ứng dụng nấm men phân lập lên men rượu vang mít

Trong đó, dòng nấm men TD3 được phân lập từ dịch ép quả mít LMTN, có bổ sung đường, mẫu thu tại Tiền Giang được tuyển chọn, dòng này thể hiện hoạt lực lên men rượu tốt nhất như thời gian

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

RƯỢU VANG MÍT

LỚP:CNSH K36

Cần Thơ, Tháng 12/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

PGs.Ts Nguyễn Văn Thành Phan Lê Nhân DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày 11 tháng 12 năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Cần Thơ, Ban Giám đốc viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã tận tình giảng dạy tôi trong thời gian học tập vừa qua

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGs.Ts Nguyễn Văn Thành – người thầy

đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài

Xin cảm ơn cố vấn học tập – cô Bùi Thị Minh Diệu – người đã luôn giúp đỡ, động viên tôi khi tôi gặp khó khăn trong học tập

Chân thành cảm ơn anh Huỳnh Xuân Phong, anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Phạm Hồng Quang – cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học thực phẩm, các anh chị cán bộ các phòng thí nghiệm của viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ và tận tình giúp đỡ cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin ghi ơn gia đình và tất cả bạn bè lớp CNSH K36, các anh chị cao học K19

đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Kính chúc quý thầy cô được nhiều sức khỏe và luôn có những cống hiến quý báu cho sự nghiệp giáo dục và đào tạo

Xin chân thành cảm ơn!

TÓM TẮT

Với mục đích tìm ra dòng nấm men thuần chủng có đặc tính lên men rượu cao

từ nước ép quả mít cũng như góp phần làm đa dạng sản phẩm rượu vang và tăng thu nhập cho người dân Đề tài ‘’Ứng dụng nấm men phân lập để lên men rượu vang mít’’

quả mít (lên men tự nhiên (LMTN) không bổ sung đường và LMTN có bổ sung đường) Trong đó, dòng nấm men TD3 được phân lập từ dịch ép quả mít LMTN, có bổ sung đường, mẫu thu tại Tiền Giang được tuyển chọn, dòng này thể hiện hoạt lực lên men rượu tốt nhất như thời gian lên men làm đầy cột khí CO 2 trong ống Durham sớm nhất (10 giờ), hàm lượng ethanol cao nhất (11,94% v/v) Rượu vang mít lên men từ dòng nấm men tuyển chọn với dịch phối chế ban đầu 24 o

Brix, pH = 4,5 và mật số tế bào nấm men 10 5 tế bào/ml lên men ở nhiệt độ 28 – 30 o C trong 10 ngày cho kết quả độ cồn

(15,43 % v/v)

Từ khóa: rượu vang mít, phân lập, lên men, nấm men, trái mít, Saccharomyces cerevisiae.

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT v

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về nguyên liệu mít 2

2.1.1 Giới thiệu 2

2.1.2 Phân loại 3

2.1.3 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng 4

2.2 Giới thiệu về rượu vang 6

2.2.1 Định nghĩa rượu vang 7

2.2.2 9

2.3 10

2.3.1 10

2.3.2 14

2.3.3 Nam 14

2.3.4 Một số nghiên cứu về rượu vang 15

2.4 17

2.4.1 17

2.4.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men 18

2.4.3 Sự sinh sản của nấm men 19

2.4.4 Dinh 19

2.4.5 20

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

3.1 – 23

3.1.1 – 23

3.1.2 23

3.1.3 23

3.1.4 – 23

3.2 24

3.2.1 24

3.2.2 24

CHƯƠNG IV 31

4.1 Phân lập nấm men từ dịch quả mít lên men ở các địa điểm thu mẫu 31

4.2 Đặc điểm hình thái của những dòng nấm men đã phân lập 33

4.3 Khảo sát và tuyển chọn dòng nấm men có hoạt tính cao nhất từ các dòng phân lập 35

4.3.1 Kết quả chiều cao cột khí CO2 trong ống Durham 36

4.3.2 Khả năng lên men của nấm men phân lập với nấm men thị trường 37

4.4 Khảo sát ảnh hưởng của các nhân tố pH, độ Brix và mật số nấm men ban đầu đến quá trình lên men rượu vang mít 39

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45

5.1 Kết luận 45

5.2 Đề nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Phụ lục 3: Phương pháp đếm mật số nấm men

Phụ lục 4: số liệu thí nghiệm

Phụ lục 5: kết quả thống kê

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Thành phần của quả mít 4

Bảng 2 Bảng thành phần hóa học của mít 5

Bảng 3 Giá trị dinh dưỡng của mít (100g) 6

7

Bảng 5 Thành phần hóa học của nấm men 18

Bảng 6 Giá trị độ pH và độ Brix ban đầu của nguyên liệu 31

Bảng 7 Các dòng nấm men sau quá trình phân lập 31

Bảng 8 Đặc điẻm của các dòng nấm men phân lập 32

Bảng 9 Chiều cao cột khí CO2 (3cm) của 12 dòng nấm men theo thời gian lên men 36

Bảng 10 Độ cồn và độ Brix sau lên men của 12 dòng nấm men ở thí nghiệm 2 37

Bảng 11 Độ cồn và độ Brix sau lên men rượu vang mít của dòng nấm men TD3 39

DANH SÁCH HÌNH

Trang

2

Hình 2 Cơ chế của quá trình lên men rượu 12

Hình 3 Biểu đồ biểu diễn đường tăng trưởng của nấm 19

Hình 4 Saccharomyces cerevisiae 21

23

26

28

30

Hình 9 Hình thái dòng nấm men nhóm 1 33

Hình 10 Hình thái dòng nấm men nhóm 2 33

Hình 11 Hình thái dòng nấm men nhóm 3 33

Hình 12 Hình thái dòng nấm men nhóm 4 34

Hình 13 Hình thái dòng nấm men nhóm 5 34

Hình 14 Hình thái dòng nấm men nhóm 6 34

Hình 15 Độ cồn và độ Brix sau lên men của các dòng nấm men ở thí nghiệm 2 37

16 40

17 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của pH ban đầu đến độ rượu sau lên men 41 18 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của độ Brix ban đầu đến độ rượu sau lên men 41

19 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởn men 42

0 43

1 43

CHƯƠNG I

GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Rượu vang là một loại thức uống lên men trực tiếp từ các loại dịch quả, không qua chưng cất, có độ cồn thấp (10 – 18 độ) Việt Nam là đất nước có trái cây bốn mùa nên việc sản xuất rượu vang không những có ý nghĩa bổ sung thêm thành phần đồ uống trong bữa ăn, có tác dụng bồi bổ sức khỏe, mà còn có ý nghĩa tăng thêm thu nhập, góp phần tạo đầu ra thúc đẩy ngành nông nghiệp trồng cây ăn quả Nhưng chưa khai thác hết tiềm năng, hiện nay trên thị trường có nhiều sản phẩm rượu vang chủ yếu

là nước ngoài, rượu vang trái cây rất ít Do đó rượu vang là một thị trường tiềm năng nếu được khai thác tốt

Rượu vang được lên men từ những loại trái cây c

ng các loại quả như: nho, dâu, cam, xoài, dứa,… Đồng bằng sông Cửu Long

là nơi có nhiều loại trái cây có hiệu quả kinh tế cao, trong đó mít là loại trái cây phổ biến có giá trị dinh dưỡng cao, có hương thơm nhẹ và dễ chịu nên được nhiều người

ưa chuộng Hơn nữa mít cũng là một nguyên liệu lên men rượu vang tốt, góp phần đa dạng hóa sản phẩm từ mít

Vì những lí do trên cùng với mong muốn góp phần tạo ra sản phẩm mới, ngon

lạ và có giá trị dinh dưỡng cao lại vừa tận dụng được hết giá trị của quả mít nên đề tài:

“ỨNG DỤNG NẤM MEN PHÂN LẬP LÊN MEN RƯỢU VANG MÍT” được

thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Tuyển chọn ra các dòng nấm men tốt từ tự nhiên phù hợp để lên men rượu vang mít có chất lượng cao góp phần đa dạng hóa các sản phẩm rượu vang và khai thác thêm giá trị của quả mít

1.3 Nội dung thực hiện

- Phân lập các dòng nấm men tự nhiên từ dịch ép quả mít

- So sánh khả năng lên men của các dòng nấm men đã phân lập được để tuyển

chọn ra dòng tốt nhất áp dụng vào sản xuất rượu vang mít

ngay trên thân hay trên cành, hoa

dài 5 - 8cm, chiều ngang 2 - 5cm,

hoa đực hình chày Quả to, dài

30 - 60cm, mặt tua tủa nhiều gai

ngắn Khi chín vỏ vẫn giữ màu xanh lục hơi ngã sang màu vàng Thịt quả chín có màu vàng nhạt, vị ngọt rất thơm, quả có nhiều múi, mỗi múi có một hạt

Mít thuộc loại cây lâu năm, là một loại cây ăn trái gắn bó lâu đời với con người

Có rất nhiều loại mít, kích thước chênh lệch nhau tùy theo từng loại giống, có giống trái chỉ nặng từ 300 - 400 g, có giống trái nặng đến vài chục kg Có rất nhiều giống mít nhập từ nước ngoài, đặc biệt là nhập từ Thái Lan, thời gian ngắn nhưng cho năng suất rất cao, quanh năm, giá cao Hiện nay, nông dân ở Đồng bằng sông Cửu Long đang trồng mít Thái cao sản với diện tích rất lớn, đặc biệt là ở Tiền Giang hiện có gần 1.000

ha với tỷ lệ cho trái hơn 70% Việc đổ xô trồng mít Thái có thể dẫn đến tình trạng cung vượt cầu tương tự như một số cây trồng khác Ngoài ra, mít Thái không dùng để sấy khô được do cơm mỏng, độ ngọt cao nên khi xảy ra tình trạng cung vượt cầu thì nông dân không thể bán cho doanh nghiệp được vì họ chỉ thu mua mít dừa Việt Nam

để sấy khô, đóng gói chính vì vậy việc sản xuất rượu vang dựa trên nguyên liệu mít Thái nhầm góp phần tạo đầu ra cho ngành nông nghiệp trồng mít đang phát triển ở Đồng bằng Sông Cửu Long

Giống (genus): Artocarpus

Loài (species): A heterophyllus

Mít thuộc chi Artocapus (họ Moraceae) là một trong những loại cây ăn trái nhiệt đới Mít có nguồn gốc từ Tây Nam Ấn Độ và cũng được trồng nhiều ở Indonesia, Thái Lan, Philippin,… Ở Malaysia, mít được trồng nhiều ở tiểu bang Jahor, Pahang,

Kedah Mít có ba tên gọi khác nhau: Artocapus intergra Merr., Artocapus intergrifolia Linn và Artocapus heterophyllus Lam, trong đó Artocapus heterophyllus Lam được

chấp nhận và sử dụng rộng rãi nhất (Shamsudin et al., 2009)

Có 2 loại mít: mít ướt và mít ráo nhưng có rất nhiều giống như mít mật, mít nghệ, mít nài, mít tố nữ,… Mỗi giống có một hương vị khác nhau

Ở nước ta hiện nay có 3 giống mít chính:

- Mít nghệ: quả to, cây cho nhiều quả, dày cơm, rất ngon và nhiều mật

- Mít tố nữ: ngon nhưng không bằng mít nghệ nhưng khi bổ ra múi dính vào cùi nên rất được ưa chuộng, hơn nữa rất ráo và không dính tay Cây có nhiều quả nhưng quả tương đối nhỏ (1- 3kg)

- Mít dừa: Quả to như mít nghệ, màu vàng nhạt, giòn, dày cơm, ít ngọt

2.1.3 Thành phần hóa học và giá trị dinh dƣỡng (Nguyễn Công Dư, 1976)

Theo Vinamit.com quả mít có giá trị dinh dưỡng rất cao khoảng 40% cacbohydrat, 6% protein và 0,4% chất béo

0,9 30,0 - 73,2

20,0 - 57,2 287,0 - 323,0 3,0 - 35,0 0,4 - 1,9 30,0 0,05 - 0,15 0,05 - 0,2 12,0 - 14,0 50,0 - 210

72,0 - 94,0 1,2 - 1,9 0,1 - 0,4 16,0 - 25,4 1,0 - 1,5 20,6 0,8 - 0,9 20,0 - 37,0 27,0 38,0 - 41,0 191,0 - 407,0 2,0 - 41,0 0,5 - 1,1 175,0 - 540,0 0,03 - 0,09 0,05 - 0,4 7,0 - 10,0 88,0 - 410,0

51,0 - 64,5 6,6 - 7,04 0,40 - 0,43 25,8 - 38,4 1,0 - 1,5

0,9 - 1,2 50,0 54,0 38,0 - 97,0 246,0 63,2 1,5 1,0 - 17,0 0,25 0,11 - 0,30 11,0 133,0 - 139,0

Nguồn: USDA National Nufrient Database for Standard Reference, Releaes 19, 2006)

Bảng 3 Giá trị dinh dƣỡng của mít (100g)

0 1,5 24,0 0,92 0,329 0,055 0,105 110,0 13,7 0,34 3,0 303,0 34,0 0,60 37,0 0,197 36,0 0,6 0,42 61,0 5,0 157,0

5,0 18,0 3,0 3,0

0 4,0 6,0 6,0 25,0 4,0 9,0 3,5 23,0 2,0

0 6,5 3,4 7,5 9,0 8,5 3,0 1,0 4,0

Nguồn: USDA National Nufrient Database for Standard Reference, Releaes 19, 2006)

2.2 Giới thiệu về rƣợu vang

Rượu vang trước đây được sản xuất từ dịch ép quả nho và đã trở thành một loại rượu truyền thống lâu đời ở các nước có vùng nguyên liệu nho phong phú Sau này người ta mở rộng sử dụng các loại trái cây khác để lên men Vang trái cây ngày càng trở nên phổ biến Trên thế giới hiện đã có hang trăm loại rượu vang trái cây khác nhau

Rượu vang là thức uống tự nhiên có giá trị dinh dưỡng cao, có lợi cho sức khỏe

vì nguồn nguyên liệu chế biến rượu là từ các loại trái cây, rượu không qua chưng cất,

có hương vị thơm ngon tự nhiên của trái cây, có độ cồn nhẹ là loại nước giải khát dùng làm nước uống hoặc pha chế tạo thành các dạng cocktail

Bản chất rượu vang trái cây là sản phẩm được sản xuất từ nước dịch trái cây

bằng phương pháp lên men với sự tham gia của chủng nấm men Saccharomyces

cerevisiae

2.2.1 Định nghĩa rƣợu vang (Vũ Công Hậu, 2005)

Rượu vang là loại rượu được sản xuất từ dịch quả không qua chưng cất có độ rượu ethanol từ 10 - 18 độ Theo qui định thì đa số các nước sản xuất rượu vang chỉ được phép cho thêm đường và một số chất kích thích đã được xác định vào nước quả trước khi lên men Sau khi lên men, rượu được gạn lọc và ổn định, không được cho thêm bất cứ chất gì (đường, rượu, acid, chất màu, dầu thơm,…) vào để đảm bảo tính

Chất hòa tan không phải đường

Acid (tính ra acid malic)

Acid bay hơi

(Nguồn: Vũ Công Hậu, 2005)

tác dụng tiêu cực nếu có nhiều sẽ gây ra các bệnh rượu như : acid acetic, formic, propionic, butyric,…

Có nhiều muối khoáng trong rượu hoa quả, phổ biến nhất là P, K, S, Na, Ca,

Mg, Si, Fe, Mn, Cl, Al,…, mặc dù lượng tuyệt đối thấp Trong một lít rượu chỉ có 1,5- 3g tro nhưng chất muối trong tro giữ vai trò quan trọng:

Làm tăng hương vị của rượu

Tăng giá trị dinh dưỡng, có nhiều chất muối hết sức cần thiết cho cơ thể sống với một lượng rất nhỏ

Những chất vi lượng như Fe hàm lượng trung bình chỉ vài mg/lít và Cu: 0,2- 0,3mg//lít

-

–

- Vitamin

- Polyphenol

2.2.2

a Phân loại theo hàm lượng đường

- Rượu vang khô (dry wine): đường khử còn lại dưới 10g/l

- Rượu vang bán ngọt (semi- dry wine): đường khử còn lại khoảng 20-30g/l

- Rượu vang ngọt (sweet wine): đường khử còn lại khoảng 45g/l

- Vang rất ngọt( strong- sweet wine): đường khử còn lại khoảng 80-110g/l

b Phân loại theo quá trình lên men:

- Rượu vang tự nhiên (natural wine)

- Rượu vang cao độ (fortified wine)

c Phân loại theo CO 2

- Rượu vang có gas (table wine)

- Rượu vang không có gas (sparkling wine) có 2 loại:

+ Rượu vang có gas tự nhiên (do lên men tạo ra): champange

+ Rượu vang có gas nhân tạo: Carbonat wine

d Phân loại theo màu sắc

- Rượu vang trắng (white wine): vang lên men từ các quả nho khi chín vỏ không màu, hoặc màu lục nhạt, hoặc lên men từ các dịch nước quả mà không có xác quả

- Rượu vang đỏ (red wine): vang lên men từ các loại quả nho khi chín có màu

đỏ tím ở những mức độ khác nhau, hoặc lên men từ quả lấy dịch quả và xác quả



ng quanh năm

2.3

2.3.1

a Quá trình chọn nguyên liệu (Vũ Công Hậu, 2005)

Nguyên liệu là một yếu tố rất quan trọng trong sản xuất rượu vang và nhân tố quan trọng nhất trong lựa chọn nguyên liệu chính là chất lượng quả Trong công nghệ lên men, yêu cầu các loại quả đạt độ chín chế biến, có hương vị đặc trưng Ở độ chín chế biến hàm lượng đường tăng, hàm lượng acid giảm phù hợp với yêu cầu trong công nghệ lên men

Tiêu chuẩn chọn quả dùng trong chế biến rượu vang:

Đường tổng số trong nước quả cao, độ Brix phải từ 20 - 22, đối với quả có độ Brix cao thì ta chỉ cần bổ sung một ít đường, nếu quả kém ngọt thì phải thêm khá nhiều đường, nếu không độ rượu sẽ thấp

Hàm lượng acid hữu cơ tương đối cao, pH thấp (2,8 - 3,8) Nếu không có một lượng acid tối thiểu thì rượu sẽ lạt vì thiếu chua; quan trọng hơn, nếu thiếu acid, pH cao thì tạp khuẩn phát triển mạnh gây khó khăn cho hoạt động của nấm men Nhưng nếu lượng acid này quá cao cũng không tốt vì sẽ khó lên men và rượu khó uống

Thành phần của nước quả thích hợp với hoạt động của men với một lượng tối thiểu các chất sau: acid amin, vitamin, muối khoáng thực hiện vai trò xúc tác với một lượng rất nhỏ, polyphenol - tannin làm cho rượu có màu sắc hấp dẫn và đóng góp vào việc ức chế hoạt động của vi khuẩn có hại

b Khái quát quá trình lên men

Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người

ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu khí

- Lên men hiếu khí: là sự thủy phân đường với sự có mặt của O2 như quá trình lên men acid acetic, acid citric,

- Lên men yếm khí: là sự thủy phân đường không có sự hiện diện của O2 như quá trình lên men lactic, lên men rượu etylic, butylic, Quá trình lên men rượu, bia hay còn gọi là quá trình rượu, cồn hóa đều là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men Nấm men lên men chuyển hóa đường thành rượu etylic và CO2

Trong quá trình lên men rượu người ta chia làm 2 thời kỳ chính:

- Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của O2 tế bào nấm men phát triển sinh khối (gia tăng kích thước và số lượng)

- Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme có sẵn có của mình để thực hiện xúc tác sinh hóa trong quá trình trao đổi chất duy trì sự sống tạo thành rượu và CO2

c Cơ chế lên men rượu

Sản xuất rượu vang dựa trên cơ sở các quá trình hóa sinh xảy ra trong quá trình lên men các loại nước quả dưới tác dụng enzyme của nấm men (Hình 3)

Hình 2 Cơ chế của quá trình lên men rƣợu

Trong quá trình lên men, đường trong dịch quả được nấm men sử dụng để tăng sinh khối và tổng hợp một số sản phẩm Nấm men đóng vai trò chủ chốt trong việc biến đường thành rượu Song song với quá trình này là quá trình chuyển hóa đường, các acid hữu cơ thành các sản phẩm phụ khác

Quá trình lên men rượu là quá trình phức tạp Đầu tiên đường thẩm thấu vào tế bào nấm men, ở đó đường được chuyển hóa qua hàng loạt các sản phẩm trung gian và tạo thành acid pyruvic Acid pyruvic dưới tác dụng của enzyme pyruvate - decarboxylase sẽ bị mất CO2 và tạo thành acetaldehyde (ethanol) Sau đó, acetaldehyde

bị khử thành cồn etylic (ethanol) và CO2 do enzyme acoldehydrogenase xúc tác

Phương trình tóm tắt quá trình lên men rượu:

C6H12O6 C2H5OH + CO2 + 113.4KJ Đường và các chất dinh dưỡng của môi trường lên men được hấp thu và khuếch tán vào vào tế bào nấm men qua màng tế bào Trong khi nước được tự do ra vào màng

tế bào thì đường và các chất dinh dưỡng khác chỉ được màng tế bào cho đi vào và không cho đi ra Trong tế bào nấm men nhờ hoạt động sống của tế bào, nhờ hoạt động xúc tác của hàng loạt men mà những phản ứng sinh hóa phức tạp xảy ra và dẫn đến tổng hợp chất này, phân hủy chất kia Rượu ethanol và CO2 tạo thành liền thoát khỏi tế bào Rượu ethanol tan tốt trong nước do vậy nó khuếch tán rất nhanh vào môi trường xung quanh Trái với ethanol khí CO2 hòa tan vào môi trường không nhiều, khi đó CO2

sẽ bám vào các tế bào nấm men hình thành các bọt khí, những bọt khí này dính với nhau tạo thành những túi lớn, đến một lúc nào đó các tế bào nấm men sẽ nổi lên bề mặt, các túi khí vỡ ra và khí CO2 phóng thích ra bên ngoài và các nấm men chìm xuống Quá trình này diễn ra liên tục nên các tế bào nấm men vốn từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái động làm gia tăng khả năng tiếp xúc của nấm men với môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi

đó sẽ làm tăng quá trình lên men

Lên men

2.3.2

a) Nhiệt độ

Thông thường nấm men hoạt động tốt nhất ở 20 - 30°C, dưới 16°C lên men rất chậm, trên 35°C các hệ enzyme trong cơ thể nấm men bị giảm hoạt lực đến mức tối thiểu, hoạt động trao đổi chất bị ngưng trệ Nhiệt độ trên 40°C nấm men bị chết do không tổng hợp được năng lượng cần thiết cho hoạt động sống

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt động trao đổi chất của nấm men Trong giới hạn nhiệt độ nấm men hoạt động được, nhiệt độ lên men càng thấp thì thời gian lên men càng dài, hiệu xuất chuyển hóa đường thành rượu sẽ cao, chất lượng rượu vang khi đó sẽ tốt hơn

b) Độ pH

pH tối thích cho sự lên men là 4,0 - 4,5 Vi khuẩn bắt đầu phát triển phát triển ở

pH = 4,2 và cao hơn do đó ta nên thực hiện lên men trong giới hạn pH = 3,8 - 4,0

c) Nồng độ đường trong dung dịch lên men

Đường là cơ chất của quá trình lên men nên ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất lên men, nấm men có thể lên men đường thành rượu trong khoảng 22 - 25° Brix

d) Nồng độ rượu ethanol

Rượu ethanol là sản phẩm chính của quá trình chuyển hóa đường Nồng độ rượu khi đạt tới 5% thể tích đã có sự ức chế khả năng hoạt động của nấm men

e) Thời gian lên men

Quá trình lên men bao gồm lên men chính và lên men phụ, thời gian lên men được tính từ lúc cấy men giống vào môi trường lên men và kết thúc khi không còn bọt

+ Khí hậu thuận lợi cho sự phát triển nông nghiệp, cây ăn quả phong phú và đa dạng thuận lợi cho công nghệ sản xuất rượu vang trái cây

Hiện nay ở Việt Nam có một số cơ sở sản xuất rượu vang nổi tiếng như: Rượu vang Đà Lạt (công ty Ladofoods, công ty liên doanh Việt Đức (Van-Gres)

2.3.4 Một số nghiên cứu về rƣợu vang

Rƣợu vang dứa Queen:

Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành công nghệ sinh học “phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên ứng dụng lên men rượu vang dứa Queen” do học viên Đinh Thị Kim Lan thực hiện tại Viên nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học

Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là dứa Queen, được thực hiện trong 12 tháng

và cho ra những kết quả như:

Thanh trùng nguyên liệu bằng NaHSO3 140 g/l trong 30 phút

Độ Brix thích hợp cho lên men: 23o

pH tối ưu là thời gian lên men: 4,57

Nhiệt độ lên men: 28 - 30oC

Mật số tế bào: 105 tế bào/ml

Thời gian lên men là 10 ngày

Rƣợu vang dứa:

Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành công nghệ sinh học “phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên ứng dụng lên men rượu vang nhãn” do học viên Nguyễn Thị Hiền thực hiện tại Viên nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học

Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là nhãn, được thực hiện trong 12 tháng và cho ra những kết quả như:

Thanh trùng nguyên liệu bằng NaHSO3 140 g/l trong 30 phút

Độ Brix thích hợp cho lên men: 26o

pH tối ưu là thời gian lên men: 3,5

Nhiệt độ lên men: nhiệt độ phòng

Mật số tế bào: 105 tế bào/ml

Thời gian lên men: 12 ngày

Rƣợu vang ca cao:

Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành công nghệ sinh học “phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên ứng dụng lên men rượu vang ca cao” do học viên Nguyễn Thị Phương Kiều thực hiện tại Viên nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học

Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là ca cao, được thực hiện trong 12 tháng và cho ra những kết quả như:

Thanh trùng nguyên liệu bằng NaHSO3 140 mg/l trong 120 phút

Độ Brix thích hợp cho lên men: 26o

pH tối ưu là thời gian lên men: 3,7

Nhiệt độ lên men: 30oC

Mật số tế bào: 105 tế bào/ml

Thời gian: 8 ngày

Rƣợu vang táo:

Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành công nghệ sinh học “phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên ứng dụng lên men rượu vang táo” do học viên Nguyễn Trọng Thảo thực hiện tại Viên nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học

Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là táo, được thực hiện trong 12 tháng và cho

ra những kết quả như:

Thanh trùng nguyên liệu bằng NaHSO3 140 mg/l trong 30 phút

Độ Brix thích hợp cho lên men: 25,9o

pH tối ưu là thời gian lên men: 4,5

Nhiệt độ lên men: 28 - 30oC

Thời gian lên men: 11 ngày

Mật số tế bào: 1,58.105

tế bào/ml

Rƣợu vang cam:

Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành công nghệ sinh học “phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên ứng dụng lên men rượu vang cam” do học viên Nguyễn Phúc Trường thực hiện tại Viên nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học

Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là cam, được thực hiện trong 12 tháng và cho

ra những kết quả như:

Thanh trùng microwave 88 - 91oC trong 15 giây

Độ Brix thích hợp cho lên men: 23o

pH tối ưu là thời gian lên men: 4

Nhiệt độ lên men: 28 - 30o

Bảng 5 Thành phần hóa học của nấm men

(Lương Đức Phẩm, 2006)

2.4.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men

Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều

Để xác định tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như:

- Xác định tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay gián tiếp trên mặt thạch

- Đo độ đục của tế bào trong dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dụng một đồ thị chuẩn của mật độ tế bào

Quá trình sinh trưởng của nấm men có thể chia làm 4 giai đoạn:

Giai đoạn tiềm phát: giai đoạn này tế bào làm quen với môi trường, sinh khối chưa tăng nhiều

Giai đoạn logarit: đây là giai đoạn phát triển rất nhanh, sinh khối tăng ào ạt, kèm theo sự thay đổi mạnh mẽ của dịch lên men

Giai đoạn chậm dần: tốc độ sinh trưởng nấm men giảm dần, thành phần dịch lên men còn lại ít, các sản phẩm lên men được tích tụ nhiều

Giai đoạn ổn định: số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc độ sinh sản bằng tốc độ chết

Giai đoạn chết: tốc độ chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản rất ít do đó sản

Hình 3 Biểu đồ biểu diễn đường tăng trưởng của nấm

2.4.3 Sự sinh sản của nấm men

a) Sinh sản bằng cách nảy chồi

Đầu tiên hạch dài ra rồi bắt đầu thắt lại ở giữa, tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con Hạch một phần chuyển vào chồi, một phần ở tế bào mẹ, đồng thời một phần nguyên sinh chất cũng chuyển sang chồi con Chồi con lớn dần, khi chồi con gần bằng tuổi mẹ, nó được tách ra và sống độc lập

b) Sinh sản bằng cách phân đôi

Lúc đầu tế bào dài ra và từ từ thắt lại ở chính giữa, nơi thắt này nhỏ dần, nhỏ

dần tới khi đứt hẳn và tạo thành 2 tế bào con

c) Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử

Nhiều loại nấm men có khả năng sinh bào tử trong môi trường nghèo dinh dưỡng Nấm men thường tạo bào tử sau 5 - 10 ngày nuôi cấy trong môi trường thạch mạch nha Bào tử thường nằm trong những bào tử túi Bào tử túi có thể là hình cầu, hình bầu dục,…(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.4.4 Dinh

Nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con đường hấp thu chọn lọc qua màng nguyên sinh chất của tế bào, sau

khối lượng phân tử thấp, hòa tan trong nước ở dạng ion Nấm men có thể sinh enzyme thích hợp

để chuyển hóa một số hợp chấ

Nấm men cũng như các sinh vật khác đòi hỏi phải có nguồn nguyên liệu nhất định cho sự phát triển và tái sản xuất Một số nguyên tố cần thiết cơ bản như: carbon, hydro, oxy, nitơ, phospho, kali, vitamin, khoáng, thường ở dưới dạng hợp chất thích

2.4.5

Giống Saccharomyces có tới 18 loài, nhưng chỉ có 7 loài thường gặp trong nước

quả Các loài nấm men không sinh bào tử thường gặp trong nước quả làm tiêu hao

đường trong đó, phổ biến là Kloeckera, TorulopsisThường người ta gọi chúng là men

dại Sau đây là một số loài nấm men thường gặp trong nước quả có vai trò quan trọng trong nghề làm rượu vang

a Saccharomyces cerevisiae

Đây là tên hiện tay được dùng phổ biến, trước đây người ta gọi là S cerevisiae Meyer hay S ellipsoideus theo Lodder là Saccharomyces vini Nấm men này phổ biến trong quá trình lên men nước quả chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có

trong nước quả lên men Khả năng kết lắng của nó phụ thuộc vào từng nòi: các tế nào dạng bụi hoặc dạng bông Nguồn dinh dưỡng cacbon của loại này là đường, cồn và acid hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là acid pantotinic, biotin, mezoinozit, thiamin

và piridoxin Đa số các tế bào của loài này hình ovan có kích thước (3 - 8) x (5 - 12)

µm sinh sản theo lối nảy chồi và tạo thành bào tử Saccharomyces cerevisiae sinh ra

enzyme invectara có khả năng khử đường saccharose thành fructose và glucose, vì vậy trong lên men ta có thể bổ sung loại đường này vào dung dịch quả và hàm lượng rượu được tạo thành bình thường đối với nhiều nòi men này chỉ đạt được 8-10% so với thể tích Loài này lên men rượu có nồng độ tới 16%, trong khi việc sử dụng dịch lên men

là đường hay siro có thể làm nấm men tạo ra 18% rượu hoặc cao hơn

Hàm lượng protein của nấm men này thông thường cao hơn 60%, với một hàm lượng acid amin tương đối như lysine, triptophan và threonine, giàu vitamin nhóm B với hàm lượng acid nicleic từ 4 - 10%

Ở giai đoạn cuối lên men Saccharomyces cerevisiae kết lắng nhanh và làm

trong dịch rượu Ở nòi của giống này có đặc tính riêng về khả năng tạo confirm chịu sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và tạo ra các sản phẩm thứ cấp tạo cho vang có mùi

vị đặc trưng riêng biệt Giai đoạn cuối cùng của quá trình lên men các tế bào

Sacchromyces cerevisiae thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị

chết rất nhanh

c Saccharomyces chevalieri

Theo Lodder là Saccharomyces chevalieri Guilliermond Nấm men này được

tách từ nước nho lên men tự nhiên, từ rượu vang mon được gây lên men nước dừa

hoặc nước cọ Saccharomyces chevalieri thuần chủng lên men nước nho có thể tạo 16% rượu Nó thường lễn với Saccharomyces cerevisiae

Các yếu tốt sinh trưởng của loại này giống như Saccharomyces cerevisiae và có

khả năng chịu được cồn cao Dùng các nòi thuần chủng của giống này lên men dịch quả có hàm lượng đường cao để chế vang khô cho kết quả tốt

Có hình dáng giống như Saccharomyces cerevisiae và có thể thạo thành màng trên dịch quả S oviformis lên men được glucose, frustose, mantose, saacharose, maltose và 1/3 rafinose, không lên men lactose, pentose Điều khác nhau cớ bản giữ S

oviformis và S vini là S ovidormis không lên men được galactose và men nổi lên bề

mặt dịch lên men tạo thành mảng Hai giống nấm men vang này (S cerevisiae và S

oviformis) có nhiều nòi được dùng trong sản xuất

e Hanseniaspora apiculate – Kloeckera apiculata

Kloeckera apiculata: Kích thước tương đối nhỏ, hình oval - elip hoặc hình

chanh, tế bào có một đầu nhỏ, người ta thường gọi là men hình chùy Sinh sản bằng nảy chồi, rất phổ biến ở vỏ quả và nhiễm vào nước quả, chiếm đếm 90% tổng số men khi bắt đầu lên men Nó có thể lên men tạo thành 6 - 7% rượu, nhưng tạo ra một loạt các acid bay hỏi cũng như các este của chúng làm cho dịch có mùi tạp và nó còn kìm

hãm các loài nấm men chính trong lên men, K apiculata nhạy cảm với SO2 Trong nghề làm rượu vang, người ta không mong muốn loài men này phát triển, nếu có thì chỉ cần có trong giai đoạn đầu tạo được 3 - 4% rượu

Trong lên men rượu còn có loài men giả là Endomycopsis fibuliger Giống

Endomycopsis tương tự nấm men nhưng có thể mọc sợi, có khả năng sinh

glucoamylase và thủy phân tinh bột thành đường glucose Vì vậy trong nghề làm rượu

người ta rất muốn giống này để cùng Aspergillus, Mucor và Rhizopus đường hóa tinh

bột

- Dụng cụ để phân lập nấm men: đĩa Petri, ống nghiệm, đèn cồn,…

- Cân điện tử với độ chính xác 0,01g

không bổ sung đường vào dịch quả) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Điều chỉnh độ Brix Lên men tự nhiên

Điều chỉnh độ pH Phân lập nấm men

Có bổ sung đường

Không bổ sung đường

Điều chỉnh mật số nấm men