nghiên cứu quy trình lên men tempe từ đậu xanh

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích khảo sát những điều kiện như: thời gian ngâm và nấu đậu, tỷ lệ giống, thời gian và nhiệt độ lên men để xác định điều kiện thích hợp cho quá tr

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN TIẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LÊN MEN

TEMPE TỪ ĐẬU XANH

PGS TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG TRƯƠNG HOA THẢO HUYÊN

MSSV: 3092475 LỚP: CNSHTT K35

Cần Thơ, Tháng 12/2013

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên) (ký tên)

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

Trong quá trình thực hiện đề tài, em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của thầy cô, các anh chị và các bạn Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Các thầy cô ở Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã quan tâm và tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

PGS TS Ngô Thị Phương Dung và ThS Huỳnh Xuân Phong – cán bộ hướng dẫn khoa học, đã tận tình giúp đỡ em hoàn thành đề tài

Cán bộ phòng thí nghiệm: anh Nguyễn Ngọc Thạnh và anh Phạm Hồng Quang đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện cho em trong quá trình tiến hành các thí nghiệm

Tập thể các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên trong phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực phẩm đã tận tình giúp đỡ và động viên em

Gia đình và bạn bè đã chia sẻ và giúp đỡ em hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn!

TÓM TẮT

Tempe, thực phẩm cổ truyền của người Indonesia, là sản phẩm lên men của đậu nành với nấm mốc Rhizopus oligosporus Tempe là thực phẩm bổ dưỡng và đang ngày càng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới Tuy nhiên, tempe lại hầu như không được biết đến ở Việt Nam Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích khảo sát những điều kiện như: thời gian ngâm và nấu đậu, tỷ lệ giống, thời gian và nhiệt độ lên men để xác định điều kiện thích hợp cho quá trình lên men tempe từ đậu xanh Sản phẩm tempe sau khi lên men với các điều kiện trên được phân tích các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh và được đánh giá cảm quan để xác định độ ưa thích đối với sản phẩm Từ kết quả của nghiên cứu, xác định được các điều kiện thích hợp cho lên men tempe đậu xanh là: thời gian ngâm đậu 20 giờ, thời gian nấu là 20 phút, tỷ lệ giống 1%, đậu lên men ở nhiệt độ môi trường (28-34 o C) và thời gian lên men là 48 giờ Sản phẩm tempe đạt các tiêu chuẩn chất lượng an toàn thực phẩm Kết quả này mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc ứng dụng quy trình sản xuất tempe vào sản xuất quy mô lớn

Từ khóa: Đậu xanh, lên men tempe, nấm mốc, Rhizopus oligosporus, tempe đậu xanh

MỤC LỤC

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Đậu xanh 2

2.2 Tổng quan về tempe 4

2.2.1 Giới thiệu về tempe 4

2.2.2 Quy trình lên men tempe tổng quát 6

2.2.3 Hệ vi sinh vật trong lên men tempe 7

2.2.4 Những biến đổi hóa học trong quá trình lên men 9

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

3.1 Phương tiện 11

3.1.1 Địa điểm và thời gian 11

3.1.2 Vật liệu 11

3.1.3 Hóa chất và thiết bị 11

3.2 Phương pháp nghiên cứu 11

3.2.1 Phân tích nguyên liệu đậu xanh 11

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm và nấu đậu đến quá trình lên men tempe 12 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống chủng lên quá trình lên men tempe 13

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên quá trình lên men tempe 13

3.2.5 Sản xuất thử nghiệm và đánh giá chất lượng sản phẩm tempe 14

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

4.1 Kết quả phân tích nguyên liệu đậu xanh 17

4.2 Ảnh hưởng của thời gian ngâm và nấu đậu đến quá trình lên men tempe 17

4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống chủng lên quá trình lên men tempe 19

4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên quá trình lên men tempe 21

4.5 Sản xuất thử nghiệm và đánh giá chất lượng sản phẩm tempe 23

4.5.1 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lý 24

4.5.2 Kết quả phân tích vi sinh 24

4.5.3 Kết quả đánh giá cảm quan 25

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 27

5.1 Kết luận 27

5.2 Đề nghị 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Một số hình ảnh thí nghiệm

Phụ lục 2: Các phương pháp phân tích

Phụ lục 3: Kết quả

Phụ lục 4: Kết quả thống kê

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Thành phần dinh dưỡng trong 100 g đậu xanh nguyên liệu 3

Bảng 2 Thành phần dinh dưỡng trong 100 g tempe từ đậu nành 5

Bảng 3 Những tiêu chuẩn đánh giá chất lượng 16

Bảng 4 So sánh kết quả phân tích đậu xanh với kết quả của USDA 17

Bảng 5 Giá trị pH của nước ngâm đậu 18

Bảng 6 Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến khả năng lên men tempe 18

Bảng 7 Ảnh hưởng của thời gian nấu đến khả năng lên men tempe 19

Bảng 8 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống chủng đến hàm lượng đạm amin (mgN/g) của tempe 19

Bảng 9 Ảnh hưởng của tương tác hai nhân tố thời gian và nhiệt độ đến hàm lượng đạm amin (mgN/g) của tempe 21

Bảng 10 So sánh các chỉ tiêu của đậu trước và sau khi lên men tempe 24

Bảng 11 Kết quả phân tích vi sinh của tempe 25

Bảng 12 Kết quả đánh giá cảm quan tempe đậu xanh 25

Bảng 13 Môi trường MEA

Bảng 14 Thành phần của môi trường PCA

Bảng 15 Thành phần của môi trường MRS

Bảng 16 Thành phần của môi trường YGC

Bảng 17 Thành phần của môi trường Endo

Bảng 18 Thành phần của môi trường peptone d’indol

Bảng 19 Mẫu cho điểm đánh giá cảm quan tempe

Bảng 20 Kết quả phân tích vi sinh của nước ngâm đậu

Bảng 21 Kết quả đo độ ẩm – vật chất khô mẫu đậu xanh nguyên liệu và tempe

Bảng 22 Giá trị pH của nước ngâm đậu ở các thời gian ngâm khác nhau

Bảng 23 Điểm đánh giá cảm quan tempe ở thời gian ngâm và nấu khác nhau

Bảng 24 Giá trị pH của các mẫu tempe lên men với các tỷ lệ giống khác nhau

Bảng 25 Nhiệt độ của các mẫu tempe lên men với các tỷ lệ giống khác nhau

Bảng 26 Hàm lượng amin của các mẫu tempe với các tỷ lệ giống khác nhau

Bảng 27 Giá trị pH của các mẫu tempe ở nhiệt độ và thời gian lên men khác nhau

Bảng 28 Nhiệt độ của các mẫu tempe ở nhiệt độ và thời gian lên men khác nhau

Bảng 29 Hàm lượng đạm amin của các mẫu tempe ở nhiệt độ và thời gian lên men khác nhau

Bảng 30 Kết quả phân tích vi sinh của mẫu tempe

Bảng 31 Điểm đánh giá cảm quan

Bảng 32 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian ngâm và thời gian nấu đến khả năng lên men tempe

Bảng 33 Phân tích LSD ảnh hưởng của thời gian ngâm và thời gian nấu đến khả năng lên men tempe Bảng 34 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của tỷ lệ giống chủng đến hàm lượng đạm amin của tempe Bảng 35 Phân tích LSD ảnh hưởng của tỷ lệ giống chủng đến hàm lượng đạm amin của tempe Bảng 36 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ lên men đến hàm lượng đạm amin của tempe Bảng 37 Phân tích LSD ảnh hưởng của tương tác thời gian và nhiệt độ lên men đến hàm lượng đạm amin của tempe

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Đậu xanh 2

Hình 2 Tempe đậu nành 4

Hình 3 Quy trình lên men tempe tổng quát 6

Hình 4 Giá trị pH của các mẫu tempe với các tỷ lệ giống khác nhau 20

Hình 5 Sự thay đổi nhiệt độ của các mẫu tempe với tỷ lệ giống khác nhau 20

Hình 6 Giá trị pH của các mẫu tempe với thời gian và nhiệt độ lên men khác nhau 22

Hình 7 Sự thay đổi nhiệt độ của các mẫu tempe trong quá trình lên men 23

Hình 8 Sản phẩm tempe đậu xanh 23

Hình 9 Kết quả đếm E coli và Coliforms của mẫu tempe

Hình 10 Quy trình pha loãng mẫu

TỪ VIẾT TẮT

R oligosporus Rhizopus oligosporus

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Tempe là một loại thực phẩm lên men cổ truyền của người Indonesia và được dùng như nguồn protein chính trong các bữa ăn Tempe là loại thực phẩm rất bổ dưỡng, giàu đạm, giàu xơ, bên cạnh đó còn chứa nhiều vitamin và khoáng chất cần thiết cho cơ thể như: canxi, sắt, kẽm, các loại vitamin B,… được xem như nguồn thay thế thịt (meat replacer) lý tưởng cho mọi người Tempe giúp kiểm soát lượng đường và cholesterol trong máu, phòng ngừa ung thư, các bệnh tim mạch, ngoài ra tempe còn giúp tăng cường xương và khả năng hấp thu dưỡng chất của cơ thể Bên cạnh những lợi ích đối với sức khỏe, tempe còn dễ làm, dễ chế biến vì vậy tempe đang ngày càng phổ biến và được ưa chuộng ở nhiều nước trên thế giới Tuy nhiên, tempe lại hầu như không được biết đến ở Việt Nam, do rất nhiều nguyên nhân, trong đó nguyên nhân quan trọng nhất là do tempe không phù hợp với khẩu vị của người Việt Nam Vì vậy, cần tìm ra nguồn nguyên liệu thích hợp nhằm giới thiệu và phổ biến tempe đến người tiêu dùng Việt Nam Nguyên liệu được lựa chọn là đậu xanh vì đậu xanh từ lâu đã rất quen thuộc với người Việt Nam Với thành phần dinh dưỡng cao, nhiều vitamin, khoáng chất cùng tác dụng thanh nhiệt, giải độc, đậu xanh được sử dụng để chế biến nhiều món ăn thơm ngon rất được ưa chuộng trong cuộc sống hàng ngày như: chè đậu xanh, xôi, các loại bánh ngọt, Bên cạnh đó, đậu xanh còn là nông sản có sản lượng khá lớn và giá thành tương đối thấp Tuy nhiên, các sản phẩm từ đậu xanh lại không được đa dạng như đậu nành, đặc biệt là trong các món ăn

chay Do đó, đề tài “Nghiên cứu quy trình lên men sản xuất tempe từ đậu xanh” được thực

hiện với mong muốn sản xuất sản phẩm tempe phù hợp với khẩu vị người Việt Nam, nhằm góp phần giới thiệu tempe vào Việt Nam, đồng thời nâng cao giá trị kinh tế và làm

đa dạng các sản phẩm từ đậu xanh

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình lên men tempe từ đậu xanh, sản xuất thử nghiệm và đánh giá chất lượng tempe thành phẩm

Hình 1 Đậu xanh

(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/ , 26/07/2013)

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Đậu xanh

Đậu xanh hay đỗ xanh có tên khoa học là

Vigna radiata , thuộc họ đậu (Fabaceae), được

trồng nhiều ở các nước châu Á như: Ấn Độ, Việt

Nam, Thái Lan, Campuchia, Trung Quốc, và

những vùng khí hậu khô nóng như Nam Âu, miền

nam Hoa Kỳ Đậu xanh thuộc loại cây thảo mọc

đứng Lá mọc kép 3 chia, có lông hai mặt Hoa

Đậu xanh có thành phần dinh dưỡng rất cao Bên cạnh thành phần chính là protid và tinh bột, đậu xanh cũng có nhiều chất xơ, ít chất béo bão hòa và không chứa cholesterol Ngoài ra, đậu xanh còn chứa rất nhiều vitamin như vitamin E, B1, B2, B3, B6, C, tiền vitamin A, acid folic; và các khoáng chất gồm Ca, Mg, K, Na, Zn, Fe, Cu,…

Giống như tất cả các loại đậu, đậu xanh rất giàu chất xơ - nhiều hơn so với các loại trái cây và rau quả và thậm chí tốt hơn so với loại còn nguyên cám Các chất xơ hòa tan trong đậu xanh khi qua đường tiêu hóa, lấy đi những chất béo thừa và loại bỏ chúng khỏi cơ thể trước khi hấp thụ, nhất là cholesterol Chất xơ trong đậu xanh còn có khả năng loại bỏ các độc tố trong cơ thể, do đó giúp ngăn ngừa chứng ung thư ruột kết

Acid folic hoặc folate chứa trong đậu xanh giúp giảm nguy cơ bệnh tim, chống dị tật bẩm sinh, góp phần vào sự tăng trưởng tế bào bình thường, giúp sự trao đổi chất của protein, và là điều cần thiết cho sự hình thành của các tế bào hồng cầu và cho các quá trình chữa bệnh trong cơ thể

Ngoài ra, vỏ đậu xanh có chứa nhiều hoạt chất thuộc nhóm flavonoid, có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư đặc biệt là làm giảm nguy cơ ung thư vú và tuyến tiền liệt Nghiên cứu cho thấy phụ nữ gốc Tây Ban Nha tỷ lệ ung thư vú chỉ bằng ½

so với phụ nữ da trắng do thường sử dụng đậu xanh trong chế độ ăn hàng ngày (Lê Kim Phụng, 2013)

Theo Đông y, đậu xanh vị ngọt, tính hàn, có công dụng thanh nhiệt, giải độc, rất thích hợp cho việc chữa trúng nóng, phiền khát, ngộ độc thức ăn hoặc dược thảo Đậu xanh cũng có thể dùng để chữa bệnh tăng huyết áp và chống viêm nhiễm

Bảng 1 Thành phần dinh dưỡng trong 100 g đậu xanh nguyên liệu

Thành phần Khối lượng Đơn vị

Hình 2 Tempe đậu nành

(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/ , 26/07/2013)

Trong đời sống hàng ngày, đậu xanh được sử dụng rộng rãi và phổ biến với nhiều cách chế biến khác nhau như hấp, làm bánh, nấu chè, xôi, sữa, ủ lên mầm để làm thức ăn (giá đỗ),… thích hợp cho cả ăn chay lẫn ăn mặn Những thực phẩm từ đậu xanh có giá trị dinh dưỡng cao lại dễ làm nên rất phổ biến ở 3 cả ba miền Bắc, Trung và Nam Ở một số nước châu Á, đậu xanh còn được dùng làm các món ăn mặn, làm kem hoặc xay nhuyễn thành bột

2.2 Tổng quan về tempe

2.2.1 Giới thiệu về tempe

Tempe là thực phẩm lên men có nguồn

gốc từ Indonesia Nguyên liệu dùng làm

tempe rất đa dạng, chủ yếu là các cây họ đậu

như đậu nành, đậu phộng, bên cạnh đó,

người ta cũng sử dụng các loại ngũ cốc như

lúa mì, lúa mạch, và bánh ép dầu dừa Mỗi

loại tempe sẽ khác nhau tùy thuộc vào các

chất phụ gia được thêm vào với nguyên liệu

cơ bản khi lên men, cách đóng gói và bảo quản (Shurtleff và Aoyagi, 1979) Trong số đó, tempe từ đậu nành được biết đến nhiều nhất và ngày càng trở nên phổ biến không chỉ ở Indonesia mà còn ở nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Hà Lan, Nhật (Soewito, 1985) Tempe được xem như nguồn thay thế thịt lý tưởng vì bên cạnh protein, tempe còn chứa chất xơ hòa tan và không hòa tan cao Chất xơ hòa tan có thể làm giảm cholesterol huyết thanh và kiểm soát lượng đường trong máu, vì vậy những bệnh nhân tiểu đường hoặc những người theo chế độ ăn kiêng có thể tiêu thụ tempe hàng ngày mà không gặp vấn đề như với các nguồn cung cấp protein từ thịt Chất xơ không hòa tan còn thúc đẩy bài tiết, làm giảm nguy cơ ung thư, đặc biệt là ung thư ruột kết cũng như các triệu chứng rối loạn tiêu hóa

Tempe cũng chứa tất cả các acid amin thiết yếu và nhiều khoáng chất cũng như vitamin cần thiết cho cơ thể (Bảng 2) Quá trình lên men làm giảm acid phytic có trong các loại đậu, do đó cho phép cơ thể hấp thu các khoáng chất trong đậu tốt hơn

Bảng 2 Thành phần dinh dưỡng trong 100 g tempe từ đậu nành

(*Nguồn: USDA Nutrient Database for Standard Reference, ngày 02/08/2013)

Tempe có hương vị thơm ngon, được cắt thành những lát mỏng, ngâm trong nước muối và rán trong dầu dừa hoặc dùng để nấu súp

Trong điều kiện nhiệt độ thường, tempe tươi chỉ giữ được từ 1-2 ngày, do sự hình thành bào tử của nấm mốc làm tempe chuyển sang màu nâu, mềm ra và hoạt động của các enzyme phân giải protein tạo ra NH3 làm sản phẩm có mùi khó chịu (Nout et al, 1985)

Có thể kéo dài thời gian bảo quản bằng nhiều cách khác nhau:

 Đơn giản nhất là cắt tempe thành từng lát rồi phơi khô dưới ánh sáng mặt trời

 Thích hợp nhất là làm mất hoạt tính mốc và enzyme bằng cách làm tái tempe, sau đó làm lạnh

 Bảo quản ở –29°C, cách này có thể giữ được 10 tuần mà chất lượng tempe vẫn tốt

Ngâm qua đêm

năng ức chế sự phát triển của Rhizopus oligosporus (R oligosporus) Vì vậy, việc

ngâm đậu là rất cần thiết để loại bỏ chất ức chế này Khi ngâm đậu cần bổ sung thêm nước ngâm mẻ trước với hoặc có thể bổ sung 0,85% acid lactic hay acid acetic để

pH nước ngâm trong khoảng 4,0-5,0 giúp ức chế sự phát triển của vi khuẩn mà không làm ảnh hưởng đến mốc (Steinkraus et al., 1965)

 Chà xát đậu để làm tróc vỏ hạt và loại bỏ vỏ hạt Tách vỏ đậu là bước rất quan trọng nhằm giúp mốc có thể xâm nhập vào bên trong đậu

 Nấu đậu trong khoảng từ 20-30 phút ở 100ºC (Ko và Hesseltine, 1961) để diệt khuẩn, tạo điều kiện thuận lợi cho mốc thâm nhập vào, phá hủy các chất kháng dinh dưỡng (antinutritional factors) trong đậu như chất ức chế trypsin và chymotrypsin, loại bỏ vị đắng trong đậu và giải phóng một số chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của mốc (Steinkraus et al., 1983)

 Sau khi nấu, đậu được rút nước, để nguội đến khoảng 37oC và làm khô bề mặt trước khi chủng mốc vào (Ko và Hesseltine, 1961)

 Chủng đậu với R oligosporus: đậu sau khi nấu chín có thể chứa 103-104 bào tử vi khuẩn/g Để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn trong khi lên men, đậu không được quá ướt và mật số mốc chủng phải từ 104-105 CFU/g (Ko và Hesseltine, 1961)

Mốc chủng phải được phân bố đều khắp bề mặt đậu (Wang et al., 1975)

 Gói đậu trong túi polyethylene và ép miệng túi

 Đục lỗ các túi bằng dụng cụ vô trùng để tạo không khí cho R oligosporus phát triển

R oligosporus không đòi hỏi nhiều không khí như nhiều loại mốc khác, trong thực

tế, nhiều không khí quá có thể gây ra sự tạo thành bào tử, điều này không thích hợp cho sản xuất tempe

 Ủ trong 24-48 giờ ở nhiệt độ trong khoảng từ 25-37o

C Đây là giai đoạn tạo hệ sợi nấm trắng liên kết hỗn hợp thành bánh rắn chắc, các enzyme và các vitamin như: B2,

B3, B12,… Theo Steinkraus et al (1965), R oligosporus phát triển nhanh ở 35-38oC

và độ ẩm 75-85%, tạo thành tempe trong thời gian tối thiểu là 18 giờ Nhiệt độ càng cao thì thời gian ủ càng ngắn

 Quá trình lên men kết thúc khi thu được bánh dạng rắn, chắc có thể cắt thành lát

mỏng, được bao phủ bởi các sợi nấm trắng R oligosporus và có mùi dễ chịu

* Quy trình lên men tempe đậu xanh cơ bản dựa theo quy trình tổng quát trên, nhưng không qua giai đoạn tách vỏ do sử dụng nguyên liệu là đậu xanh đã được tách vỏ sẵn

2.2.3 Hệ vi sinh vật trong lên men tempe

Quá trình lên men tempe có sự tham gia của một nhóm đa dạng các vi sinh vật: nấm mốc, nấm men, vi khuẩn sinh acid lactic và một số vi khuẩn Gram âm khác Mật số bình thường của các loại vi khuẩn sinh khuẩn lạc từ 108

-109 CFU/g và đến 107 CFU/g đối với

nấm men (Mulyowidarso et al., 1989) Trong đó, Rhizopus spp đóng vai trò chủ yếu (Steinkraus et al., 1965) Có ít nhất 4 loài Rhizopus có khả năng lên men đậu nành thành tempe, bao gồm R oligosporus, R stolonifer, R oryzae và R arrhizus (Ko và Hesseltine, 1961), R oligosporus là loài chủ yếu để sản xuất tempe chất lượng cao (Hesseltine,

Trong quá trình lên men, R oligosporus có khà năng sinh các enzyme như

carbohydrase, lipase, protease và phytase làm phân giải các chất dinh dưỡng trong tempe, đặc biệt là enzyme phytase có khả năng làm giảm lượng acid phytic, một chất có ảnh hưởng đến chất lượng dinh dưỡng trong sản phẩm

R oligosporus có thể sản xuất chất ức chế sinh trưởng chống lại sự phát triển và sinh

độc tố aflatoxin B1 của Aspergillus flavus và ức chế một số Clostridium, Bacillus spp.,

Staphylococcus spp (Ko và Hesseltine, 1979; Nout, 1989)

b Vi khuẩn acid lactic

Các vi khuẩn acid lactic đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất tempe Trong giai đoạn ngâm đậu, vi khuẩn acid lactic sinh acid làm giảm pH nước ngâm, giúp hạn chế

sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn Nhưng quá trình ngâm đậu chỉ khoảng 8-12 giờ nên sự tăng trưởng của các vi khuẩn này có thể rất thấp làm cho quá trình acid hóa chậm và yếu, người ta có thể bổ sung một lượng nhỏ acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic) để thay thế vai trò của các vi khuẩn này (Shurtleff và Aoyagi, 1979)

c Các loại nấm men

Nấm men được phát hiện trong tempe chủ yếu là chi Trichosporon, gồm các loài:

Trichosporon beigelii, Saccharomyces dairensis; chúng thường không ảnh hưởng hoặc

ảnh hưởng rất ít Tuy nhiên, nếu mật số nấm men quá cao thì có thể cạnh tranh nguồn dinh dưỡng và ức chế sự phát triển của nấm mốc

d Các vi sinh vật khác

Các vi sinh vật gây hại là loại vi sinh vật cạnh tranh với sự phát triển của mốc R

oligosporus và sinh ra các độc tố, gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Chúng gồm

một số loài như: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella

typhimurium,… đều là những vi sinh vật bị ức chế trong môi trường có pH thấp Do đó,

chúng khó có thể phát triển trong quá trình lên men tempe do độ pH thấp và sự phát triển

mạnh mẽ của R oligosporus

Ngoài ra, trong tempe còn có các loài vi sinh vật có khả năng cải thiện chất lượng sản

phẩm thông qua việc tổng hợp các vitamin, đặc biệt là vitamin B12 như: Klebsiella

pneumoniae, K Terrigena, K pneumiae spp ozenae, K planticola và Enterobacter cloacae (Okada et al., 1985)

2.2.4 Những biến đổi hóa học trong quá trình lên men

Trong quá trình lên men, Rhizopus spp cùng với vi khuẩn và nấm men tạo ra các

enzyme phân giải protein, lipid và carbohydrate trong đậu

Ảnh hưởng của sự lên men tempe đối với hàm lượng nitơ tổng là không đáng kể Tuy nhiên, lượng acid amin tự do tăng lên sau lên men do hoạt động của các enzyme protease

sinh ra trong quá trình phát triển của R oligosporus, thủy phân protein thành các acid

amin tự do

Hering et al (1990) nhận thấy trong quá trình lên men tempe trong phòng thí nghiệm, lượng lipid tổng không thay đổi nhiều, nhưng lượng acid béo không bão hòa tăng Nguyên nhân là do sự thủy phân lipid mạnh mẽ của các lipase tạo ra các acid béo tự do như acid linoleic, acid oleic, acid palmitic,… Sự thủy phân lipid kéo dài sẽ làm giảm giá trị dinh dưỡng của tempe

Sau 20-30 giờ lên men, các enzyme thủy phân polysaccharide hoạt động mạnh nhất, trong đó polygalacturonase, endocellulase, xylanase, arabinase, β-D-glucosidase và α-D-galactosidase chiếm ưu thế (Sarrette et al., 1992) Theo De Reu et al (1997), hoạt động

của các enzyme này làm mềm đậu và giảm lượng polysaccharide phi tinh bột (non-starch polysaccharides)

Hoạt động của các enzyme vi khuẩn phân hủy đáng kể các chất trùng hợp thành các oligome và những đơn vị nhỏ hơn, tăng khả năng tiêu hóa của tempe Sự phân hủy này được phản ánh thông qua sự tăng vật chất khô tan trong nước (Kiers et al., 2000)

Những biến đổi sinh hóa khác bao gồm sự tạo thành các vitamin (riboflavin, acid nicotinic, acid pantothenic và một số biotin) Một số nhân tố kháng dinh dưỡng (antinutritional factors) bị phân hủy trong quá trình sản xuất tempe, hầu hết do bị rửa trôi

và bất hoạt bởi nhiệt độ trong quá trình ngâm và nấu đậu Ngoài ra, hoạt động của các vi khuẩn còn làm biến đổi isoflavone trong đậu thành chất có khả năng chống oxy hóa và loại bỏ gốc tự do (radical-scavenging activity) giúp tăng cường sức khỏe (Klus và Barz, 1998)

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện

3.1.1 Địa điểm và thời gian

 Địa điểm: Phòng thí nghiệm CNSH thực phẩm, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ

 Thời gian: Từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2013

3.1.2 Vật liệu

 Nấm mốc Rhizopus oligosporus LU575 (Viện NC&PT Công nghệ Sinh học)

 Đậu xanh từ siêu thị Metro

 Môi trường nuôi cấy R oligosporus: môi trường MEA (Malt Extract Agar)

3.1.3 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất: NaOH 10N, H2SO4 0,05N, (NH4)2B2O7, Mg(OH)2, hỗn hợp chất chỉ thị màu: bromoresol green và methyl red hòa tan trong ethanol, dung dịch acid boric, MgO bột và một số hóa chất khác

Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que cấy và một số dụng cụ khác

Thiết bị:

 Tủ cấy vô trùng (Microflow, Anh)

 Kính hiển vi (Olympus Optical, Nhật)

 Tủ ủ (Ehret, Đức)

 Máy vortex (HEIPOLPH, Đức)

 pH kế (Schott, Đức) và một số thiết bị khác của phòng thí nghiệm

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phân tích nguyên liệu đậu xanh

Khảo sát các chỉ tiêu sau ở đậu xanh nguyên liệu:

 Độ ẩm

 Đạm tổng số bằng phương pháp Kjeldahl

 Xác định mật số vi sinh vật trong nước ngâm đậu (tổng vi sinh vật hiếu khí, tổng nấm men và nấm mốc, vi khuẩn acid lactic) bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm và nấu đậu đến quá trình lên men tempe

Mục đích: Xác định khoảng thời gian ngâm đậu và nấu đậu cho đậu xanh trong quá

trình lên men tempe

Phương pháp tiến hành

Thí nghiệm gồm 2 nhân tố được lặp lại 3 lần

 Thời gian ngâm đậu: 12 giờ, 16 giờ, 20 giờ và 24 giờ

 Thời gian nấu đậu: 5 phút, 10 phút, 15 phút và 20 phút

Thí nghiệm gồm 16 nghiệm thức với 48 đơn vị thí nghiệm

Quy trình thực hiện

Chuẩn bị nước ngâm acid từ lần ngâm đậu trước

Quan sát và ghi nhận hệ vi sinh vật trong nước ngâm trước khi ngâm đậu

Tiến hành ngâm 50 g đậu trong nước có bổ sung nước ngâm mẻ trước theo các khoảng thời gian 12 giờ, 16 giờ, 20 giờ và 24 giờ

Sau mỗi khoảng thời gian ngâm, tiến hành rút nước ngâm, ghi nhận pH của nước ngâm

Nấu đậu theo các khoảng thời gian 5 phút, 10 phút, 15 phút và 20 phút như trong bố trí thí nghiệm

Chủng đậu nấu với bào tử R oligosporus

Gói đậu đã chủng trong các túi polyethylene và ép miệng túi

Đục lỗ các túi bằng dụng cụ vô trùng

Ủ 24 - 48 giờ ở nhiệt độ phòng Đánh giá khả năng lên men của các mẫu tempe

Chỉ tiêu theo dõi

 pH nước ngâm đậu

 Khả năng lên men của các mẫu tempe (đánh giá cảm quan)

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống chủng lên quá trình lên men tempe Mục đích: Xác định tỷ lệ R oligosporus chủng ban đầu thích hợp cho đậu xanh trong

quá trình lên men tempe

Tiến hành:

Thí nghiệm gồm 1 nhân tố là tỷ lệ giống chủng với 4 nghiệm thức: 0,5%, 1%, 1,5% và 2% Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 12 đơn vị thí nghiệm

Quy trình thực hiện

Chuẩn bị giống chủng R oligosporus LU575 trên môi trường MEA

Chuẩn bị nước ngâm acid từ lần ngâm đậu trước

Chuẩn bị 50 g đậu, ngâm đậu với thời gian thích hợp có được từ kết quả thí nghiệm 3.2.2, để nguội, ráo nước

Nấu đậu trong khoảng thời gian thích hợp (Thí nghiệm 3.2.2)

Chủng đậu nấu với bào tử R oligosporus với tỷ lệ chủng lần lượt là 0,5%, 1%, 1,5%

và 2% như trong bố trí thí nghiệm

Gói đậu đã chủng trong các túi polyethylene và ép miệng túi

Đục lỗ các túi bằng dụng cụ vô trùng

Ủ 24-48 giờ ở nhiệt độ phòng

Ghi nhận nhiệt độ 2-3 lần/ ngày với thiết bị đo nhiệt

Chỉ tiêu theo dõi

 Nhiệt độ sinh ra trong quá trình lên men

 pH, đạm amin của tempe thành phẩm

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên quá trình lên men tempe Mục đích: Xác định nhiệt độ và thời gian lên men thích hợp cho quá trình lên men tempe đậu xanh

Tiến hành:

Thí nghiệm gồm 2 nhân tố, lặp lại 3 lần

 Nhiệt độ ủ: phòng mát (25oC) và nhiệt độ môi trường (28-32o

C)

 Thời gian ủ: 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ

Thí nghiệm gồm 8 nghiệm thức với 24 đơn vị thí nghiệm

Quy trình thực hiện

Chuẩn bị giống chủng R oligosporus LU575 trên môi trường MEA

Chuẩn bị nước ngâm acid từ lần ngâm đậu trước

Chuẩn bị 50 g đậu xanh, ngâm đậu với thời gian thích hợp có được từ thí nghiệm 3.2.2, để nguội và ráo nước

Nấu đậu trong khoảng thời gian thích hợp (Thí nghiệm 3.2.2)

Chủng đậu xanh nấu với bào tử R oligosporus với tỷ lệ thích hợp từ thí nghiệm 3.2.3

Gói đậu đã chủng trong các túi polyethylene và ép miệng túi

Đục lỗ các túi bằng dụng cụ vô trùng

Điều chỉnh nhiệt độ và thời gian ủ sao cho phù hợp với từng nghiệm thức

Ghi nhận nhiệt độ 2-3 lần/ ngày với thiết bị đo nhiệt

Chỉ tiêu theo dõi

 Nhiệt độ sinh ra trong quá trình lên men

 pH, đạm amin của tempe thành phẩm

3.2.5 Sản xuất thử nghiệm và đánh giá chất lượng sản phẩm tempe

Mục đích: Thử nghiệm sản xuất tempe từ đậu xanh theo các điều kiện lên men thích

hợp, sau đó đánh giá chất lượng và phân tích một số chỉ tiêu hóa lý và vi sinh của tempe

thành phẩm

Phương pháp tiến hành

Sản xuất thử tempe từ 500 g đậu xanh theo các điều kiện về thời gian ngâm, thời gian

nấu, tỷ lệ chủng R oligosporus, nhiệt độ và thời gian ủ thích hợp từ các thí nghiệm trên

Quy trình lên men tempe thực hiện tương tự như quy trình tổng quát

Tiến hành đánh giá chất lượng cảm quan, kiểm nghiệm hóa lý và kiểm nghiệm vi sinh tempe thành phẩm

* Các phương pháp phân tích và đánh giá tempe

a Kiểm nghiệm hóa lý

Bảng 3 Những tiêu chuẩn đánh giá chất lượng

(Nguyễn Văn Thành, 2012)

d Phương pháp phân tích thống kê

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và phân tích thống kê bằng chương trình Statgraphic Centurion XVI

Biến động nhỏ về màu sắc

Ở trung tâm ít thâm nhập hơn

Phát triển kém, không khuẩn ty ở trung tâm

Mùi

Dễ chịu, ưa thích (trung hoà, thơm dịu, đậu)

Có thể chấp nhận được (chín, giống nấm men, khai-chua, ngọt)

Mùi khó chịu (thối, khai, chua, )

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân tích nguyên liệu đậu xanh

Kết quả phân tích (Bảng 4) cho thấy đậu xanh có hàm lượng đạm tổng cao (3,91%), là nguyên liệu thích hợp để lên men Kết quả độ ẩm và hàm lượng protein phân tích được không chênh lệch nhiều so với kết quả của USDA về thành phần dinh dưỡng trong 100 g đậu xanh Cụ thể là so với kết quả của USDA, độ ẩm thấp hơn 0,47%, hàm lượng protein thấp hơn 1,6%

Bảng 4 So sánh kết quả phân tích đậu xanh với kết quả của USDA

Kết quả khảo sát nước ngâm đậu (ngâm qua đêm) có chứa nhiều loại vi sinh vật khác nhau, trong đó:

 Tổng vi sinh vật hiếu khí: 1,1 x 1012 CFU/g

 Tổng nấm men và nấm mốc: 8,7 x1011 CFU/g

 Tổng số vi khuẩn acid lactic: 2,4 x 1012

CFU/g Nước ngâm đậu có tổng số vi khuẩn acid lactic cao, các vi khuẩn này làm giảm pH của nước ngâm, giúp ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn trong quá trình lên men tempe Tổng số nấm men và mốc trong nước ngâm thấp hơn tổng số vi sinh vật hiếu khí và thấp hơn khoảng 1,2 lần

4.2 Ảnh hưởng của thời gian ngâm và nấu đậu đến quá trình lên men tempe

Kết quả đo pH của nước ngâm đậu ở các khoảng thời gian khác nhau được thể hiện ở Bảng 5 Kết quả cho thấy nước ngâm đậu có tính acid, với pH trong khoảng 4,2-4,3 và giá trị pH của nước ngâm giảm dần khi thời gian ngâm tăng, tương ứng với độ acid của nước ngâm tăng dần, có sự thay đổi này là do sự phát triển của các vi khuẩn sinh acid lactic trong nước ngâm tăng dần theo thời gian ngâm

Chỉ tiêu Kết quả phân tích USDA Nutrient Database

Bảng 5 Giá trị pH của nước ngâm đậu

*Ghi chú: Giá trị trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.

Từ kết quả thống kê ở độ tin cậy 95% cho thấy nhân tố thời gian ngâm đậu có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng lên men tempe, trong khi đó nhân tố thời gian nấu không có ảnh hưởng Kết quả đánh giá cảm quan các mẫu tempe với thời gian ngâm khác nhau được thể hiện ở Bảng 6

Bảng 6 Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến khả năng lên men tempe

Kết quả đánh giá cảm quan các mẫu tempe với thời gian nấu khác nhau không khác biệt ý nghĩa thống kê ở 5%, với điểm cảm quan trong khoảng 7,4-7,5 (Bảng 7)

Theo Bảng 7, nghiệm thức 20 phút cho kết quả cảm quan cao nhất (7,523) nên sẽ được chọn Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Ko và Hesseltine (1961): đậu được nấu từ 20-30 phút ở 100oC tạo điều kiện cho mốc thâm nhập tốt và hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây hư hỏng

Bảng 7 Ảnh hưởng của thời gian nấu đến khả năng lên men tempe

*Ghi chú: Giá trị trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại Các giá trị có mẫu tự

giống nhau không khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95%

Vậy, nghiệm thức phù hợp cho lên men tempe là: thời gian ngâm 16 giờ và thời gian nấu 20 phút

4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống chủng lên quá trình lên men tempe

Kết quả thống kê cho thấy tỷ lệ giống chủng có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng

đạm amin của tempe (Bảng 8)

Bảng 8 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống chủng đến hàm lượng đạm amin (mgN/g) của tempe

*Ghi chú: Giá trị trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại Các giá trị có mẫu tự

giống nhau không khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95%

Với tỷ lệ giống 1%, hàm lượng đạm amin của tempe đạt cao nhất là 7,133 mgN/g (Bảng 7), tỷ lệ 0,5% cho hàm lượng đạm amin thấp nhất (4,239 mgN/g) Tỷ lệ 1% không khác biệt ý nghĩa với tỷ lệ 1,5% nhưng khác biệt ý nghĩa với các tỷ lệ 0,5% và 2% ở độ tin cậy 95% Vì vậy, để đạt hàm lượng amin của tempe cao và tiết kiệm giống, tỷ lệ giống chủng phù hợp là 1%

Giá trị pH của các mẫu tempe lên men với các tỷ lệ giống chủng 0,5%, 1%, 1,5% và 2% được thể hiện ở Hình 4

Hình 4 Giá trị pH của các mẫu tempe với các tỷ lệ giống khác nhau

Các mẫu tempe sau khi lên men đều có pH < 6 (Hình 4) Trong đó, nghiệm thức 2%

có pH cao nhất (5,9), thấp nhất là nghiệm thức 1,5% với pH = 5,67

Nhìn chung, sự thay đổi nhiệt độ trong quá trình lên men của các mẫu tempe với các

tỷ lệ giống khác nhau tương đối giống nhau (Hình 5)

Hình 5 Sự thay đổi nhiệt độ của các mẫu tempe với tỷ lệ giống khác nhau

Hình 5 cho thấy nhiệt độ trước lên men của tempe vào khoảng 32oC Sau khi ủ 6 giờ, nhiệt độ hạ xuống còn khoảng 30-31oC, có sự giảm nhiệt độ có thể do khi chủng mốc vào,