báo cáo thực hành lý sinh hay

Chẳng hạn khi nhiệt độ tăng lên T2 > T1 thì năng lượng của các phân tử tăng lên, phân tử có năng lượng bằng hoặc lớn hơn Ehh sẽ nhiều hơn, thể hiện ở đường cong phân bố Maxwell – Boltzma

MỤC LỤC

Bài 1 - XÁC ĐỊNH NĂNG LƯỢNG HOẠT HÓA CỦA QUÁ TRÌNH CO BÓP TIM ẾCH TÁCH

RỜI 1

1.1 LÝ THUYẾT 1

1.2 THỰC HÀNH 3

1.2.1 Dụng cụ, hóa chất và vật liệu 3

1.2.2 Các bước tiến hành 3

1.2.3 Kết quả thực hành 5

Bài 2 -TÍNH THẤM MỘT CHIỀU CỦA DA ẾCH 7

2.1 LÝ THUYẾT 7

2.1.1 Cơ chế vận chuyển thụ động 7

2.1.2 Cơ chế vận chuyển tích cực 8

2.2 THỰC HÀNH 9

2.2.1 Dụng cụ, hóa chất và vật liệu 9

2.2.2 Các bước tiến hành 9

2.2.3 Kết quả thực hành 10

Bài 3 - XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN CỦA MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU 13

3.1 LÝ THUYẾT 13

3.2 THỰC HÀNH 15

3.2.1 Dụng cụ, hóa chất và vật liệu 15

3.2.2 Các bước tiến hành 15

3.2.3 Kết quả thực hành 15

Bài 4 - XÁC ĐỊNH ÁP SUẤT THẨM THẤU BẰNG PHƯƠNG PHÁP BAGIERAST 17

4.1 LÝ THUYẾT 17

4.2 THỰC HÀNH 19

4.2.1 Dụng cụ, hóa chất và vật liệu 19

4.2.2 Các bước tiến hành 19

4.2.3 Kết quả thực hành 22

Bài 5 - ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN HUYẾT THANH BẰNG KHÚC XẠ KẾ 24

5.1 LÝ THUYẾT 24

5.1.1 Những khái niệm cơ bản 24

5.1.2 Nguyên lý hoạt động của khúc xạ kế ABBE 25

5.1.3 Cách sử dụng khúc xạ kế ABBE 27

5.2 THỰC HÀNH 27

5.2.1 Dụng cụ, hóa chất và vật liệu 27

5.2.2 Các bước tiến hành 28

5.2.3 Kết quả thực hành 29

6.2 THỰC HÀNH 33

6.2.1 Dụng cụ, hóa chất và vật liệu 33

6.2.2 Các bước tiến hành 33

6.2.3 Kết quả thực hành 34

Bài 7 - ĐO KÍCH THƯỚC TẾ BÀO TRÊN KÍNH HIỂN VI 37

7.1 LÝ THUYẾT 37

7.1.1 Thước đo thị kính 37

7.1.2 Thước đo vật kính 38

7.2 THỰC HÀNH 39

7.2.1 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị 39

7.2.2 Các bước tiến hành 39

7.2.3 Kết quả thực hành 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

MỤC TIÊU

Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:

1 Xác định được đối tượng nghiên cứu của động học;

2 Nắm vững năng lượng hoạt hóa của một phản ứng (một quá trình);

3 Mô tả mối liên quan giữa hằng số tốc độ của phản ứng với nhiệt độ;

4 Nắm vững bản chất của đại lượng Q 10 và ý nghĩa của nó;

5 Thành thạo phương pháp cô lập tim ếch và tính năng lượng hoạt hóa của một quá trình sinh học

có một năng lượng tối thiểu để vượt qua hàng rào

lực đẩy giữa các lớp vỏ điện tử để liên kết với nhau,

do đó năng lượng hoạt hóa là năng lượng tối thiểu

cần thiết để nguyên tử, phân tử có thể tham gia vào

phản ứng

Theo Maxwell – Boltzmann, sự phân bố phân

tử theo năng lượng có dạng như trên hình 1 Giả sử

Ehh là năng lượng tối thiểu cần thiết để phân tử của

một chất có thể tham gia vào một loại phản ứng thì

ta thấy chỉ những phân tử nào có năng lượng bằng

hoặc lớn hơn Ehh (là những phân tử có năng lượng

nằm bên phải đường thẳng Ze) là có khả năng tham gia vào phản ứng tạo thành sản phẩm

Hình 1-1 Sự phân bố phân tử theo

năng lượng

E- năng lượng; E hh – năng lượng hoạt hóa;

N – số phân tử; Z e – đường thẳng song

song với trục tung

Khi nhiệt độ thay đổi, làm thay đổi động năng do chuyển động nhiệt của các phân tử Do

đó tổng năng lượng của các phân tử cũng thay đổi Chẳng hạn khi nhiệt độ tăng lên (T2 > T1) thì năng lượng của các phân tử tăng lên, phân tử có năng lượng bằng hoặc lớn hơn Ehh sẽ nhiều hơn, thể hiện ở đường cong phân bố Maxwell – Boltzmann dịch sang bên phải, do vậy chúng

có khả năng tham gia vào phản ứng nhiều

hơn làm cho tốc độ phản ứng tăng lên Mối

liên quan giữa tốc độ và phản ứng và nhiệt

độ được biểu diễn qua phương trình

Arhenius

𝐾 = 𝑝𝑧𝑒−𝐸ℎℎ𝑅𝑇 (1.1)

trong đó: K – tốc độ của phản ứng; Enh –

năng lượng hoạt hóa; P – yếu tố lập thể;

R – hằng số khí; Z – hệ số va chạm; T –

nhiệt độ tuyệt đối

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của lnK vào đại lượng 1

𝑇 được thể hiện trên hình 2 Đồ thị này có ý nghĩa quan trọng, dựa vào nó chúng ta có thể xác định được giá trị năng lượng hoạt hóa của một quá trình:

𝑡𝑔𝛼 =𝐸ℎℎ

𝑅 (1.2) Năng lượng hoạt hóa còn có thể được xác định thông qua một đại lượng khác, đại lượng Q10 Đại lượng Q10 hay còn được gọi là hệ số Van’t Hoff Đại lượng này là tỷ số giữa hai hằng

số tốc độ của phản ứng ở điều kiện chênh lệch nhau 10 độ Censius (10oC)

𝑄10= 𝐾2

𝐾1 =

𝐾𝑇+10

𝐾𝑇 (1.3) Trong đó: K1 – hằng số tốc độ của phản ứng ở nhiệt độ ban đầu T1; K2 – hằng số tốc độ của phản ứng ở nhiệt độ T2 = T1 +10;

Đại lượng Q10 có nghĩa quan trọng Nó cho biết hằng số tốc độ của phản ứng tăng hay giảm bao nhiêu lần khi nhiệt độ thay đổi 10oC Biểu thức toán học thể hiện mối liên quan giữa năng lượng hoạt hóa của quá trình đại lượng Q10 như sau:

𝐸ℎℎ = 0,46 𝑇1 𝑇2 𝑙𝑔𝑄10 (1.4)

lnK

1𝑇

𝛼

Hình 1-2 Sự phụ thuộc của tốc độ phản

ứng vào nhiệt độ

Trong thực nghiệm chúng ta có thể xác định đại lượng Q10 và do vậy việc tính giá trị năng lượng hoạt hóa của một quá trình (nhất là quá trình sinh học) trở nên dễ dàng Mục đích của bài thực tập này là xác định năng lượng hoạt hóa của quá trình co bóp tim ếch tách rời

 Dùng kéo panh nhỏ, luồn sợi chỉ dài chừng 15-20cm xuống dưới hai động mạch và tĩnh mạch chủ Cẩn thận trong khi luồn chỉ qua tĩnh mạch vì thành tĩnh mạch rất mỏng nên dễ bị rách

 Thắt chặt tĩnh mạch chủ và động mạch phía phải của ếch

Nhẹ nhàng kéo sợi chỉ để nâng động mạch trái lên, cắt vát một

đường, tạo một lỗ nhỏ để luồn canuyl có chứa dung dịch Ringer

(dung dịch sinh lý máu lạnh) vào sâu trong tâm thất Sự xuất hiện

cột máu trong canuyl khi tim co bóp đẩy lên chứng tỏ canuyl đã

đưa vào đến tâm thất

 Dùng ống hút rút bỏ máu trong canuyl, tiếp tục cho dung

dịch Ringer vào canuyl để rửa tim cho đến khi toàn bộ máu trong

tim đã được thay thế hết bằng dung dịch Ringer

 Thắt chặt chỉ, buộc động mạch trái vào canuyl rồi dung kéo

Hình 1-3 Tim ếch cô lập trong bình tạo ẩm

cơ thể mà vẫn đập, đẩy cột dung dịch sinh lý trong canuyl lên xuống nhịp nhàng thì việc tách rời (hay cô lập) tim ếch mới đạt yêu cầu

 Gắn canuyl có tim ếch và nhiệt kế vào hai lỗ nhỏ của nút bình tạo ẩm sao cho bầu thủy ngân của nhiệt kế và mỏm tim ở một độ cao như nhau Bình ẩm là bình tam giác thủy tinh có chứa dung dịch sinh lý để tạo độ ẩm cho tim cô lập hoạt động tốt hơn Nếu kỹ thuật tách tốt ta

có một quả tim cô lập đập nhịp nhàng tới 8 giờ liên tục

ếch tách rời

 Chuẩn bị ba bình ẩm chứa khoảng 50ml dung dịch Ringer ở 3 nhiệt độ khác nhau

Bình 1 Đặt ở nhiệt độ của phòng thí nghiệm

Bình 2 Đặt trong máy điều nhiệt có nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng 10oC

Bình 3 Đặt vào chậu nước đá để hạ nhiệt độ xuống thấp hơn nhiệt độ phòng 10oC

 Khi nhiệt độ đã ổn định, đặt tim ếch cô lập vào bình ẩm ở nhiệt độ phòng, đếm số nhịp đập của tim trong thời gian 1 phút, đó chính là hằng số tốc độ của quá trình co bóp tim ếch tách rời (KT) đếm ít nhất 5 lần để lấy giá trị trung bình

Lưu ý: Có thể xác định hằng số tốc độ của quá trình bằng cách xác định thời gian mà tim

đập được 20 nhịp Suy ra 60 giây đập được bao nhiêu nhịp Làm như vậy có thể tiết kiệm được thời gian hơn

 Tiến hành tương tự như trên ở nhiệt độ cao hơn và thấp hơn 10oC so với nhiệt độ phòng để xác định được KT+10 và KT-10 Cần chú ý mỗi lần thay đổi nhiệt độ phải chờ 3 phút cho tim thích ứng với điều kiện nhiệt độ mới trong bình ẩm

 Áp dụng công thức để tính đại lượng Q10 trong điều kiện tăng nhiệt độ :

Thời gian (gy)

Hằng số tốc độ

K

Đại lượng

Q 10

Năng lượng hoạt hóa

tế bào và mô (tham khảo thêm về lý thuyết màng tế bào)

Tính thấm không những chỉ phụ thuộc vào cấu trúc đặc trưng của từng loại tế bào và mô

mà còn phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái chức năng của chúng Chính cấu trúc đặc trưng và trạng thái chức năng của các loại tế bào và mô quy định tính thấm có chọn lọc đối với các chất khác nhau từ môi trường vào tế bào Một khi tế bào và mô không còn khả năng hoạt động thực hiện các chức năng (tế bào bị chết) thì tính thấm chọn lọc cũng không còn nữa, khi tính thấm của màng tế bào thay đổi, luồng vật chất đi vào hoặc ra khỏi tế bào cũng thay đổi theo

Ngày nay ngoài thực bào, uống bào (còn gọi là ẩm bào) có hai cơ chế vận chuyển vật chất qua màng tế bào đã được làm sáng tỏ, đó là:

𝑑𝑡 – tốc độ khuếch tán vật chất qua màng (g/s); 𝑑𝑐

𝑑𝑥 - gradient nồng độ (g/cm3); 𝑆 – Tiết diện mà vật chất khuếch tán qua (cm2); 𝐷 – hệ số khuếch tán (g/cm2.s)

MỤC TIÊU

Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:

1 Nắm vững thế nào là tính thấm của tế bào mô;

2 Nắm vững cơ sở của hiện tượng màng có tính thấm chọn lọc;

3 Mô tả hai cơ chế vận chuyển vật chất qua màng tế bào;

4 Giải thích được hiện tượng thấm một chiều của tế bào và mô;

5 Nắm vững phương pháp dùng chất màu để nghiên cứu tính thấm;

Dấu (–) trong công thức nêu lên ý nghĩa vật lý của quá trình là sau thời gian khuếch tán (t) lượng vật chất đã bị giảm đi so với giá trị ban đầu Tốc độ khuếch tán càng lớn thì nồng độ chất ban đầu càng giảm nhanh

2.1.2 Cơ chế vận chuyển tích cực

Là cơ chế vận chuyển vật chất qua màng ngược tổng gradient có tiêu phí năng lượng của quá trình trao đổi chất Cơ chế này gắn liền với hoạt động của các chất mang là các phân tử lypoprotein trong thành phần cấu trúc màng Hoạt động của một trong các protein chất mang vận chuyển tích cực ion K+ và Na+ ngược gradient nồng độ của chúng là Na+ - K+ - ATPaza đã được nghiên cứu khá chi tiết và đươc mô tả như hoạt động của “bơm ion Na+ - K+” Bằng cơ chế này, tế bào và mô đã duy trì được gradient nồng độ các chất, nhờ đó mà chúng có khả năng sinh công dồi dào trong quá trình sống

Tốc độ cũng như chiều hướng thâm nhập của các chất vào tế bào và mô không chỉ phụ thuộc vào tính thấm chọn lọc của màng mà còn phụ thuộc vào bản chất của các chất và vào mức

độ thay đổi tính chất hóa lí của các chất đó Chẳng hạn, nếu có một chất nào đó khi đã xâm nhập vào nội bào nó tham gia vào phản ứng hóa học thành một chất khác, hoặc nếu nó chuyển

từ trạng thái tự do sang trạng thái liên kết, thì khả năng khuyếch tán trở lại môi trường ngoài của nó rất khó xảy ra Ví dụ một axit yếu hoặc kiềm yếu ở ngoài môi trường chúng không phân

li nên dể dàng khuếch tán vào trong tế bào Khi vào bên trong nội bào, do điều kiện môi trường

đã thay đổi nên chúng bị phân li thành các ion, dễ tham gia vào các liên kết hóa học nên mất khả năng khuyếch tán ra ngoài, nên axít yếu và kiềm yếu chỉ có khả năng thấm theo một chiều nhất định

Da ếch là một đối tượng thuận lợi để quan sát

và nghiên cứu tính thấm một chiều đối với một số

chất (trong đó có xanh methylene, một thuốc

nhuộm có tính kiềm yếu) Da ếch bao gồm biểu

mô ở phía ngoài và mô liên kết ở bên trong Biểu

mô được cấuu tạo từ 5 đến 8 lớp tế bào Ngoài

cùng, phủ lên biểu mô là một màng cutin mỏng có

nguồn gốc từ dịch của các tuyến nhầy và một lớp

tế bào sừng Tiếp theo là các lớp tế bào biểu mô

có dạng hình tròn, xếp hơi thưa tạo thành các khe

gian bào Trong cùng là lớp tế bào có hình lăng

trụ, nhân của chúng có hình ô van, xếp xít nhau và

Hình 2-1 Cấu tạo mô da ếch

1 Màng cutin; 2 Lớp tế bào sừng; 3 Các lớp tế bào sinh trưởng biểu mô; 4 Lớp tế bào màng nền; 5 Các sắc tố; 6 Lớp mô

liên kết

được gọi là tế bào màng nền Tất cả các lớp tế bào này được gọi là lớp tế bào sinh trưởng, chúng

có khả năng phân chia mạnh để thay thế các tế bào biểu mô già Dưới màng nền là lớp mô liên kết nơi định vị các sắc tố màu xanh đen (Hình 2 – 1)

Biểu mô da ếch có khả năng hấp thụ cao, phản ứng acid yếu (có tính acid yếu), còn lớp mô liên kết có khả năng hấp thụ yếu và phản ứng kiềm yếu Với cấu trúc mô đặc trưng như vậy, da ếch thấm một chiều từ mô liên kết ra biểu mô đối với một số thuốc nhuộm có tính kiềm yếu như xanh methylene Bởi vì ở lớp mô liên kết có tính kiềm yếu, các chất này không bị phân li thành các ion Chúng cũng không bị hấp thụ mạnh nên dể dàng khuyếch tán ra lớp biểu mô ở lớp biểu mô do có tính axít nên các chất bị phân li và bi hấp thụ mạnh do đó chúng không có khả năng khuyếch tán theo chiều ngược lại

Tính thấm một chiều của tế bào và mô không phải là bất biến mà cũng có thể bị thay đổi tính chất hóa lý của môi trường

đường kính ống thủy tinh

 6 cốc thủy tinh loại 100ml

 1 máy so màu để xác định mật độ quang học của dung dịch

Dùng chỉ buộc một đầu của những túi

da ếch đã chuẩn bị trên vào các ống thủy

tinh hình trụ, còn đầu kia buộc túm lại cho

dung dịch sinh lý vào túi để kiểm tra xem

túi có bị rò rỉ không Nếu không, đổ dung

dịch sinh lý đi rồi cho 5ml dung dịch xanh

methylen 0,1% vào và nhúng các túi này

vào các cốc đựng một lượng 100ml dung

dịch sinh lý bằng nhau

Chú ý sao cho mức xanh methylen

trong túi cao bằng mức dung dịch sinh lí

trong cốc

2.2.2.2 Quan sát hiện tượng thấm của xanh methylen qua các túi ếch

Đặt các cốc có túi da ếch trên vao bình ổn nhiệt độ 22oC trong 40 phút Sau đó nhận xét bằng mắt thường xem Xanh methylen khuyếch tán từ trong ra ngoài theo chiều nào: từ mô liên kết ra biểu mô hay ngược lại từ biểu mô ra mô liên kết? Đồng thời so sánh với những túi đã ngâm trong cồn xem có nhận xét gì, ghi các nhận xét vào vở và báo cáo kết quả với cán bộ hướng dẫn thực hành

2.2.2.3 Định lượng Xanh methylen đã thấm qua da ếch

 Dựng đồ thị chuẩn

Sau khi đặt các túi da ếch vào bình ổn nhiệt, trong khi chờ đợi kết quả, nhanh nhóng chuẩn

bị các dung dịch xanh methylen có các nồng độ: 0,002; 0,004; 0,006; 0,008; 0,01; 0,02% trong dung dịch sinh lí Dung máy so màu xác định mật độ quang học (D) của các dung dịch vừa pha Dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang học vào nồng độ, ta có đồ thị chuẩn

 Xác định lương xanh methylen đã thấm qua da

Sau 40 phút (hoặc lâu hơn nếu có thời gian) nhấc bỏ các túi da ếch ra khỏi các cốc, dung đũa thủy tinh khuấy đều dung dịch trong cốc rồi đêm xác định mật độ quang học trên máy so màu, Dựa vào đồ thị chuẩn xác định nồng độ xanh methylen đã thấm qua da ra ngoài

2.2.3 Kết quả thực hành

Kết quả thu được lập thành bảng số liệu

Hình 2-2 Mẫu túi da ếch; a Ống thủy tinh hình trụ; b Túi da ếch được ngâm trong dung

dịch

Nồng

D trung bình

Bài 3

XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN CỦA MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU

3.1 LÝ THUYẾT

Chúng ta biết màng tế bào có một ý nghĩa

đặc biệt quan trọng trong đời sống của tế bào

U.B.Frank - một nhà lý sinh nổi tiếng đã nói

rằng: “Mọi hoạt động sống đều diễn ra trên “sân

khấu” - màng” Màng ở đây được hiểu theo ý

nghĩa rộng, gồm các loại màng có mặt ở bên

trong tế bào (màng nội bào) và màng sinh chất,

màng bao quanh tế bào

Màng sinh chất giữ nhiệm vụ bảo vệ, trao đổi thông tin và vật chất giữa tế bào và môi trường bên ngoài Tế bào hồng cầu là một đối tượng điển hình để chúng ta nghiên cứu cấu tạo, tính chất và chức năng của màng tế bào

Trên hình 3-1 là hình ảnh chung về tế bào hồng cầu người quan sát qua kính hiển vi điện

tử Tế bào có mặt lõm để tăng diện tích tiếp xúc với môi trường ngoài Hồng cầu trưởng thành

là một loại tế bào không nhân Cấu tạo màng tế bào hồng cầu, nhìn chung giống như màng sinh chất của các loại tế bào khác, gồm các protein màng tế bào – lớp lipid kép – protein khảm vào

nhau (tham khảo về mô hình khảm động màng sinh chất) Có một điểm khác biệt là ở bề mặt

bên trong màng tế bào hồng cầu tồn tại một mạng lưới vật chất có nguồn gốc là protein dạng

Hình 3-1 Tế bào hồng cầu người quan sát

qua kính hiển vi điện tử

MỤC TIÊU

Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:

1 Phân biệt thế nào là môi trường ưu, nhược và đẳng trương

2 Phản ứng của tế bào động vật và thực vật trong các loại môi trường đó

3 Thành phần cấu trúc nào của màng tế bào hồng cầu giúp nó có thể thay đổi thể tích trong một giới hạn nhất định

4 Thế nào là độ bền của màng tế bào hồng cầu Ý nghĩa

5 Thành thạo phương pháp sử dụng dunh dịch nhược trương xác định độ bền của màng

tế bào hồng cầu

sợi và được gọi là spectrin Spectrin chiếm một

tỉ lệ là 30% tổng số protein của màng và là phức

hợp của hai sợi polypeptid có trọng lượng phân

tử khoảng 220.000 – 240.000Da (dalton) (hình

3-2)

Cùng với một vài loại protein khác,

spectrin tham gia vào quá trình biến đổi hình

dạng của hồng cầu thông qua việc co ngắn hay

duỗi dài dạng sợi của mình Bằng cách đó tế bào

hồng cầu có thể biến đổi hình dạng giúp nó đi qua được các mao mạch nhỏ li ti, ở khắp cơ thể Đặc biệt là ở lách, những tế bào hồng cầu đã già hoặc bị thoái hóa chức năng, khả năng đàn hồi

co giãn các sợi spectrin kém, không có khả năng đi qua mao mạch kiểm soát của cơ quan màng

và bị lách tiêu hủy

Ở trạng thái sinh lý bình thường, màng hồng cầu khá bền vững Thể tích của tế bào thường không thay đổi và được điều tiết bởi tỉ lệ lượng các chất hòa tan bên trong và bên ngoài tế bào Chúng ta biết, lượng các ion của các muối hòa tan bên trong tế bào là một hằng số ổn định Do

đó thể tích tế bào phụ thuộc vào lượng ion của môi trường bên ngoài Chúng ta biết có ba loại môi trường: môi trường ưu trương, môi trường đẳng trương, môi trường nhược trương

Màng tế bào hồng cầu bền trong môi trường đẳng trương Trong môi trường ưu trương, tế bào nhăn nhúm lại do chịu tác động của áp suất thẩm thấu từ bên ngoài vào Còn trong môi trường nhược trương thì tế bào trương phồng lên và màng của nó bị bung ra do chịu tác động của một lực gây ra bởi áp suất thẩm thấu từ bên trong làm cho lượng nước trong tế bào ngày càng tăng cao và cuối cùng giải phóng các chất từ nội bào ra bên ngoài Độ bền của màng hồng cầu chính là nồng độ dung dịch muối trong môi trường nhược trương, tại đó không xảy ra hiện tượng tế bào hồng cầu bị huyết tiêu

Hình 3-2 Mạng lưới spectrin ở bề mặt bên trong màng tế bào hồng cầu của cừu

Hình 3-3 Phản ứng của tế bào hồng cầu trong các môi trường khác nhau

Trong bài thực tập này, chúng ta tìm hiểu phản ứng khác nhau của tế bào động vật (hồng cầu) và thực vật khi tiếp xúc với ba môi trường nêu trên và xác định độ bền của màng hồng cầu

 Tế bào hồng cầu động vật máu nóng

 1 pipetman 100 l, giấy thấm, khăn lau

3.2.2 Các bước tiến hành

3.2.2.1 Lấy mẫu tế bào hồng cầu

Dùng citrat natri hoặc heparin để lấy máu chống đông Rửa tế bào hồng cầu bằng cách quay

li tâm (1200 vòng/phút trong 5 phút) máu chống đông trong dung dịch sinh lý PBS 90/00 (có pH

= 7,4) ba lần

Lưu ý: Trước khi li tâm dùng ống hút sục nhẹ nhàng cho hồng cầu phân bố đều trong dung

dịch, tránh bị vỡ Sau lần li tâm thứ ba, phân tán đều hồng cầu trong dung dịch PBS nói trên sao cho có mật độ là 5.10 6 tế bào/ml

3.2.2.2 Xác định độ bền của màng tế bào hồng cầu

Chuẩn bị 10 ống li tâm, đánh số từ 0 đến 10 Pha vào mỗi ống nghiệm 5ml dung dịch muối NaCl tương ứng với các nồng độ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9%, sau đó thêm vào mỗi ống nghiệm 500 l dịch hồng cầu đã chuẩn bị trên Để các ống nghiệm vào tủ ấm 370C trong 15 phút rồi li tâm 3000 vòng/phút Sau khi li tâm, quan sát màu của dịch Màu đỏ là màu của huyết sắc tố thoát ra sau khi màng tế bào hồng cầu bị vỡ Nồng độ thấp nhất của các ống không có màu đỏ là giới hạn bền của màng tế bào hồng cầu

Giá trị của áp suất thẩm thấu ở một số đối tượng bậc thấp có thể dao động trong một khoảng nào đó tùy thuộc vào nồng độ các chất ở môi trường xung quanh, còn ở các cơ thể bậc cao có giá trị tương đối ổn định mặc dù nồng độ của các chất ở môi trường xung quanh có thể thay đổi Chẳng hạn áp suất thẩm thấu của huyết thanh máu người ở trạng thái sinh lí bình thường

có giá trị là 7,4at (dao động trong khoảng 7,35 – 7,45 at)

Bản chất của áp suất thẩm thấu là do nồng độ phân tử của các chất hòa tan gây nên Vì vậy giá trị của áp suất thẩm thấu phụ thuộc vào giá trị nồng độ, ngoài ra nó còn phụ thuộc vào nhiệt

độ tuyệt đối của môi trường Van’t Hoff đã tính toán và đưa ra công thức xác định áp suất thẩm thấu (P) như sau:

𝑃 = 𝛼𝐶𝑅𝑇 (4.1)

MỤC TIÊU

Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:

1 Phân tích vai trò và ý nghĩa của áp suất thẩm thấu đối với cơ thể sinh vật;

2 Khắc sâu bản chất của áp suất thẩm thấu;

3 Nắm vững điều kiện để quan sát và xác định giá trị của áp suất thẩm thấu;

4 Nắm vững nguyên tắc của phương pháp Bagierast;

5 Thành thạo phương pháp xác định áp suất thẩm thấu của dịch sinh vật

Trong đó : C - là nồng độ chất tan (mol); R - là hằng số khí (8.31.103 jun/kmol.độ) ; T - là

nhiệt độ tuyệt đối (oK) ; - hệ số phân li

Điều này cũng có nghĩa áp suất thẩm thấu phụ thuộc vào số lượng các tiểu phần (số ion,

số phân tử, số hạt) trong dung dịch Cho nên đối với các dung dịch keo có nồng độ loãng thì định luật Van’t Hoff không còn chính xác nữa, bởi vì các hạt keo có khả năng keo tụ làm cho

số lượng hạt trong hệ giảm đi Tính chất này giúp chúng ta dễ dàng giải thích được vì sao áp suất thẩm thấu của các dung dịch keo thường có giá trị nhỏ hơn của dung dịch thực, hay vì sao

áp suất thẩm thấu của hai hệ keo tuy có cùng nồng độ trọng lượng, chỉ khác nhau về kích thước của hạt mà giá trị của chúng lại khác nhau

Thực nghiệm cho thấy rằng áp suất thẩm thấu keo tỷ lệ với lũy thừa bậc ba bán kính của hạt, vì thế cho nên khi kích thước của hạt thay đổi không đáng kể cũng sẽ dẫn đến thay đổi giá trị của áp suất thẩm thấu rất lớn Ví dụ : kích thước hạt mới thay đổi hai lần thì áp suất thẩm thấu đã thay đổi tới tám lần Trong trường hợp khi dung dịch có nồng độ tương đối đậm đặc thì phương trình Van’t Hoff có dạng như sau :

𝑃 = 𝐶𝑅𝑇 (1

𝑀+ 𝐵𝐶) (4.2) Trong đó: M - trọng lượng phân tử chất tan; B - hằng số đặc trưng cho sự tương tác giữa các hạt với nhau

Điều kiện để quan sát được hiện tượng thẩm thấu là phải có sự chênh lệch về nồng độ các chất hòa tan giữa hai pha được ngăn cách nhau bởi một màng bán thấm Màng bán thấm là màng chỉ cho phân tử dung môi mà không cho phân tử chất hòa tan đi qua

Trên hình 4-1 cho thấy bình A và B được

ngăn cách nhau bởi một màng bán thấm M, giả

sử chúng cùng chứa một loại dung dịch, nhưng

nồng độ dung dịch ở bình A nhỏ hơn ở bình B

(CA < CB), khi đó sẽ có một dòng dung môi

chuyển từ A sang B làm cho mực chất lỏng trong

bình B dâng cao hơn trong bình A Cột chất lỏng

ấy gây nên một áp suất tác dụng lên màng M,

ngăn cản dòng dung môi tiếp tục chuyển sang B

Khi đạt tới trạng thái cân bằng (có bao nhiêu

phân tử nước chuyển từ A sang B thì có bấy nhiêu chuyển từ B sang A) áp suất do cột chất lỏng

Hình 4-1 Thí nghiệm quan sát hiện

tượng thẩm thấu

gây nên đạt giá trị (Po) Đại lượng này có thể dùng đặc trưng định lượng cho áp suất thẩm thấu của dung dịch

Trong thực tế, có một màng bán thấm lí tưởng như vậy để quan sát và xác định áp suất thẩm thấu một cách trực tiếp là rất khó, cho nên người ta thường đo áp suất thẩm thấu bằng phương pháp gián tiếp dựa trên nguyên tắc về sự phụ thuộc của áp suất hơi trên bề mặt vào nồng độ dung dịch Dung dịch nào có nồng độ cao (tương ứng với áp suất thẩm thấu lớn) thì áp suất hơi trên bề mặt nhỏ Ngược lại, dung dịch nào có nồng độ thấp (có áp suất thẩm thấu nhỏ) thì áp suất hơi trên bề mặt của nó lớn Nếu cho bề mặt thoáng của hai dung dịch này tiếp xúc với nhau sẽ xảy ra hiện tượng dịch chuyển của các phân tử dung môi ở thể hơi về phía dung dịch có nồng độ cao hơn làm cho thể tích của nó tăng lên, còn thể tích của dung dịch có nồng

độ nhỏ sẽ bị giảm đi Dựa vào hiện tượng này Bagierast đã xây dựng phương pháp xác định áp suất thẩm thấu dựa vào quan sát sự chuyển động của bọt khí giữa hai dung dịch có nồng độ khác nhau trong mao quản Ưu điểm của phương pháp này là có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng, lượng chất cần thiết để nghiên cứu ít nên phù hợp với các đối tượng sinh vật

 50 ml dung dịch nghiên cứu (dung dịch NaCl

mà sinh viên không biết trước nồng độ)

 50 ml huyết thanh nguyên chất

4.2.2 Các bước tiến hành

4.2.2.1 Xác định áp suất thẩm thấu của dịch nghiên cứu

Bước 1 Chuẩn bị dung dịch kiểm tra

Dùng nước cất và dung dịch NaCl 1% để pha các dung dịch có nồng độ 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8% vào các ống nghiệm khác nhau Các dung dịch đó được gọi là dung dịch kiểm tra

 Rót chừng 3 ml dung dịch nghiên cứu ra một đĩa đồng hồ, dùng một đĩa khác để rót một trong các dung dịch kiểm tra với thể tích như trên

 Lấy một mao quản, cầm nghiêng và nhúng một đầu vào đĩa đựng dung dịch kiểm tra,

do có hiện tượng mao dẫn dung dịch sẽ từ từ dâng lên trong mao quản Khi chất lỏng dâng lên đến giữa mao quản thì nhấc ra khỏi đĩa đồng hồ, quay ngược cho chất lỏng chảy sang đầu kia của mao quản, khi mực chất lỏng cách đầu mút mao quản chừng 1 – 1,5 mm thì lập tức nhúng vào đĩa đồng hồ đựng dung dịch nghiên cứu Dung dịch này sẽ dâng lên đẩy dung dịch kiểm tra trở về vị trí ban đầu và tạo thành bọt khí ở giữa

 Đặt mao quản lên lam kính (nhớ ghi ký hiệu để không bị nhầm lẫn dung dịch ở hai đầu mao quản) Hơ trên đèn cồn cho paraphin nóng chảy rồi dùng nó để gắn kín hai đầu của mao quản lại ta được một tiêu bản để quan sát trên kính hiển vi (hình 11a, hình 11b)

Bước 3 Quan sát sự chuyển động của bọt khí

 Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi, chỉnh kính và tiêu bản sao cho một trong hai mép của bọt khí (có hình vòng cung) trùng với điểm giao nhau của hai đường chéo trong hiển vi trường rồi theo dõi hướng chuyển động của vòng cung bọt khí (xem hình 11.b) Bọt khí ở giữa hai dung dịch có nồng độ khác nhau trong mao quản bao giờ cũng chuyển động về phía có nồng độ thấp hơn (cần lưu ý rằng hướng chuyển động quan sát dưới hính hiển vi ngược chiều với thực tế) Dựa vào hướng chuyển động của vòng cung ta biết được dung dịch kiểm tra (đã biết trước nồng độ) có nồng độ lớn hơn hay bé hơn dung dịch nghiên cứu

 Ghi lại kết quả theo hướng dẫn ở bảng 1 Tiến hành tương tự với các dung dịch kiểm tra khác cho đến khi vòng cung bọt khí đứng im, không dịch chuyển khỏi vị trí ban đầu Nồng độ dung dịch nghiên cứu có giá trị đúng bằng nồng độ của dung dịch kiểm tra đó (trong ví dụ ở bảng 1 là 0,5%)

Hình 4-2 a Tiêu bản mao quản dùng để quan sát sự chuyển động của bọt khí

b Vòng cung bọt khí trong hiển vi trường

Bước 4 Tính nồng độ áp suất thẩm thấu của dịch nghiên cứu

 Nồng độ % của dung dịch nghiên cứu được xác định được ở trên cần chuyển đổi thành nồng độ phân tử gam (mol)

Ví dụ: chuyển nồng độ 0,5% dung dịch NaCl ra mol: 5, 0

0, 085 mol58,5 