt không chứa Albumin, vì (NH4)2SO4 đã làm Albumin kết tủa Đem đo chiết suất, kí hiệu n2

Hình 4.5: Ống 1: Huyết thanh, Ống

axetic 0,04N +1ml nước

(NH4)2SO4 bão hoà +1ml nước cất thu đựơc dung dịch nửa bão hoà Đem đo chiết suất,

kí hiệu n4

 Đo chiết suất của nước cất, kí hiệu n5

 Đo chiết suất dung dịch huyết thanh, kí hiệu n6

Ta có các công thức sau:

 Hàm lượng Albumin(%): A = 2(n2  n04,00177) 2(n1  n3)

(1)

 Hàm lượng Globulin(%): G = n6  [n05,002292(n2  n4)]

(2)

Hệ số tương quan : K = G A (3)

V Kết quả :

Dưới đây là chiết suất của dung dịch thu được sau 3 lần đo và chiết suất trung bình sau 3 lần đo

(n1) ống2(n2) ống3(n3) ống4(n4) ống5(n5) ống6(n6) Lần đo

- Áp dụng công thức (1) ta có:

A(%) = 2(n2  n0,400177) 2(n1  n3)

=2(1.3890 1.37900,00177) 2(1.35301.3440)= 1,1299 %

- Áp dụng công thức (2) ta có:

G(%) = n6  [n05,002292(n2  n4)]

= 1.3672 [1.34560,002292(1.3891.379)]= 0.6987%

Áp dụng công thức (3) K =

G

A

=

6987 0

1299 1

= 1.6171 Vậy: A(%) = 1,1299 %, G(%) = 0,6987 %, K = 1.6171

BÀI 3 : XÁC ĐỊNH ÁP SUẤT THẨM THẤU CỦA HUYẾT THANH

BẰNG PHƯƠNG PHÁP PAGIERAST

I Yêu cầu :

 Nắm được vai trò và ý nghĩa áp suất thẩm thấu trong cơ thể sinh vật

 Nắm được bản chất áp suất thẩm thấu là gì?

 Nắm được phương pháp bagiơrest để xác định áp suất thẩm thấu của huyết thanh

II Cơ sở lý thuyết :

 Đối với hệ thống sống, khuếch tán và thẩm thấu giữ vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất, đặc biệt ở cơ thể người, duy trì áp suất thẩm thấu keo đóng vai trò trong việc điều tiết trong máu

 Ngoài ra còn có quá trình trong việc bài tiết các chất cặn bã gây nên lực hóa thẩm thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp ATP,là một quá trình sinh năng lượng quan trọng và chử yếu ở cơ thể sinh vật

 Giá trị của áp suất thẩm thấu thay đối tùy theo từng đối tượng sinh vật ở những động vật bậc thấp giá trị áp suất thẩm thấu thay đổi tùy nồng độ các chất ở môi trương xung quanh ở động vật bậc cao áp suất thẩm thấu ít thay đổi,chỉ dao động trong một khoảng nhỏ

Ví dụ: áp suất thẩm thấu của huyết thanh trong cơ thể người thay đổi trong khoảng 7,2 – 7,4 atm Thông thường dao động trong khoảng 7,35 atm

III.Bản chất :

Do nồng độ phân tử các chất hòa tan gây nên, được xác định bởi số các tiểu phân (ion, phân tử) có trong dung dịch đó Vì vậy giá trị áp suất thẩm thấu phụ thuộc nồng độ : P = αCRTCRT

Áp suất thẩm thấu phụ thuộc số lượng các tiểu phần trong dung dịch Điều kiện để quan sát được hiện tượng thẩm thấu: phải có sự chênh lệch về nồng độ các chất hòa tan trong hai pha.ở một dung dịch xác định nào đó,luôn có một áp suất hơi bão hòa nồng độ chất hòa tan càng lớn áp suất hơi bão hòa càng cao Trong thực tế có thể đo áp suất thẩm thấu bằng phương pháp gián tiếp dựa trên nguyên tắc vể sự phụ thuộc của áp suất hơi vào bề mặt của dung dịch

có nồng độ khác nhau Dung dịch nào có áp suất thẩm thấu cao thì nồng độ của áp suất hơi trên bề mặt càng lớn Dựa vào nguyên tắc này, Pagierast xây dựng phương pháp xác định áp suất thẩm thấu dựa vào sự di chuyển của bọt khí giữa hai chất lỏng có nồng độ khác nhau

IV Dụng cụ :

 Kính hiển vi

 Huyết thanh

Hình 5.1 Kính hiển vi quang học Hình 5.2 Huyết tương (plasma, phần màu vàng)

 Đĩa đồng hồ

 Đèn cồn, Nến

 Ống nghiệm (mao quản)

 Nước cất

 Dung dịch NaCl 1%

 Lam kính

V Tiến hành :

Chuẩn bị dung dịch kiểm tra : pha các dung dịch có nồng độ 0,3 - 0,7 chuẩn bị tiêu bản

để xoay kính :

Lấy 3ml dung dịch huyết thanh ra dĩa đồng hồ, sau đó dùng đĩa 2 rót 1 trong các dung

dịch kiểm tra, lấy 1 mao quản cầm nghiêng để chất lỏng dâng lên giữa mao quản, lấy ra, quay

ngược Khi cách đầu kia khoảng 0.5mm, nhúng vào chất lỏng nghiên cứu, dung dịch đó sẽ đẩy

dung dịch kiểm tra về vị trí cũ và tạo bọt khí ở giữa, đặt mao quản lên lam kính, dùng nến đốt

trên ngọn lửa đèn cồn cho nến nóng chảy và dán kín 2 đầu mao quản, sẽ thu được 1 tiêu bản,

sau đó quan sát bằng kính hiển vi

Bọt khí sẽ chuyển động về phía dung dịch có nồng độ thấp (nhìn dưới kính hiển vi sẽ

ngược với thực tế)

VI Kết quả :

o Tại 0,3%: bọt khí di chuyển sang huyết tương

o Tại 0.4%: bọt khí di chuyển sang huyết tương

o Tại 0,5%: bọt khí không di chuyển

o Tại 0,6%: bọt khí di chuyển sang NaCl

o Tại 0,7%: bọt khí di chuyển sang NaCl

Nồng độ đo được khi bọt khí cân bằng là C% = 0,5%

Chuyển đổi 0.5% dung dịch NaCl ra nồng độ mol:

10 % 10.1.0,5

0.0855 58,5

M

D C

M

Phân tử NaCl phân ly thành 2 ion Do đó:

Giá trị áp suất thẩm thấu : P = 2 x 0.0855 x 0.082 x (273 + 34) = 4.3047 atm

Bài 4 : XÁC ĐỊNH NĂNG LƯỢNG HOẠT HÓA CỦA QUÁ TRÌNH

CO BÓP TIM ẾCH TẮCH RỜI

I/ Cơ sở lý thuyết

Như ta đã biết, để một phản ứng xảy ra thì nguyên tử, phân tử tham gia phản ứng phải

tiến lại gần với nhau tạo ra một cấu hình không gian mới Tuy nhiên khi tới một khoảng cách

xác định thì giữa các nguyên tử, phân tử xuất hiện lực đẩy culông làm cản trở quá trình hình

thành phân tử mới.Vậy cần phải cung cấp năng lượng cho chúng Năng lượng tối thiểu cần

phải cung cấp cho các nguên tử, phân tử để thắng đươc lực đẩy culông được gọi là năng lượng

hoạt hóa (E )

Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nhiệt độ được thể hiện qua biểu thức toán học Arenius

KT = P Z exp(

hh E RT

) (1) Trong đó:

P : hệ số lập thể (biểu thị cấu hình không gian của các nguyên tử, phân tử)

Z : hệ số va chạm

R : hằng số khí

T : nhiệt độ tuyệt đối

Ngoài ra, ta còn biểu thức liên hệ Vanhoff:

Q10 =

10

T T

K K



(2)

Từ(1) và (2) rút ra phương trình của Ehh

 Q10 =

exp

( 10)





10 ( 10)

hh E exp

RT T



   ln Q10 =

10 ( 10)

hh E

RT T 

 Ehh =

( 10)

ln 10

RT T 

Q

 Ehh = 0,46 RT(T+10) lg Q10

II/ Tiến hành

 Để ếch trên bàn mổ, dùng dao hoặc kéo mở rộng lồng ngực ếch, tiếp tục cận thận gở bỏ màng bao tim

 Xác định chủ động mạch trái, chủ động mạch phải và tĩnh mạch màu xanh ở phía dưới

 Dùng chỉ cột chặt động mạch chủ phải, rồi đến tĩnh mạch và dùng chỉ dài cột chặt động mạch chủ trái hơi xa tim Kéo căng sợi chỉ ở động mạch chủ trái, dùng dao mở 1 đường dọc

 Dùng ống thông tim luồn thẳng vào động mạch chủ trái và vào tâm thất trái (nếu có thể vẩy hết máu trong tim thì tốt)

 Dùng chỉ dư khoảng 15cm cột chặt phía dưới chỗ lỗ thủng có ống thông tim Cẩn thận

dỡ bỏ tim, tách rời tim ra khỏi cơ thể (yêu cầu tim vẫn đập 1 cách bình thường)

 Đưa tim vào trong bình cồn để nuôi Để cách bề mặt dung dịch ringer khoảng 1cm

 Chờ sau 1 phút, dùng đồng hồ bấm giờ để tính tần số co bóp của tim Đưa toàn bộ bình

ẩm vào trong nươc đá để hạ nhiệt độ xuống 10oC tương ứng với thời gian ngâm là 3 phút Sau đó đưa ra ngoài để tính tần số co bóp của tim( mỗi lần tính thời gian cần thực hiện 3 lần)

Kết quả : Sau 3 lần đo ta được bảng giá trị tần số K như sau :

Áp dụng công thức (1)Q10 = T

T

K

K 10

=

53 23

Áp dụng công thức (2)Ehh = 0,46.(T+10)T.lgQ10

= 0,46.(273+13).(273+23).lg

53

23 = 14.118 (kcal/mol) Vậy năng lượng hoạt hoá của quá trình co bóp tim ếch tách rời là: 14.118 (kcal/mol)

BÀI 5: XÁC ĐỊNH TÍNH THẤM MỘT CHIỀU CỦA DA ẾCH

 Màng tế bào là 1 hệ thống mở, vì vậy mà chúng có khả năng trao đổi các chất từ trong

ra ngoài và ngược lại, dồng thời đào thải các chat cặn bã ra ngoài môi trường

 Da ếch là một trong những đối tượng kiểm tra tính thấm 1 chiều

I/ Cơ sở lí thuyết:

Da ếch cấu tạo từ 2 lớp:

 Lớp ngoài : là tế bào biêu mô được cấu tạo từ 3 – 8 lớp tế bào, lớp ngoài cùng lớp màng cutin, có nguồn gốc ở tuyến nhầy của da ếch

 Lớp thứ 2 là lớp tế bào sừng, lớp thứ 3 là lớp té bào hình tròn xếp thưa nhau, nhờ

đó tạo nên khoảng gian bào

 Lớp thứ 4: là lớp tế bào hình lăng trụ, có nhân là hình ovan, sắp xếp 1 cách xít nhau

 Lớp tế bào biểu mô uôn luôn phát triển để thay đổi, chúng có khả năng hấp thụ mạnh, phản ứng axit yếu

 Lớp trong: là lớp mô lien kết chứa các sắc tố màu đen, chúng có đặc điểm hấp thụ yếu, phản ứng kiềm yếu, đặc biệt với một số chất nhuộm có tính kiềm yếu như metylblue, da ếch chỉ cho thấm từ trong ra ngoài

II/Cách tiến hành:

 Tạo 2 túi da ếch, một túi lộn ngược và một túi để xuôi, cho xanhmetylen vào 2 túi, đem ngâm trong dung dịch sinh lí, thời gian chờ khoảng 2 tiếng Đo và xác định được hàm lượng metylblue thấm qua màng bằng phương pháp đường chuẩn

 Phương pháp đường chuẩn: dựa vào các nồng độ của các chất biết trước, đo hệ số hấp thụ ( hoặc hệ sô truyền qua) bằng máy quang phổ (thường được sử dụng trong hóa phân tích.) sau đó vẽ được đồ thị đường chuẩn, khi biết được hệ số hấp thụ của một dung dịch bất kì, ta có thể xác định được nông độ của chúng nhờ đường chuẩn

 Với C1, 2C1, 3C1, 4C1 là các nồng độ tương ứng với các hệ sô hấp thụ là A1, A2, A3, A4

Ta có đồ thị như sau:

A1

A

2

A3

A

4

Đồ thị biểu thị sự liên quan giữa nồng độ

và chiết suất

BÀI 6: CÁC DẪN XUẤT CỦA HEMOGLOBIN(Hb)

I.Yêu cầu :

- Nắm được cấu trúc và chức năng Hb

- Nắm được các dạng HbO2.

- Nắm được dẫn xuất Hb

II.Cơ sở lí thuyết :

Thành phần chính của hồng cầu là Hb Trong 1 tế bào hồng cầu có khoảng 200 triệu phân tử Hb Một phân tử Hb có thể chứa 9.000 nguyên tử các loại C,H,O,S,N……… trọng lượng phân tử Hb là 67000 Dal

Hb được cấu tạo bởi 2 thành phần chính : protein globin + nhóm chức Hem

Hình 3.1 Cấu trúc phân tử Hemoglobin và công thức hóa học của nhân Hem.

Hình 3.2: Albumin + HEM

Nhóm chức Hem bao gồm 1 nguyên tử Fe++ nằm giữa 4 vòng pyrol Nhờ nguyên tử

Fe++ nên tế bào hồng cầu có khả năng thu nhận và giải phóng Oxi từ Phân tử Hb cho các tế bào của mô

Cấu trúc protein globin : phức tạp, cấu tạo bởi 4 chuỗi polypeptit Trong đó có 2 chuỗi

là αCRT-polypeptit và 2 chuỗi β-polypeptit, có tính chất khác nhau Hình dạng của 2 chuổi polypeptit khi kết hợp với Oxi cũng khác nhau Chuỗi β-polypeptit khi kết hợp với oxi sẽ bị cuộn tròn lại, khi nhả oxi ra, nó lại duỗi thẳng Chuỗi αCRT-polypeptit khi kết hợp cũng như khi không kết hợp, hình dạng không thay đổi

Oxyhemoglobin có 4 dạng khác nhau:

Hb4O2 Hb4O4 Hb4O6 Hb4O8

Chỉ có dạng 4(Hb4O8) là dễ dàng kết hợp và giải phóng oxi (dạng bão hòa oxi)