Góp phần phân lập scopolamine từ cà độc dược (datura metell ) họ cà (solanaceae)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA HỌC −−−−−− LÊ HỒNG THẮM LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƢỢC MSSV: 2102482 CẦN THƠ 11–2013 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA HỌC −−−−−− LÊ HỒNG THẮM GÓP PHẦN PHÂN LẬP SCOPOLAMINE TỪ CÀ ĐỘC DƢỢC (DATURA METEL L.), HỌ CÀ (SOLANACEAE) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƢỢC CÁN BỘ HƢỚNG DẪN TS. LÊ THANH PHƢỚC CẦN THƠ 11–2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Năm học 2013-2014 Đề tài: “GÓP PHẦN PHÂN LẬP SCOPOLAMINE TỪ CÀ ĐỘC DƢỢC DATURA METEL L., HỌ CÀ (SOLANACEAE)” LỜI CAM ĐOAN ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………. Cần thơ, ngày tháng năm 2013 Lê Hồng Thắm Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành: Hóa Dƣợc Đã bảo vệ đƣợc duyệt Hiệu trƣởng:…………………………. Trƣởng Khoa:…………………………. Trƣởng Chuyên ngành Cán hƣớng dẫn TS. Lê Thanh Phƣớc Trƣờng Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự – Hạnh phúc Khoa Khoa Học Tự Nhiên Bộ Môn Hóa Học NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 1. Cán hƣớng dẫn: TS. Lê Thanh Phƣớc Đề tài: Góp phần phân lập scopolamine từ Cà độc dƣợc (Datura metel L.), họ Cà (Solanaceae). 2. Sinh viên thực hiện: Lê Hồng Thắm MSSV: 2102482 Lớp: Hóa dƣợc Khóa: 36 3. Nội dung nhận xét: a. Nhận xét hình thức LVTN: . b. Nhận xét nội dung LVTN ( Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực đề tài: .  Những vấn đề hạn chế: . c. Nhận xét sinh viên tham gia đề tài (ghi rõ nội dung sinh viên chịu trách nhiệm thực có): . d. Kết luận, đề nghị điểm: . Cần Thơ, ngày….tháng….năm 2013 Cán hƣớng dẫn Lê Thanh Phƣớc Trƣờng Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập – Tự – Hạnh phúc Bộ Môn Hóa Học NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN 4. Cán chấm phản biện: Đề tài: Góp phần phân lập scopolamine từ Cà độc dƣợc (Datura metel L.), họ Cà (Solanaceae). 5. Sinh viên thực hiện: Lê Hồng Thắm MSSV: 2102482 Lớp: Hóa dƣợc Khóa: 36 6. Nội dung nhận xét: e. Nhận xét hình thức LVTN: . f. Nhận xét nội dung LVTN ( Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực đề tài: .  Những vấn đề hạn chế: . g. Nhận xét sinh viên tham gia đề tài (ghi rõ nội dung sinh viên chịu trách nhiệm thực có): . h. Kết luận, đề nghị điểm: . Cần Thơ, ngày….tháng….năm 2013 Cán phản biện LỜI CẢM ƠN Quá trình thực luận văn giúp em học hỏi đƣợc nhiều kiến thức bổ ích, nhiều kỹ kinh nghiệm thực tế hỗ trợ tốt cho công viêc sau này. Để đạt đƣợc kết nhƣ ngày hôm nhờ giúp đỡ nhiệt tình thầy cô, giai đình, bạn bè. Em xin chân thành cảm ơn: Các thầy cô khoa Khoc học Tự nhiên, thầy cô Bộ môn Hóa cô vấn học tập thầy Ngoan, thầy cô dẫn dắt lớp chúng em trãi qua năm dài quãng đƣờng đại học, tận tình giúp đỡ chúng em học tập dạy cho chúng em kiến thức chuyên nghành thật bổ ích giúp chúng em vững chãi bƣớc đƣờng đời. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đết thầy Lê Thanh Phƣớc, thầy tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm quý báu giúp đỡ em suốt thời gian qua. Em chân thành cảm ơn anh Lê Văn Nhã Phƣơng anh Dƣơng Hoàng Long anh chị công ty Cổ phần Xuất nhập Y tế Domesco tận tình bảo giúp em có hội tiếp cận công việc thực tế, mở rộng kiến thức chuyên ngành. Cuối cùng, em cảm ơn gia đình bạn lớp Hóa Dƣợc K36 động viên giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn ! MỤC LỤC Lời cảm ơn Mục lục Danh mục hình Danh mục bảng Danh mục từ viết tắt Tóm tắt CHƢƠNG GIỚI THIỆU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 2.1 Tổng quan thực vật học 2.1.1 Khái quát họ Cà (Solanaceae) . 2.1.2 Giới thiệu Cà độc dƣợc (Datura metel L.) 2.1.3 Thực vật học . 2.1.4 Hình thái thực vật . 2.1.5 Sinh thái phân bố trồng hái 2.1.6 Thành phần hóa học . 2.1.7 Tác dụng dƣợc lý 2.2 Sợ lƣợc alkaloid . 2.2.1 Các đặc tính hóa lý alkaloid . 2.2.2 Một vài nhóm cấu trúc alkaloid 2.2.3 Phƣơng pháp chiết tách alkaloid khỏi . 2.3 Giới thiệu hợp chất scopolamine . 2.4 Một vài nghiên cứu khoa học Cà độc dƣợc (Datura metel L.) . 2.5 Cơ sở lý thuyết số phƣơng pháp thực nghiệm 10 2.5.1 Kỹ thuật chiết ngâm dầm 10 2.5.2 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng . 11 2.2 Phƣơng pháp sắc ký . 12 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Các phƣơng tiện . 20 3.1.1 Dung môi, hóa chất 20 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị . 20 3.1.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hàm lƣợng . 20 3.1.4 Nguồn gốc nguyên liệu . 21 3.1.5 Thời gian địa điểm thực đề tài . 21 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.2.1 Phƣơng pháp tách chiết 21 3.2.2 Phƣơng pháp phân lập 22 3.3.1 Quá trình điều chế thu cao 25 3.3.2 Phân lập scopolamine từ cao C 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Quá trình điều chế loại cao 23 4.1.1 Quá trình điều chế thu cao ethanol . 23 4.1.2 Quá trình điều chế cao chloroform (cao C) 23 4.2 Phân lập scopolamine từ cao C 25 4.2.1 Khảo sát SKLM từ cao C . 25 4.2.2 Xử lý phân đoạn SC1 . 28 4.2.3 Xử lý phân đoạn SC2 . 28 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 32 5.1 Kết luận 30 5.2 Kiến nghị 30 Tài liệu tham khảo 31 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 2.4 Hình 2.5 Hình 2.6 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 4.1 Hình 4.2 Hình 4.3 Hình 4.4 Hình 4.5 Hình 4.6 Hình 4.7 Hình 4.8 Hình 4.9 Cây Cà độc dƣợc (Datura metel L.) . Vị trí Cà độc dƣợc hệ thống phân loại thực . Cây Cà độc dƣợc . Công thức scopolamine Cách tính giá trị Rf 13 Cấu trúc mạng silica gel . 14 Lá Cà độc dƣợc khô 21 Qui trình điều chế loại cao . 22 Cao ethanol từ Cà độc dƣợc 23 Sơ đồ điều chế cao ethanol cao C từ Cà độc dƣợc . 25 SKLM scopolamine chuẩn so với cao C 26 SKLM cao C . 26 SKC cao C 27 SKLM phân đoạn SC1 27 SCK phân đoạn SC1 . 28 SKLM phân đoạn SC2 28 SKLM scopolamine chuẩn phân đoạn SC3 . 28 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số khung alkaloid Bảng 2.2 Màu vết hợp chất hữu thuốc thử 16 Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng . 20  Phương pháp hóa học Phát thuốc thử đặc trƣng: Bảng 2.2 Màu vết hợp chất hữu thuốc thử[5] Thuốc thử Hơi I2 H2SO4đđ H2SO4đđ H2SO4đđ FeCl3 Mayer Dragendorff Màu vết Vàng nâu Vàng đậm đến da cam Màu đỏ xanh dƣơng-đỏ Màu cam đến đỏ Xanh lục đến xanh đen Màu vàng nhạt Màu đỏ cam Hợp chất Hợp chất hữu nói chung Flavone, Flavonol Chalcone, aurone Flavonoid Sesquiterpen Alkaloid Alkaloid Cách tiến hành: Bản mỏng sau giải ly xong, sấy khô. Nếu hình I2 đặt mỏng bình chứa I2. Nếu hình dung dịch FeCl3, H2SO4 hay Dragendorff nhúng mỏng vào lọ chứa dung dịch đó, lấy lắc nhẹ cho thuốc thử chảy xuống hết. Tiến hành nƣớng mỏng máy sấy hay bếp điện, vết màu lên, dùng băng keo dán mỏng lại để mỏng không bị vỡ để tiện cho quan sát lần sau. Trên mỏng phải ghi rõ dung môi hệ dung môi giải ly. e. Các công dụng SKLM Kỹ thuật SKLM công cụ cần thiết ngành hóa hữu cơ, đặc biệt hóa học hợp chất thiên nhiên. Một số công dụng sắc ký lớp mỏng:  Để công bố đặc điểm hợp chất vừa chiết tách, cô lập đƣợc  Để kiểm tra xem hai hợp chất có giống hay không  Để tìm hiểu sơ tính chất mẫu chất cần khảo sát  Để chuẩn bị cho việc sắc ký cột  Để theo dõi diễn tiến phản ứng tổng hợp hữu  Để kiểm tra hợp chất có bền  Để cô lập hợp chất (sắc ký lớp mỏng điều chế) 2.5.3.2 Phƣơng pháp sắc ký cột a. Giới thiệu phƣơng pháp sắc ký cột Sắc ký cột (SKC) phƣơng pháp cổ điển để tách cấu tử hóa học khỏi hỗn hợp chúng. Nếu lựa chọn điều kiện, ngƣời ta tách hầu hết chất hỗn hợp nào. Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến khả tách chúng ra, bao gồm:  Sự lựa chọn chất hấp phụ  Sự lựa chọn dung môi giải ly  Kích thƣớc cột sắc ký, số lƣợng chất hấp phụ, lƣợng mẫu chất đƣợc dung  Vận tốc giải ly Sắc ký cột hở đƣợc tiến hành điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thƣờng hạt silica gel có kích thƣớc tƣơng đối lớn (50-150 μm) đƣợc nạp cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tách đƣợc đặt phần đầu cột, phía pha tĩnh (có lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly đƣợc đặt phía cao. Dung môi giải ly khỏi cột phần bên dƣới cột, đƣợc hứng vào lọ đặt ống dẫn cột. Hệ thống nhƣ thƣờng làm cho tách chậm, hiệu tách thấp so với HPLC. Tuy vậy, sắc ký cột hở có ƣu điểm nhƣ pha tĩnh dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm; triển khai với lƣợng lớn mẫu chất. b. Lựa chọn dung môi để khởi đầu giải ly Các hệ dung môi dùng cho SKLM ứng dụng vào SKC. Tuy vậy, dung môi có độ sôi thấp có mùi khó chịu độc không nên dùng làm dung môi giải ly cột. Trƣớc triển khai SKC, thiết phải sử dụng SKLM để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp. Sau chọn đƣợc áp dụng hệ dung môi cho sắc ký cột. Cần phải chỉnh tỉ lệ dung môi cho có tính phân cực so với hệ dung môi chọn. Thông thƣờng nên bắt đầu dung môi không phân cực để loại cách tƣơng đối hợp chất không phân cực khỏi cột kế dung môi giải ly đƣợc tăng dần độ phân cực để đuổi hợp chất có tính phân cực hơn. Muốn thay đổi dung môi có tính phân cực hơn, phải thay đổi cách cho thêm vào lần vài phần trăm lƣợng dung môi có tính phân cực vào dung môi giải ly. Nếu cho thêm vào đột ngột làm gãy cột silica gel đƣợc trộn với dung môi tạo nhiệt, nhiệt làm cho dung môi bốc cách cục bộ, sinh tạo bọt khí làm nứt, gãy cột, cột gãy làm khả tách cột đi. Thông thƣờng, hợp chất không phân cực di chuyển nhanh đƣợc giải ly khỏi cột trƣớc hợp chất phân cực di chuyển chậm (khối lƣợng phân tử liên quan đến thứ tự giải ly, hợp chất không phân cực có khối lƣợng phân tử lớn di chuyển chậm hợp chất không phân cực có khối lƣợng phân tử nhỏ hơn). c. Kích thƣớc cột sắc ký lƣợng chất hấp phụ  Tỷ lệ lƣợng mẫu cần tách lƣợng chất hấp phụ sử dụng Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách tốt trọng lƣợng chất hấp phụ phải lớn 25-50 lần trọng lƣợng mẫu cần sắc ký (tính theo trọng lƣợng). Tuy nhiên, với hỗn hợp hợp chất khó tách riêng cần sử dụng số lƣợng lớn chất hấp phụ nhiều (lớn 100-200 lần), với hỗn hợp dễ tách sử dụng chất hấp phụ hơn.  Tỷ lệ chiều cao chất hấp thu cột đƣờng kính cột sắc ký Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt, chiều cao chất hấp phụ nạp cột cần đạt tỷ lệ: chiều cao chất hấp phụ: đƣờng kính cột vào khoảng (10:1). Muốn biết lƣợng chất hấp phụ có phù hợp với cột cho chất hấp phụ khô vào cột để quan sát. d. Kỹ thuật nạp mẫu vào đầu cột Có hai cách để nạp mẫu chất cần tách lên đầu cột: nạp mẫu chất dạng dung dịch nạp mẫu chất dạng bột khô.  Nạp mẫu chất dạng dung dịch Để nạp mẫu vào cột, phải theo tiến trình sau đây: mở khóa cột để hạ mực dung môi xuống sát với mực chất hấp phụ có cột, khóa cột lại, dùng ống nhỏ giọt để hút dung dịch mẫu cho vào đầu cột thật chậm. Từ từ mở khóa cột dung dịch mẫu thấm xuống bề mặt chất hấp phụ đầu cột, lúc thấy mức dung dịch xuống sát mực chất hấp phụ khóa cột lại, dung dịch không chạy nữa; tiếp tục nạp cho hết lƣợng mẫu chất vào đầu cột. Mở khóa để hạ mực dung dịch mẫu xuống sát mặt thoáng chất hấp phụ, khóa lại, dùng ống nhỏ giọt cho lƣợng nhỏ 5-10 mL dung môi bắt đầu rửa giải vào đầu cột lại mở khóa để dung dịch chảy ra.  Nạp mẫu dạng bột khô Nếu chất mẫu không tan dung môi loại dung môi lựa chọn để bắt đầu trình giải ly cột, loại dung môi phân cực, thay phải hòa tan mẫu dung môi phân cực ảnh hƣởng vào trình giải ly, nạp mẫu “khô”. Trong bình cầu dùng để cô quay, mẫu chất cần sắc ký (x g) đƣợc hòa tan dung môi nhƣ ethyl acetate methanol (50x g), cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn (10x g). Hỗn hợp đƣợc cô quay chân không đến có bột silica gel khô, giờ, mẫu cần sắc ký đƣợc tẩm lên bề mặt hạt silica gel. Đặt mẫu bột khô lên đầu cột, dùng dung môi (loại lựa chọn để bắt đầu trình sắc ký cột), thấm ƣớt phần bột silica gel. Cho lớp cát dày khoảng 3-6 mm đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. Cuối cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu trình giải ly. e. Theo dõi trình giải ly cột Đối với mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, ta theo dõi trình giải ly mắt thƣờng, nhờ nhìn thấy dãy lớp có màu sắc ký khác nhau, tách xa ra. Theo dõi dãy màu hứng chúng đƣợc giải ly khỏi cột. Nhƣng đa số hợp chất hữu thƣờng màu, nên dung dịch giải ly suốt không màu; ta phải theo dõi cách khác nhau. Phƣơng pháp thông dụng hứng dung dịch giải ly lọ có đánh số thứ tự. Hứng lọ thể tích nhƣ nhau. Nên pha lƣợng lớn dung môi giải ly để hạn chế sai lệch nồng độ lọ. Dung dịch lọ hứng đƣợc SKLM mỏng. Những lọ có kết SKLM giống (giống nhƣng chứa nhiều hợp chất, hỗn hợp) đƣợc gom chung lại với thành phân đoạn. Đuổi dung môi áp suất phân đoạn cho cao phân đoạn đó. f. Thay đổi hệ dung môi giải ly cột SKC đƣợc khởi đầu loại dung môi kết sắc ký cao ban đầu. Thí dụ khởi đầu SKC ether dầu hỏa, tiếp tục giải ly lọ cuối cùng, hứng dung dịch giải ly ra, đuổi hết dung môi khỏi lọ này, cân lại không thấy có cặn cặn không đáng kể, đuổi bớt dung môi chấm sắc ký lớp mỏng mà không vết nữa. Điều có nghĩa dung môi ete dầu hỏa lôi hết khỏi cột hợp chất không phân cực cao nạp đầu cột. Tiếp theo, cần tăng thêm độ phân cực cho dung môi giải ly để tiếp tục trình SKC. Lần lƣợt giải ly từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực. CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Các phƣơng tiện 3.1.1 Dung môi, hóa chất Dung môi hóa chất sử dụng thực đề tài đƣợc liệt kê bảng sau: Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng Tên hóa chất Ethanol 96 Ether dầu hỏa (PE) Chloroform Ethyl acetate (EA) Methanol (Me) Na2SO4 khan H2SO4 Dd NH3 30% Nƣớc cất Silica gel 60 F254 Bản SKLM Nƣớc sản xuất Việt Nam Việt Nam, Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung quốc Trung quốc Trung quốc Việt Nam Merck Merck 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị Dụng cụ, thiết bị:  Tủ sấy  Máy cô quay Buchi  Bếp từ  Phễu chiết  Bình lóng  Cột sắc ký  Ống mao quản, giấy lọc  Cốc thủy tinh, bình tam giác, ống đong, pipet, lọ thủy tinh, đũa thủy tinh,… 3.1.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hàm lƣợng  Chạy SKLM với chất chuẩn, dùng thuốc thử đặc trƣng, so sánh vết mỏng để định tính có diện chất.  Xác định hàm lƣợng kiểm tinh khiết phƣơng pháp HPLC. 3.1.4 Nguồn gốc nguyên liệu Lá Cà độc dƣợc đƣợc thu mua tỉnh Tiền Giang vào tháng năm 2013. Lá dạng khô, cắt nhỏ khoảng 1-1,5 cm. Hình 3.1 Lá Cà độc dƣợc khô 3.1.5 Thời gian địa điểm thực đề tài  Thời gian: tháng 08/2013 đến tháng 11/2013.  Địa điểm: Phòng RD (Research Development), nhà máy Dƣợc Liệu, Công ty Cổ phần Xuất nhập Y tế Domesco, tỉnh Đồng Tháp. 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Phƣơng pháp tách chiết Nguyên liệu đƣợc chiết ethanol phƣơng pháp ngâm dầm, lần ngâm khoảng 24 thu đƣợc dịch chiết. Dịch chiết lần ngâm đƣợc gom lại cô quay đuổi dung môi thu đƣợc cao ethanol tổng. Điều chế cao chloroform phƣơng pháp chiết lỏng-lỏng, sơ đồ điều chế loại cao: Nguyên liệu khô Ngâm dầm với ethanol 96 Dịch chiết cô quay đuổi dung môi Cao ethanol tổng Acid hóa cao ethanol tổng Chiết lỏng-lỏng với PE, chloroform Dịch chiết PE, chloroform Dịch nƣớc acid Kiềm hóa Chiết lỏng-lỏng với chloroform Cao chloroform Hình 3.2 Qui trình điều chế loại cao 3.2.2 Phƣơng pháp phân lập Sử dụng phƣơng pháp SKC để tách chất, dò tìm hệ dung môi giải ly cột kiểm tra trình SKC nhƣ mức độ tinh hợp chất SKLM so với chất chuẩn. CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Quá trình điều chế loại cao 4.1.1 Quá trình điều chế thu cao ethanol Mẫu nguyên liệu Cà độc dƣợc khô đƣợc ngâm ethanol 96 với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi 1:4. Sau thời gian khoảng 24 giờ/mỗi lần ngâm thu lấy dịch chiết, lọc dịch chiết máy lọc áp suất thấp đem cô quay thu hồi dung môi. Cứ lặp lại trình thêm lần nữa. Sau đó, gom tất lần thu cao lại đƣợc cao ethanol có màu xanh đen. (Hình 4.1) Cao ethanol tổng đƣợc gửi Phòng kiểm nghiệm xác định hàm lƣợng sopolamine phƣơng pháp HPLC. Hình 4.1 Cao ethanol từ Cà độc dƣợc 4.1.2 Quá trình điều chế cao chloroform (cao C) Cao ethanol thu đƣợc sử dụng cho trình điều chế cao C bƣớc sau:  Acid hóa cao ethanol (chuyển alkaloid sang dạng muối) Cho hết lƣợng cao ethanol vào cốc 1000 mL, thêm từ từ dung dịch acid H2SO4 1N vào cốc đựng cao, khuấy thử giấy đo pH vạn đến pH hỗn hợp khoảng 2-3 ngừng cho acid, đun ấm thêm nƣớc cất để hòa tan hết cao. Hỗn hợp đƣợc lọc máy lọc áp suất thấp tận chiết lần lƣợt với dung môi PE, chloroform để loại bớt tạp. Chuẩn bị bình lóng 1000 mL đặt giá đỡ, mở nắp khóa van lại. Cho lần 400 mL hỗn hợp cao đƣợc acid hóa cho vào bình lóng, tiếp tục cho thêm dung môi PE vào bình khoảng 300-400 mL/lần chiết. Đóng nắp bình lại, lắc để bình lóng yên giá đỡ khoảng 15-20 phút để hỗn hợp bình lóng tách thành hai lớp: lớp dƣới màu nâu sậm lớp màu xanh đen. Mở van, phần dung dịch màu nâu chảy sệt dung dịch chất lỏng màu xanh đen lần lƣợt chảy đƣợc hứng riêng cốc. Lấy lớp dƣới tiếp tục chiết với PE màu lớp PE nhạt dần kiểm tra SKLM. Nếu thấy không vết chứng tỏ chất đƣợc trích hoàn toàn vào dung môi PE, sau gom lớp PE lần chiết lại cô quay thu hồi dung môi. Tƣơng tự, phần dịch nƣớc màu nâu sậm đƣợc chiết loại tạp tiếp với dung môi chloroform (300-400 mL/lần chiết). Lắc để yên khoảng 15-20 phút, hỗn hợp bình lóng lúc tách thành hai pha, khác biệt khối lƣợng riêng nên pha nƣớc nằm phía trên, pha hữu nằm phía dƣới. Tách lấy pha hữu cô quay thu hồi dung môi chloroform, pha nƣớc đƣợc hứng cốc riêng để tiến hành kiềm hóa.  Kiềm hóa pha nƣớc (chuyển alkaloid dạng base) Cho từ từ dd NH3 30% vào cốc đựng pha nƣớc, khuấy thử giấy đo pH vạn đến pH hỗn hợp khoảng 9-10 ngừng. Sau đó, hỗn hợp đƣợc chiết với dung môi chloroform, kiểm tra SKLM pha hữu phun thuốc thử đặc trƣng Dragendroff không thấy vết scopolamine dừng lại. Dịch chiết từ dung môi chloroform đƣợc loại nƣớc Na2SO4 khan, cô quay thu đƣợc cao C (gồm họ alkaloid dạng base chất tan chloroform) dung môi chloroform thu hồi. Cao C đƣợc gửi Phòng kiểm nghiệm để xác định hàm lƣợng scopolamine phƣơng pháp HPLC. SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Lá Cà độc dƣợc khô (1 kg) Ngâm dầm với ethanol 96 Dịch chiết đƣợc cô quay đuổi dung môi Cao ethanol tổng (250 g) Thêm H2SO4 1N đến pH=2-3, đun ấm Thêm nƣớc cất hòa tan hết cao, lọc Chiết lỏng-lỏng với PE, chloroform Dịch chiết PE, choloroform Dịch nƣớc acid Thêm dd NH3 30% đến pH=9-10 Chiết lỏng-lỏng với chloroform Làm khan, cô quay thu hồi dung môi Dịch nƣớc lại Cao C (3,8 g) Hình 4.2 Sơ đồ điều chế cao ethanol cao C từ Cà độc dƣợc 4.2 Phân lập scopolamine từ cao C 4.2.1 Khảo sát SKLM từ cao C SKLM cao C scopolamine chuẩn với hệ dung môi EA:Me:NH3 (9:1:0,5), thuốc thử Dragendorff, để quan sát hết toàn alkaloid cao C vị trí vết scopolamine so với alkaloid lại. Hình 4.3 SKLM scopolamine chuẩn so với cao C Tuy nhiên, hình thuốc thử đặc trƣng Dragendorff không thấy đƣợc chất tạp alkaloid. Để quan sát đầy đủ chất cao phải hình vết mỏng thuốc thử H2SO4 (H2SO4 đậm đặc 20% methanol). Với thuốc thử này, vết họ alkaloid màu vàng nâu. Hình 4.4 SKLM cao C SKLM cao C với nhiều hệ dung môi khác nhau, nhận thấy hệ dung môi PE-EA (80:20) đẩy vết tạp phân cực lên vị trí Rf ≤ 0,3 mỏng. Tiến hành SKC cao C có khối lƣợng 3,8 g với cột có đƣờng kính cm, sử dụng loại silica gel 60 GF254 khối lƣợng 80 g, dung môi giải ly PE, sau tăng dần độ phân cực dung môi với hệ PE:EA. Hứng dung dịch giải ly khỏi cột với thể tích lần 50 mL. Theo dõi trình giải ly cột SKLM, gom lọ bi có SKLM vết scopolamine cô quay đuổi dung môi. Đặt tên phân đoạn có scopolamine SC1, có khối lƣợng 2,01 g. Phân đoạn SC1 đƣợc SKLM hình thuốc thử H2SO4, cho vết scopolamine màu vàng nâu kèm theo nhiều tạp màu xám đen. Hình 4.5 SKC cao C Hình 4.6 SKLM phân đoạn SC1 4.2.2 Xử lý phân đoạn SC1 Tiến hành SKC phân đoạn SC1 có khối lƣợng 2,01 g với cột có đƣờng kính 2,5 cm 40 g silica gel. Giải ly cột với dung môi C tăng dần độ phân cực dung môi với hệ C:EA. Hứng dung dịch giải ly khỏi cột với thể tích lần 20 mL. Theo dõi trình giải ly cột SKLM, gom lọ bi có SKLM vết scopolamine cô quay đuổi dung môi thu đƣợc phân đoạn SC2 với khối lƣợng 0,92 g. Tiến hành SKLM phân đoạn SC2 cho vết scopolamine màu vàng nâu, nhiên tạp kéo đuôi. Do đó, tiếp tục SKC phân đoạn này, hy vọng phân lập đƣợc scopolamine tinh hơn. Hình 4.7 SKC phân đoạn SC1 Hình 4.8 SKLM phân đoạn SC2 4.2.3 Xử lý phân đoạn SC2 Tiến hành SKC phân đoạn SC2 có khối lƣợng 0,92 g, sử dụng buret 25 mL có đƣờng kính cm (thay cho cột sắc ký đƣờng kính cm) 15 g silica gel. Giải ly cột với hệ dung môi C:EA (30:70) tăng dần độ phân cực. Hứng dung dịch giải ly khỏi cột với thể tích lần 10 mL. Theo dõi trình giải ly cột SKLM, gom lọ bi có SKLM vết scopolamine cô quay đuổi dung môi đƣợc phân đoạn SC3 có khối lƣợng 660 mg. Kiểm tra lại phân đoạn SC3 SKLM so với scopolamine chuẩn, cho thấy vết giống Rf màu sắc. Hình 4.9 SKLM scopolamine chuẩn phân đoạn SC3 Phân đoạn SC3 chất lỏng sệt, màu trắng, tan chloroform, ethanol, không tan PE nƣớc. CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Bƣớc đầu phân lập đƣợc scopolamine từ cà độc dƣợc (Datura metel L.), thu đƣợc kết sau:  Hàm lƣợng scopolamine nguyên liệu khô (đƣợc kiểm tra phƣơng pháp HPLC) 0,124%.  Một kg nguyên liệu khô điều chế đƣợc 250 g cao ethanol tổng phƣơng pháp ngâm dầm, hàm lƣợng scopolamine cao tổng 0,374%, hiệu suất chiết scopolamine giai đoạn nguyên liệu-cao ethanol 75,4%.  Điều chế cao chloroform từ cao ethanol với khối lƣợng 3,8 g, hàm lƣợng sopolamine cao choloroform 21%, hiệu suất chiết scopolamine giai đoạn nguyên liệu-cao chloroform 64,4%.  Đã tiến hành SKC 3,8 g cao C, thu đƣợc phân đoạn có scopolamine (SC3) có khối lƣợng 660 mg. Hiệu suất trình chiết scopolamine từ Cà độc dƣợc 53,2%. 5.2 Kiến nghị  Nghiên cứu tách chiết scopolamine hệ thống CO2 siêu tới hạn  Kiểm tra phân đoạn SC3 HPLC IR để có đƣợc đánh giá xác  Bán tổng hợp scopolamine tạo số dẫn xuất:  Scopolamine hydrobromide (C17H21NO4.HBr.3H2O);  Scopolamine hydrochloride (C17H21NO4.HCl);  Scopolamine methylnitrate (C17H21NO4.CH3NO3). TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Tất Lợi, 2004. Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học. [2] http://vi.wikipedia.org/wiki/Họ-Cà, truy cập ngày 24-10-2013. [3] http://www.duoclieu.org/2012/02/ca-oc-duoc-datura-metel-l-ho-ca.html, truy cập ngày 18-10-2013. [4] Tôn Nữ Liên Hƣơng, 2008. Nghiên cứu hợp chất thiên nhiên, Giáo trình đại học, khoa Khoa học Tự Nhiên, trƣờng Đại học Cần Thơ. [5] Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. [6] http://www.drugfuture.com/chemdata/scopolamine.html, truy cập ngày 12-08-2013. [7] Varahalarao Vadlapudi D.S.V.G.K.Kaladhar, 2012. Antimicrobial study of plant extracts of Datura metelL. against some important disease causing pathogens, Asian Pacific Journal of Tropical Disease, S94-S97. [8] Bing-You Yang, Yong-Gang Xia, Qiu-Hong Wang, De-Qiang Dou, Hai-Xue Kuang, 2010. Two new amide alkaloids from theflower of Datura metelL., Fitoterapia, 81: 1003-1005. [9] Avaratnarajah Kuganathan Sashikesh Ganeshalingam, 2010. Chemical Analysis of Datura Metel Leaves and Investigation of the Acute Toxicity on Grasshoppers and Red Ants, E-Journal of Chemistry, 8(1): 107-112. [10] Nguyễn Thị Diệp Chi, 2008. Bài giảng phương pháp phân tích đại, Đại học Cần Thơ. [...]... scopolamine từ Cà đôc dƣợc (Datura metel L .), họ Cà (Solanaceae) CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan thực vật học 2.1.1 Khái quát về họ Cà (Solanaceae) Họ Cà hay còn đƣợc gọi là họ Khoai tây là một họ thực vật có hoa Tên gọi khoa học của họ này có nguồn gốc từ tiếng Latinh Solanum nghĩa là “cây cà dƣợc” Họ này bao gồm Cà độc dƣợc (chi Datura), cà tím, khoai ma, cà dƣợc (benlađôn), ớt, khoai... Cà độc dƣợc (Datura metel L .) Hình 2.1 Cây Cà độc dƣợc (Datura metel L .) Cây Cà độc dƣợc, tên khoa học là Datura metel L., thuộc họ Cà (Solanaceae) Tên gọi khác: Cây cà dƣợc, cà diên, cà lục dƣợc (Tày), mạn đà la, sùa tùa (H’mông), hìa kìa piếu (Dao) 2.1.3 Thực vật học Vị trí trong hệ thống phân loại thực vật: Giới: Thực vật bật cao (Không phân hạng) Angiospermae (Không phân hạng) Eudicots (Không phân. .. hạng) Asterids Bộ: Solanales Họ: Cà (Solanaceae) Chi: Datura Loài: D metel Hình 2.2 Vị trí của Cà độc dƣợc trong bản hệ thống phân loại thực vật 2.1.4 Hình thái thực vật Căn cứ vào màu sắc của hoa và thân ngƣời ta chia ra nhiều dạng Cà độc dƣợc Ở nƣớc ta có 3 loại Cà độc dƣợc: Cà độc dƣợc với hoa trắng, thân xanh, cành xanh (Datura metel L forma alba), Cà độc dƣợc với hoa đốm tím, cành và thân tím (Datura. .. là scopolamine Scopolamine là chất chống tiết cholin (anticholinergic) và tác động lên hệ thẩn kinh trung ƣơng Trong y học, nó đƣợc sử dụng ở liều tƣơng đối, sử dụng chính trong điều trị say tàu xe và buồn nôn và nôn sau phẫu thuật Với mong muốn tìm ra phƣơng pháp phân lập hợp chất scopolamine, đề tài đƣợc chọn để thực hiện là Góp phần phân lập scopolamine từ Cà đôc dƣợc (Datura metel L .), họ Cà (Solanaceae) ... thuật, Cà độc đƣợc mọc hoang và đƣợc trồng khá phổ biến ở nƣớc ta, với nguồn nguyên liệu dồi dào rất thuận lợi để có thể nghiên cứu ứng dụng vào y học trong tƣơng lai Tuy nhiên, ở nƣớc ta chƣa có nhiều nghiên cứu về cây Cà độc dƣợc cũng nhƣ nghiên cứu phân lập hợp chất có giá trị về y học này Với mong muốn bƣớc đầu phân lập hợp chất scopolamine, đề tài đƣợc chọn để thực hiện là Góp phần phân lập scopolamine. .. MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT SKLM SKC HPLC PE C EA Me Rf Dd Sắc ký lớp mỏng Sắc ký cột High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) Ether dầu hỏa 60-90C Chloroform Ethyl acetate Methanol Retention factor Dung dịch TÓM TẮT Cà độc dƣợc (có tên khoa học là Datura metel L .) thuộc họ Cà (Solanaceae), là loại cây mọc hoang và đƣợc trồng khắp nơi ở nƣớc ta Thành phần hóa học của Cà độc dƣợc... (Solanaceae) Phƣơng pháp chiết lỏng lỏng đƣợc thực hiện để điều chế cao chloroform ở pH 9-10 từ cao ethanol Việc tách scopolamine đƣợc thực hiện bằng sắc ký cột Hàm lƣợng scopolamine trong Cà độc dƣợc, cao ethanol đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HPLC Hàm lƣợng scopolamine trong nguyên liệu (lá Cà độc dƣợc kh ) là 1,24% Khối lƣợng scopolamine thu đƣợc từ quá trình sắc ký cột là 660 mg Hiệu suất chiết scopolamine. .. cứu tìm hiểu về những thảo dƣợc nói chung và cây Cà độc dƣợc nói riêng Việc nghiên cứu và phân lập các hợp chất có hoạt tính chữa bệnh trong Cà độc dƣợc đã đƣợc thực hiện nhiều trên thế giới Hợp chất scopolamine trong Cà độc dƣợc đƣợc phân lập thành công và đƣợc ứng dụng trong y học với nhiều dạng thuốc nhƣ: dạng miếng dáng chống say tàu xe, dạng dẫn xuất scopolamine hydrobromine viên nén và dung dịch... Dou, Hai-Xue Kuang (201 0) đã phân lập đƣợc hai alkaloid mới từ Datura metel L là (E)-methyl 4-(3-(4-hydroxyphenyl)-N-methylacrylamido) butanoate và 6,7-dimethyl-1-D-ribityl-quinoxaline-2,3(1H,4H)-dione-5′O-β-D-glucopyranoside.[8]  Avaratnarajah Kuganathan và Sashikesh Ganeshalingam (201 0) đã tiến hành phân tích thành phần vô cơ và hữu cơ trong lá Datura metel L và nghiên cứu độc tính ở nhiều nồng độ... ban đầu  Phân chia cao alcol thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau Nguyên tắc của sự chiết lỏng-lỏng là dung môi không phân cực (thí dụ petroleum ether) sẽ hoà tan tốt các hợp chất không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo, ), dung môi phân cực trung bình (thí dụ diethyl ether, dichlorometane, ) hòa tan . CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 2. 1 Tổng quan thực vật học 2 2. 1.1 Khái quát về họ Cà (Solanaceae) 2 2. 1 .2 Giới thiệu về cây Cà độc dƣợc (Datura metel L.) 2 2. 1.3 Thực vật học 3 2. 1.4. cứu 21 3 .2. 1 Phƣơng pháp tách chiết 21 3 .2. 2 Phƣơng pháp phân lập 22 3.3.1 Quá trình điều chế thu cao 25 3.3 .2 Phân lập scopolamine từ cao C 27 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 . thực vật 4 2. 1.5 Sinh thái phân bố và trồng hái 5 2. 1.6 Thành phần hóa học 5 2. 1.7 Tác dụng dƣợc lý 5 2. 2 Sợ lƣợc về alkaloid 6 2. 2.1 Các đặc tính hóa lý của alkaloid 6 2. 2 .2 Một vài