Nghiên cứu thành phần hóa học của cây chè dây trồng ở sapa

Để góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc thu hái chè dây trồng làm nguyên liệu sản xuất thuốc, em tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học cây chè dây trồng ở Sapa Lào

[| ^ ; ^ m

BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGỌC QUÝ

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÈ DÂY

TRỔNG ở SAPA

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ược SỸ KHOÁ 2001-2006)

Người hướng dẫn : GS.TS Phạm Thanh Kỳ

ThS Nguyễn Huy Văn

Nơi thực hiện : Bộ môn Dược liệu

Trường Đại học Dược Hà Nội

Thời gian thực hiện : Từ 2/2006 đến 5/2006

HÀ NỘI, 05/ 2006

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn:

GS TS Phạm Thanh Kỳ

Th.s Nguyễn Huy Văn

đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình làm khoá luận

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ bộ môn Dược liệu và phòng Thí nghiệm trung tâm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt quá trình làm và hoàn thành khoá luận

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người luôn sát cánh, cổ vũ, động viên em trong suốt quá trình làm khoá luận

Hà Nội ngày 19/05/2006

Nguyễn Thị Ngọc Quý

MỤC LỤC

ĐẶT VÂN ĐỂ 1

PHẦN I: TỒNG QUAN 2

1.1 Vị trí phân loại và phân bố của cây Chè Dây {Ampelopsis cantoniensis (Hook et Arn.) Planch., Vitaceae) 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Phân b ố 2

1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.2.1 Đặc điểm thực vật họ Nho (Vitaceae) 3

1.2.2 Đặc điểm thực vật của chi Ampelopsis 4

1.2.3 Đặc điểm thực vật cây Chè dây {A cantoniensis (Hook et Arn.) Planch) 4

1.3 Đặc điểm sinh thái 6

1.4 Thành phần hoá h ọ c 6

1.5 Tác dụng sinh học .8

1.5.1 Tác dụng chống loét dạ d à y 8

1.5.2 Tác dụng giảm đau 8

1.5.3 Tác dụng kháng khuẩn 8

1.5.4 Tác dụng chống oxy h o á 8

1.5.5 Độc tính c ấ p 9

1.5.6 Độc tính bán trường diễn 9

1.6 Tính vị, công năng 9

1.7 Công dụng 9

1.7.1 Kinh nghiệm dân gian 9

1.7.2 Một số bài thuốc có chè d â y 9

1.7.3 Biệt dược AMPELOP và phác đồ điều trị viêm loét dạ dày-hành tá tràng 10

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 12

2.1 Nguyên liệu 12

2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

PHẦN III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT q u ả 14

3.1 Định tính các nhóm chất trong lá Chè dây trồng ở Sapa bằng phản ứng hoá học 14

3.1.1 Định tính glycosid tim 14

3.1.2 Định tính Aavonoid 15

3.1.3 Định tính Anthranoid 15

3.1.4 Định tính coumarin 16

3.1.5 Định tính Tanin 17

3.1.6 Định tính Saponin 17

3.1.7 Định tính Alcaloid 18

3.1.8 Định tính đưòfng khử tự d o 18

3.1.9 Định tính acid hữu cơ 18

3.1.10 Định tính chất béo 19

3.1.11 Định tính Caroten 19

3.1.12 Định tính Sterol 19

3.1.13 Định tính acid amin 19

3.2 Kết quả định tính 2 nhóm chất chính trong lá chè dây trồng ở Sapa tại các thời điểm thu hái khác nhau 21

3.3 Định tính Aavonoid bằng sắc ký lớp mỏng 21

3.4 Định lượng chất chiết được trong phân đoạn ethyl acetat 25

3.5 Phân lập các chất trong lá chè dây trồng ở Sapa 29

3.5.1 Chất nhồi cột là Sephadex LH20 29

3.5.2 Chất nhồi cột là silicagen 6 0 29

3.6 Nhận dạng các chất phân lập được 31

3.6.1 Chất F 1 ! 31

3.6.2 Chất F 2 32

3.6.3 Chất F 3 32

PHẨN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 34

4.1 Kết luận 34

4.2 Đề xuất 34

ĐẶT VẤN ĐỂ

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có thảm thực vật rất phong phú

và đa dạng, do đó cũng có nguồn dược liệu rất quý và dồi dào Điều đó càng khẳng định vị thế quan trọng của dược liệu trong ngành y tế Việt Nam

Chè dây là dược liệu đã được nghiên cứu về thực vật, xác định tên khoa học, về thành phần hoá học, độc tính và một số tác dụng sinh học Chế phẩm AMPELOP chữa viêm loét dạ dày- hành tá tràng do công ty cổ phần Traphaco sản xuất từ chè dây đã được chứng minh có tác dụng tốt trên lâm sàng và được

Bộ y tế cấp giấy phép lưu hành Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy Chè dây

là một dược liệu có giá trị sử dụng cao và có tiềm năng khai thác tốt Tuy nhiên, nếu chỉ biết khai thác mà không có phương án phát triển lâu dài thì dù dược liệu có nhiều đến đâu cũng sẽ hết Do đó, hiện nay, Công ty cổ phần Traphaco đang thực hiện đề tài: Nghiên cứu trồng cây Chè dây tại Sapa (Lào Cai) để đảm bảo nguyên liệu lâu dài cho sản xuất thuốc AMPELOP

Để góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc thu hái chè dây trồng làm nguyên

liệu sản xuất thuốc, em tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thành phần

hóa học cây chè dây trồng ở Sapa (Lào Cai)*' với các nội dung chính sau:

-Định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá chè dây trồng ở Sapa

-Định lượng phân đoạn chiết ethylacetat trong lá chè dây trồng ở Sapa tại các thời điểm thu hái khác nhau

-Phân lập các chất chính

PHẦN I: TỔNG QUAN

1.1 VỊ trí phân loại và phân bố của cây Chè Dây {Ampélopsis cantoniensis

(Hook, et Arn.) Planch., Vitaceae)

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại Takhtajan 1987 [4], vị trí phân loại của cây Chè Dây như sau:

Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa Hồng (Rosidae) Liên bộ Nho (Vitanae)

Bộ Nho (Vitales)

Họ Nho (Vitaceae) Chi Ampélopsis

Trước đây, họ Nho và họ Gối hạc được xếp vào bộ Táo ta (Rhamnales) Từ năm 1987, hai họ này được tách ra và lập thành bộ Nho (Vitales) Trong Flore générale de r Indochine, họ Nho mang tên Latin là Ampelidaceae [4], [11]

1.2 Đặc điểm thực vật

1.2.1 Đặc điểm thực vật họ Nho (Vitaceae)

Theo Vũ Văn Chuyên [3], [8], đặc điểm chung của các cây trong họ Nho là: Cây bụi leo hay dây thân gỗ có tua cuốn phát triển và chỉ có một số ít là cây bụi đứng thẳng hay cây gỗ nhỏ Tua cuốn có nguồn gốc từ thân do đó mọc đối diện với lá Lá mọc so le, có lá kèm và có hình dạng khác nhau: lá đơn, nguyên, hay khía thùy hoặc lá kép chân vịt Hoa nhỏ tập hợp thành cụm hoa xim, chùm hay ngù Hoa lưỡng tính hay có khi tiêu giảm trở thành hoa đơn tính Đài, tràng và bộ nhị theo mẫu 4 - 5 Đài thường nhỏ, không phát triển, và trông như những vảy nhỏ Tràng có 4 - 5 cánh hoa xếp xen kẽ với các lá đài

Bộ nhị bao giờ cũng tiêu giảm chỉ còn một vòng 4 - 5 nhị xếp đối diện với cánh hoa, rời nhau, chỉ nhị cong vào trong rồi dựng đứng đột ngột; bao phấn 2

ô, mở bằng một kẽ nứt dọc trong [12] Giữa bộ nhị và bộ nhụy có đĩa mật phát triển, hình vòng khuyên khía thùy hoặc chỉ là những tuyến riêng rẽ Nhụy thường gồm hai lá noãn dính lại với nhau thành bầu trên có 2 ô, trong mỗi ô

có 2 noãn Một vòi nhụy Núm nhụy hình đĩa hoặc hình đầu, hoặc có khi chia làm 4 thùy (Tetrastigma - dây quai bị) Quả mọng Hạt có phôi nhỏ và có nội nhũ Cây thụ phấn nhờ gió

Theo Nguyễn Tiến Bân [5], họ Nho rất gần với Rhamnaceae (hoa mẫu 4

-5, nhị đối diện với cánh hoa và dính vào mép ngoài của triền), nhưng ở đây chủ yếu là dây leo thân gỗ có tua cuốn; lá thưcmg xẻ thùy chân vịt với gân chân vịt, hoặc lá kép chân vịt (gồm 3 - 5 - 7 lá chét), ít khi lá kép lông chim;

bộ nhụy gồm 2 lá noãn hợp thành bầu thượng 2 (6) ô, mỗi ô chứa 2 (1) noãn; thường là quả mọng; hạt thường có nội nhũ cuốn

Họ Nho trên thế giới có khoảng 11 chi và trên 700 loài phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, một số ít đại diện ở vùng ôn đới (chủ yếu là các loàithuộc chi Vitis, Ampélopsis và Parthenocissus) [5], [8] ở Việt Nam, họ Nho

có 7 chi và 61 loài [3], [5]

1.2.2 Đặc điểm thực vật của chi Ampélopsis

Theo Lecomte [29], chi Ampélopsis có đặc điểm chung: Cây bụi leo Thân

có tua cuốn đối diện với lá Lá đơn, khía răng hay chia thùy, đôi khi chia thành 3 - 5 lá chét gần như không cuống; hoặc lá kép lông chim hoặc hai lần lông chim Cụm hoa ngù, mọc đối diện với lá Hoa nhỏ, lưỡng tính, mẫu 5 Đài hình chén, uốn lượn Nhị đối diện với cánh hoa, thường nằm trong hõm của cánh hoa; bao phấn hướng trong Đĩa dính liền với bầu tạo thành một vành hay vành quanh co bao lấy bầu Bầu nhụy chỉ nhô lên ở phần trên, bầu 2 ô, mỗi ô 2 noãn; vòi hình trụ; đầu nhụy không rõ Quả mọng, nhỏ, hầu như khô;

có 3 - 4 hạt hình trứng ngược, thót dần về phía gốc; mặt bụng hạt có 2 rãnh hình dải hẹp dạng như lỗ khuyết; phôi nhũ không xếp nếp

Theo “Từđiển thực vật thông dụng” [7], đặc điểm chung của các cây trong chi Ampélopsis: Cây bụi leo, thân có tua cuốn quấn, vỏ cố lỗ bì sẫm và có

chấm trắng Tuỷ gổ trắng Lá sớm rụng, mọc so le, đơn hay kép, có cuống dài

Hoa nhỏ, màu lục nằm trên một cuống hoa dài xếp thành xim lưỡng phân đối

diện với lá hay mọc ò ngọn Hoa lưỡng tính, mẫu 5, có khi mẫu 4, nhị ngắn

Quả mọng, có 1 - 4 hạt

Gồm 20 loài của châu Mỹ và châu Á

ở nước ta có 5 loài: A brevipedunculata (Maxim.) Trautv.

A cantoniensỉs (Hook, et Arn.) Planch.

A heterophylla Sieb, et Zucc.

A japónica (Thunb.) Makino.

A annamensis Gagn [11]

1.2.3 Đặc điểm thực vật cây Chè dây (A cantonỉensỉs (Hook, et Arn.) Planch)

Theo Lecomte [29], loài Ampélopsis cantoniensis Planch, chính là loài

Cissus cantoniensis Hooker et Am = Cissus deversifolia Walp Cũng có tác

giả gọi loài này là Vitis cantoniensis Seem Cả ba tên nay được dùng với tên thông dụng là Ampélopsis cantoniensis (Hook, et Am.) Planch, và được mô tả:

Thân leo Cành hình trụ mảnh, phủ lông tơ mịn Tua cuốn chia 2 - 3 nhánh, mọc đối với lá, thay thế cho cụm hoa bị thui đi Lá kép lông chim hay hai lần lông chim; có 7 - 12 lá chét hoặc hơn Lá hình trái xoan nhọn hay không, tròn

ở gốc, trừ cái cuối cùng gần như hình tim; dài 2,5 - 7,5 cm, rộng 1 , 5 - 5 cm Phiến lá nhẵn hoặc gần nhẩn; rất nhạt ở mặt dưới; răng cưa không rõ, ít khi giảm thành một mũi nhọn; gân bên 4 - 5 đôi, có nhú nhỏ; gân con thành mạng lưới sít Cuống lá chét dài 3 - 1 0 mm; lá chét cuối dài gấp 2 lần các lá khác

Lá kép dài 10 - 30 cm Lá kèm gần như tròn, đường kính 3 - 4 mm, dạng màng khô Hoa mọc thành ngù mảnh đối diện với lá, rộng 3 - 6 cm, chia 2 - 3 nhánh; cuống cụm hoa mảnh và ngắn hơn cuống lá, chỉ hơi dài hơn nụ, có phủ lông tơ ngắn; nụ hoa hình trứng, tròn Đài hình chén, uốn lượn, có lông mịn Cánh hoa 5, hình trái xoan tù, hơi có gợn ở mép, hơi có mũ ở đỉnh, dài 2 mm, mép dày và mỏng dần vào phía trong của cánh Nhị 5, chỉ nhị hình sợi chỉ; bao phấn hình trái xoan, trung đới màu nâu ở mặt lưng Đĩa dính vào bầu, mép rộng, có vân, không có khía Bầu nhụy nhẵn, hình nón, có 2 ô, mỗi ô 2 noãn; vòi hình trụ; đầu nhụy hơi hình đĩa Quả mọng, màu đen, 5x4 mm, chứa 3 - 4 hạt, lồi và nhăn nheo ở phía lưng, có hai mặt bụng, hình trái xoan ngược, hẹp dần ở gốc, mặt cắt ngang hình chữ T, hố nhỏ thuôn, choãi ra ngay từ gốc Mùa hoa: tháng 6, mùa quả: tháng 9

Sách “Cây thuốc và động vật làm thuốc” [26], “Từ điển bách khoa dược

học” [25] mô tả cây chè dây như sau: Cây leo Thân và cành cứng, hình trụ,

có lông nhỏ Tua cuốn chẻ đôi, mọc đối diện với lá Lá kép lông chim, mọc so

le, có 7 -13 lá chét có cuống, hình trái xoan, dài 2,5 - 7,5 cm, rộng 1, 5-5 cm,

gốc tròn, đầu nhọn, mép có ít răng cưa, nhẵn, mặt trên lá khi khô có những vết

trắng loang lổ như bị nấm mốc, mặt dưới rất nhạt; lá kèm khô xác Cụm hoa

mọc đối diện với lá thành ngù phân nhiều nhánh, rộng 3 - 6 cm; hoa nhiều

màu trắng; đài hoa hình chén, có lông mịn, 5 răng ngắn; tràng có 5 cánh, mép hơi nhăn; nhị 5, chỉ nhị mảnh; bầu hình nón, nhẵn, có 2 ô, mỗi ô 2 noãn Quả

mọng, khi chín màu đen; hạt 3 - 4 , thót lại ở gốc.

Sách “Cầỵ cỏ Việt N am ” [11], “Từđiển thực vật thông dụng” [7] và “Từ

điển cây thuốc Việt N a m ” [6] ghi: Dây leo, cành hình trụ mảnh, tua cuốn đối diện với lá, chia 2- 3 nhánh Lá hai lần kép, mang 7 - 12 lá chét mỏng, giòn, mép có răng thấp; gân bên 4 - 5 đôi; lá kèm gần tròn, dạng vẩy Ngù hoa đối diện với lá có 3 - 4 nhánh; nụ hoa hình trứng; hoa mẫu 5 Quả mọng hình trái xoan to 6x5 mm, màu đen, chứa 3 - 4 hạt

1.3 Đặc điểm sinh thái

Chè dây là loại cây ưa ẩm và ưa ánh sáng, thường leo và mọc trùm lên trên các loại cây bụi và cây gỗ nhỏ ở vùng đồi, ven rừng hoặc ở bờ nương rẫy Độ cao phân bố từ 600 đến 1600 m Cây tỏ ra thích nghi với vùng cận nhiệt đới núi cao như Hà Giang, Lào Cai Mùa ra chồi và sinh trưỏfng mạnh trùng với mùa mưa ẩm Những cây mọc trùm lên các loại cây khác có nhiều hoa quả hơn cây bị che bóng Chè dây có khả năng tái sinh chồi mạnh sau khi bị cắt cành [25]

Cây có thể trồng được bằng cách gieo hạt và các cây con thu thập trong tự nhiên [25]

Hiện nay, Công ty cổ phần Trapharco đang thực hiện đề tài: Nghiên cứu trồng Chè dây tại Sapa (Lào Cai) để đảm bảo nguyên liệu lâu dài cho sản xuất thuốc Ampelop

1.4 Thành phần hoá học

ở Việt Nam, thành phần hoá học của cây Chè dây đã được nghiên cứu khá

đầy đủ và đã được đưa vào các tài liệu tra cứu: Cây thuốc và động vật làm

thuốc [26], Từ điển bách khoa dược học [25].

Kết quả nghiên cứu của Phùng Thị Vinh [21], Vương Thị Hồng Vân [20] cho thấy: Chè dây có chứa ílavonoid, tanin, đường, caroten, sterol và acid hữu cơ.

Theo Phạm Thanh Kỳ và cộng sự, hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá chè dây là 18,15% ± 0,36% Flavonoid tồn tại dưới 2 dạng aglycon và glycosid [14], [16], [20], [21]

SKLM flavonoid toàn phần với hệ dung môi Toluen-Ethyacetat-Acid formic (5:6:1) cho 8 vết Dùng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng điều chế phân

lập được 2 ílavonoid tinh khiết là myricetin (3, 5, 7, 3’, 4 ’, 5’- hexahydroxyllavon) và ampelopsin (2,3-dihydromyricetin) Định lượng riêng

biệt 2 thành phần này bằng HPLC cho kết quả: myricetin 5,32% ± 0,05% và 2,3- dihydromyricetin 53,83% ± 0,75% [17], [20], [21], [22]

Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả Trung Quốc, Chè dây có chứa 25,2% ampelopsin và 1,77% myricetin tính theo dược liệu khô [28]

OH oMyricetin

1.5.3 Tác dụng kháng khuẩn

Dùng phương pháp đục lỗ trên môi trường thạch với 2 nồng độ 0,5% và 1% flavonoid toàn phần

Kết quả: Flavonoid chè dây cố tác dụng:

+ Khá: trên Baccilus subtilis ATCC 6633 (nồng độ 1% gần bằng

Ampicillin 0,2 Ul/ml), B.pumilus ATCC 8241 (mạnh hơn erythromycin 0,2 ưl/ml), B.cereus 958 (yếu hơn tetracyclin 2 Ul/ml)

+ Yếu: trên Staphylococcus aureus, Escherichia coli

+ Không có tác dụng trên Shigella.

1.5.4 Tác dụng chống oxy hoá

Đã thử cao khô toàn phần chè dây và 2 flavonoid là myricetin và dihydromyricetin, thấy cả 3 chế phẩm đều có tác dụng chống oxy hoá khá mạnh [24]

Cao khồ toàn phần của lá chè dây có tác dụng chậm hcfn (hoạt tính chống oxy hoá vẫn tăng trong thời gian theo dõi phản ứng là 30 phút), có thể đây là một hiện tượng hoạt chất có tác dụng được giải phóng ra từ từ [24].

1.5.5 Độc tính cấp

Dược liệu được chiết bằng cách sắc, rồi cô đến tỷ lệ thích hợp, cho chuột nhắt trắng uống với liều tính ra dược liệu khô là 500g/kg, chuột không chết, chứng tỏ thuốc có độc tính cấp rất thấp

1.7.1 Kinh nghiệm dân gian

Nhân dân vùng núi phía Bắc dùng pha nước uống hàng ngày thay chè và để trị đau dạ dày

Nhân dân vùng Lạng Sơn dùng đắp lá vào chỗ bị viêm tấy có mủ (áp xe vú)

Có nơi nhân dân dùng lá tươi đắp vào các vết bỏng

Tài liệu Trung Quốc dùng chè dây chữa viêm kết mạc cấp tính, viêm gan thể hoàng đản, cảm mạo phong nhiệt, viêm họng, mụn nhọt Dùng toàn cây ngày 15 - 60g sắc uống Dùng ngoài, lấy cây tươi, đun sôi, xông, chữa viêm kết mạc cấp

1.7.2 Một sô bài thuốc có chè dây [26]

- Chữa đau dạ dày

Theo kinh nghiệm của đồng bào Tày, hàng ngày, lấy 30-50g dược liệu, hãm hoặc sắc uống làm nhiều lần Một đợt điều trị dùng liên tục từ 15-30 ngày

- Phòng bệnh sốt rét

Chè dây 60 g, lá hồng bì 60 g, rễ cỏ xước, lá đại bi, lá tía tô, lá hoặc vỏ cây vối, rễ xoan rừng mỗi thứ 12 g, thái nhỏ, phơi khô, sắc với 400 ml nước còn

100 ml uống trong ngày Cứ 3 ngày dùng 1 thang

- Chữa tê thấp đau nhức

Lá chè dây tươi giã nát, hơ nóng, gói vào vải sạch, đắp vào chỗ đau nhức

1.7.3 Biệt dược AMPELOP và phác đồ điều trị viêm loét dạ dày- hành tá tràng

AMPELOP là chế phẩm chiết xuất từ cây Chè dây (A cantoniensis

Planch.) có chứa 80% ílavonoid toàn phần Chế phẩm đã được thử nghiệm

rộng rãi trên lâm sàng và chứng minh được tác dụng tốt trong điều trị viêm loét dạ dày- hành tá tràng

- Trong luận án PTS của Vũ Nam [19] đã nghiên cứu chế phẩm AMPELOP trên lâm sàng điều trị cho 44 bệnh nhân so sánh với nhóm dùng Alusi (36 bệnh nhân) cho một số kết quả sau:

Để nâng cao hiệu quả điều trị của thuốc AMPELOP, các nhà lâm sàng đưa

ra một phác đồ điều trị: dùng AMPELOP trong 1 tháng kết hợp với AMOXICILLIN và METRONIDAZOLE (FLAGYL) uống trong 10 ngày đầu.-Nguyễn Thị Tuyết Lan [18] theo dõi điều trị cho 40 bệnh nhân loét hành

tá tràng có nhiễm Helicobacter pylori (HP) bằng nhóm thuốc AMPELOP- METRONIDAZOLE-AMOXICILLIN (AMA) trong luận án Thạc sỹ y học đã kết luận:

Cắt cơn đau sau 2 tuần điều trị 95%

Liền sẹo ổ loét tá tràng 92,5%

Giảm hoạt động viêm của niêm

mạc hang vị dạ dày

Rõ rệt: từ viêm hoạt động mức độ vừa và nặng sang viêm không hoạt động hoặc hoạt động nhẹ

Nhóm thuốc AMA được dung nạp tốt, không có tác dụng không mong muốn

PHẦN II; NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU2.1 Nguyên liệu

-Nguyên liệu là lá cây chè dây trồng và thu hái tự nhiên ở Sapa trong

khoảng thời gian từ tháng 08/2004 đến tháng 12/2005

03: thu hái cây mọc hoang

-KH khác:

N: rửa bằng nướct: mẫu rửa khi tươik: mẫu rửa khi khôOz: xử lý vi sinh bằng khí Ô zôn

-Nguyên liệu sau khi thu hái được sấy khô và đóng gói trong túi nilon kín

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thành phần hoá học trong cây chè dây

- Định tính các nhóm chất trong lá chè dây theo tài liệu “Bài giảng dược liệu” [1], “Thực tập dược liệu” [2]

- Định lượng phân đoạn chiết ethylacetat trong lá chè dây theo phương pháp cân

- Phân lập các chất theo tài liệu “Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc” [10] và “The Aavonoid: Advances in research” [27]

- Xác định độ ẩm trên máy Sartorius (Germany) tại bộ môn dược liệu

- Đo phổ u v trên máy UV-VIS Spectrophotometer cary lE tại phòng Thí nghiệm trung tâm- Đại học Dược Hà Nội

- Đo phổ IR tại phòng Thí nghiệm trung tâm- Đại học Dược Hà Nội

- Đo phổ khối trên máy 5989B MS tại phòng cấu trúc- Viện hoá học

PHẦN III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Định tính các nhóm chất trong lá Chè dây trồng ở Sapa bằng phản ứng hoá học

Mẫu dược liệu: AC0408-02-01 thu hái 18/08/2004

3.1.1 Định tính glycosid tỉm

Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 250 ml, thêm 100 ml cồn 25°, ngâm ở nhiệt độ phòng 24h Lọc qua bông vào cốc có mỏ Dịch chiết loại tạp bằng dung dịch chì acetat 30% dư, khuấy đều, để lắng, lọc qua giấy lọc Chuyển dịch lọc vào bình gạn 125 ml, lắc với Chloroform 3 lần, mỗi lần

15 ml, gạn lớp Chloroform vào cốc có mỏ, chia đều dịch chiết Chloroform vào 4 ống nghiệm nhỏ sạch, khô, cô trên nồi cách thuỷ đến khô, cắn còn lại tiến hành phản ứng:

-Phản ứng Liebermann:

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn, cho thêm đồng lượng acid sulfuric đặc theo thành ống nghiêm cho phân thành 2 lớp

-> Thấy xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp phân cách (Phản ứng dương tính)

-Phản ứng Legal:

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml ethanol 90°, lắc cho tan hết cắn, thêm

1 giọt TT Natrinitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%

-> Không thấy xuất hiện màu đỏ (Phản ứng âm tính)

-Phản ứng Cyanỉdin:

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm một ít bột Magiê kim loại Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt) Để yên vài phút, dung dịch chuyển từ màu xanh vàng sang đỏ đậm (Phản ứng dương tính)

-Phản ứng vôi NHj:

Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, để khô rồi đặt lên miệng lọ amoniac đặc đã

mở nút, thấy màu vàng của dịch chiết tăng lên rõ rệt (Phản ứng dưoỉng tính)

bình gạn, lắc với 5 ml ether ethylic Gạn lấy phần ether để tiến hành phản ứng: Lấy 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch NH4OH 10%, lắc, không thấy xuất hiện màu hồng (Phản ứng âm tính).

Kết luân: Dược liệu không có Anthranoid

3.1.4 Định tính coumarin

Lấy 3 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 30 ml cồn 90° Đun cách thuỷ 5 phút Lọc nóng, dịch chiết thu được dùng làm phản ứng:

-Phản ứng mở, đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết

Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%

-Phản ứng với thuốc thử Diazo:

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch c h iế t, thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10% Đun đến sôi rồi để nguội, thêm vài giọt TT Diazo mới pha, không thấy xuất hiện màu đỏ gạch (Phản ứng âm tính)

-Vi thăng hoa:

Cho một ít bột dược liệu vào nắp chai bằng nhôm Đậy lên trên bằng một phiến kính dày, mặt trên phiến kính có để một ít bông thấm nước Đun nhẹ

dưới nút nhôm cho vi thăng hoa Lấy phiến kính ra, bỏ bông thấm nước, lật ngược tấm kính rồi nhỏ 1 giọt TT KI 10%, đem soi dưới kính hiển vi, khồng thấy tinh thể màu tím (Phản ứng âm tính).

-Quan sát huỳnh quang:

Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên đó 1 giọt dung dịch NaOH 10% Để khô, che 1/2 vết với đồng xu rồi soi dưới ánh sáng đèn tử ngoại tại bước sóng 365nm trong vài phút không thấy phát huỳnh quang (Phản ứng âm tính).Kết luân: Dược liệu không có coumarin

3.1.5 Định tính Tanỉn:

Cho vào ống nghiệm Ig dược liệu, thêm 10 ml nước cất, đun sôi trực tiếp 5 phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp Dịch lọc làm các phản ứng sau:

-Phản ứng với dung dịch FeClj 5%:

Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 5 giọt PeClg 5%, lắc thấy xuất hiện tủa xanh đen (Phản ứng dương tính)

-Phản ứng với dung dịch gelatin 1%:

Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 5 giọt gelatin 1%, thấy xuất hiện tủa bông trắng (Phản ứng dương tính)

Kết luân: Dược liệu không có Saponin.

3.1.7 Định tính Alcaloid

Cho khoảng 3 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch NH4OH 0,5N Sau 30 phút cho 15 ml CHCI3 vào, đậy kín Ngâm 12h, gạn dịch CHCI3 vào bình gạn Sau đó, lắc kỹ với dung dịch H2SO4 IN Gạn lấy dịch chiết acid để làm các phản ứng với thuốc thử chung của alcaloid

-Phản ứng với thuốc thử Dragendorjf:

Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Dragendorff, không thấy xuất hiện tủa da cam (Phản ứng âm tính)

-Phản ứng với thuốc thử Mayer:

Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer, không thấy xuất hiện tủa trắng (Phản ứng âm tính)

-Phản ứng với thuốc thử Bouchardat:

Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, không thấy xuất hiện tủa nâu (Phản ứng âm tính)

Kết luân: Dược liệu không có alcaloid

3.1.8 Định tính đường khử tự do

Lấy 2 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10 ml cồn Đun cách thuỷ 10 phút, lọc Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và 3 giọt Fehling B, đun cách thuỷ trong 10 phút thấy có tủa đỏ gạch (Phản ứng dương tính)

Kết luân: Dược liệu có đường khử tự do

3.1.9 Định tính acid hữu cơ

Lấy 1 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 20 ml nước cất Đun cách thuỷ 30 phút, để nguội, lọc Cho vào dịch lọc một ít tinh thể Na2C03 thấy xuất hiện bọt khí nổi lên (Phản ứng dương tính)

Kết luân: Dược liệu có acid hữu cơ

3.1.10 Định tính chất béo

Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón có nút mài dung tích 50 ml, đổ ngập ether dầu hoả, ngâm qua đêm, lọc Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi, không thấy để lại vết mờ trên giấy lọc (Phản ứng âm tính)

Kết luân: Dược liệu không có chất béo

3.1.11 Định tính Caroten

Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết ether dầu hoả đem bốc hơi tới khô, cắn thu được thêm 1 - 2 giọt H2SO4 đặc thấy xuất hiện màu xanh lục (Phản ứng dương tính)

Kết luân: Dược liệu có caroten

3.1.12 Định tính Sterol

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu hoả Bốc hơi dung môi tới khô Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ, để nghiêng ống nghiệm 45° rồi thêm 1 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiêm thấy mặt phâncách giữa 2 lớp chất lỏng có vòng màu nâu đỏ

Kết luân: Dược liệu có Sterol

3.1.13 Định tính acid amin

Cho 2 g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước cất đun sôỉ 5 phút Lọc nóng, lấy 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thuỷ sôi trong 10 phút, không thấy xuất hiện màu tím (Phản ứng âm tính)

Kết luân: Dược liệu không có acid amin

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá chè dây trồng ở Sapa thuhái 18/08/2004 được trình bày tóm tắt ở bảng 3.1:

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ

Chú thích:

(+++): rất rõ (++): rõ (+): không rõ (-): âm tínhKết luận: Trong lá chè dây trồng ở Sapa có flavonoid, tanin, đường khử tự

do, acid hữu cơ, caroten, sterol

3.2 Kết quả định tính 2 nhóm chất chính trong lá chè dây trồng ở Sapa tại các thời điểm thu hái khác nhau.

Tiến hành định tính flavonoid và tanin theo quy trình như ở mục 3.1.2 và

3.1.5 Kết quả định tính được tóm tắt ở bảng sau:

Bảng 3.2: Kết quả định tính Flavonoid và Tanin tại các thời điểm thu hái

10%

Đồng acetate

-Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Lấy 5 g bột lá chè dây chiết với 50 ml cồn 70° trên cách thuỷ Lọc nóng, bốc hơi dịch lọc cho hết hơi cồn Loại tạp bằng dung dịch gelatin 1% Lắc dịch chiết còn lại với ethyl acetat Lấy dịch chiết ethyl acetat để bay hơi hết dung môi, hoà cắn trong 10 ml cồn 90° để chấm sắc ký.

-Dùng bản mỏng silicagen GF254 (MERCK) đã tráng sẵn và hoạt hoá ở 110°c trong 60 phút

-Hệ dung môi khai triển: Toluen- Ethyl acetat- Acid formic [5:6:1,5]

-Thuốc thử hiện màu: dung dịch AICI3 3% trong cồn

Kết quả SKLM được ghi ở bảng 3.3.1, bảng 3.3.2 và sắc ký đồ Hình 3.3.1, Hình 3.3.2 và Hình 3.3.3:

Hình 3.3.1: SKLM Flavonoid TP khi phun AICI ị

Bảng 3.3.2: Sự có mặt của các vết trên sắc ký đồ ở các mẫu chè dây trồng và thu hái tự nhiên vào các thời điểm khác nhau

và Bản Khoang thu hái vào tháng 8/2004 và mẫu thu hái tự nhiên vào tháng 4/2005 và tháng 7/2005 có thêm vết VIO Mẫu thu hái tự nhiên tháng 7/2005 còn có thêm vết V7, V9

Khi phun thuốc thử AICI3 chỉ có 4 vết hiện màu với thuốc thử: VI, V2, V5,

V6 -> Đây là các vết flavonoid Những vết còn lại không hiện màu với thuốc thử AICI3 không phải là flavonoid, đó là những tạp chất cần loại đi trong quá trình định lượng Vết V7 và VIO phát quang màu đỏ dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366 nm có thể là chlorophyl

3.4 Định lượng chất chiết được trong phân đoạn ethyl acetat

Cân chính xác khoảng 2 g bột lá chè dây đã xác định độ ẩm Cho vào bình

soxhlet, chiết với ether dầu hoả trên cách thuỷ trong 10 giờ Để dược liệu ở

nhiệt độ phòng cho bay hơi hết dung môi rồi chiết tiếp bằng CHCI3 trong

Soxhlet trên cách thuỷ đến khi dung dịch không còn màu xanh Để dược liệu ở

nhiệt độ phòng cho bay hơi hết dung môi rồi chiết bằng 20 ml cồn 90° trong bình cầu có lắp sinh hàn ngược trong cách thuỷ sôi Sau 10 phút rút dịch chiết rồi chiết tiếp bằng những lượng cồn khác đến khi hết Aavonoid (thử bằng cách nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc, để khô rồi đặt lên miệng lọ amoniac đặc không được có màu vàng) Gộp các dịch chiết, cất thu hồi cồn đến khi còn dịch chiết nước (khoảng 20 ml) Để nguội, nhỏ dung dịch gelatin 1% đến khi không còn tủa trắng Lắc hỗn hợp dịch chiết và tủa với ethyl acetat trong bình gạn tới khi chiết hết Aavonoid Gộp dịch chiết, cất thu hồi ethyl acetat, bốc hơi

tới cắn, sấy ở 50°c đến khối lượng không đổi, đem cân

Hàm lượng chất chiết được trong phân đoạn ethyl acetat được tính theo công thức:

F = - ị -x i o o

M x ( l - x )F: Hàm lượng chất chiéỉ được trong phân đoạn ethylacetat (%)

a: Khối lượng cắn thu được (g)

M: Khối lượng dược liệu đem định lượng (g)

x: Độ ẩm dược liệu (%)

Mỗi mẫu dược liệu được làm 3 lần, kết quả định lượng được ghi ở bảng 3.4

S ơ đồỵu ỵ trình định lượng phân đoạn chiết ethylacetat:

Dịch ehret nước

Cất thu hổi

DịchLắc trong bình gạn

+ Gelatin 1% (loại tanin) chiết + tủa

— Ethylacetat

Ethylacetat thu hồi

Dịch chiết ethylacetat

Cất thu hồi ethylacetat đậm đặc Bốc hơi dung môiDịch chiêì

Ỷ

Cắn ethylacetat

Sấy ở 50°c, cân