tại các thời điểm thu hái khác nhau.
Tiến hành định tính flavonoid và tanin theo quy trình như ở mục 3.1.2 và 3.1.5. Kết quả định tính được tóm tắt ở bảng sau:
Bảng 3.2: Kết quả định tính Flavonoid và Tanin tại các thời điểm thu hái khác nhau K H mẫu Kết quả định tính Flavonoid Tanin Cyaniclin NH, NaOH 10% FeCl, 5% KL sư bộ Gelatin 1% FeCl, 5% Chì acetate 10% Đồng acetate 10% KL sư bộ 1 AC0408-02-01 +++ +++ +++ +++ Có +++ +++ +++ +++ CÓ 2 AC0408-02-02 +++ +++ +++ +++ Có +++ +++ +++ +++ Có 3 ACN(t)0504-03-03 +++ +++ +++ +++ Có +++ +++ +++ +++ Có 4 Ac0z(k)05-04-03-03 +++ +++ +++ +++ Có +++ +++ +++ +++ Có 5 A c0z(t)0504-03-03 +++ +++ +++ +++ Có +++ +++ +++ +++ Có 6 AC0507-03-03 +++ +++ +++ +++ Có +++ +++ +++ +++ Có 7 AC0509-02-01 +++ +++ +-f+ +++ Có +++ +++ +++ +++ Có 8 AC0509-01-01 +++ +++ +++ +++ Có +++ +++ +++ +++ Có 9 AC0510-01-01 +++ +++ +++ Có +++ +++ +++ +++ Có 10 AC0511-01-01 +++ +++ +++ +++ Có +++ +++ +++ +++ Có 11 AC0512-02-01 +++ +++ +++ +++ Có +++ +++ +++ +++ Có 12 AC0509-03-03 +++ +++ +++ +++ Có +++ +++ +++ +++ Có
Kết luận: Như vậy trong lá chè dây trồng ở Sapa tại các thời điểm thu hái khác nhau đều có flavonoid và tanin.
3.3. Định tính flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng
-Tiến hành làm đồng thời 5 mẫu lá chè dây trồng và 3 mẫu lá chè dây thiên nhiên thu hái ở Sapa tại các thời điểm khác nhau để so sánh.
-Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Lấy 5 g bột lá chè dây chiết với 50 ml cồn 70° trên cách thuỷ. Lọc nóng, bốc hơi dịch lọc cho hết hơi cồn. Loại tạp bằng dung dịch gelatin 1%. Lắc dịch chiết còn lại với ethyl acetat. Lấy dịch chiết ethyl acetat để bay hơi hết dung môi, hoà cắn trong 10 ml cồn 90° để chấm sắc ký.
-Dùng bản mỏng silicagen GF254 (MERCK) đã tráng sẵn và hoạt hoá ở 110°c trong 60 phút.
-Hệ dung môi khai triển: Toluen- Ethyl acetat- Acid formic [5:6:1,5] -Thuốc thử hiện màu: dung dịch AICI3 3% trong cồn.
Kết quả SKLM được ghi ở bảng 3.3.1, bảng 3.3.2 và sắc ký đồ Hình 3.3.1, Hình 3.3.2 và Hình 3.3.3:
Hình 3.3.2: SKLM Plavonoid TP ỞUV,S4 Hình 3.3.3: SKLM Plavonoid TP ở u v366 Bảng 3.3.1: Vị trí, màu sắc các vết trên sắc ký lớp mỏng Vết Rf*100 Đô đậm Màu sắc vết
AS thường Phun AICI3 ƯV366 UV366
+ AICI3
VI 12,64 +++ Nâu nhạt Vàng xanh Nâu đen Vàng
V2 17,24 +++ Nâu nhạt Vàng xanh Nâu đen Vàng
V3 22,99 +++ Nâu nhạt Nâu nhạt Nâu đen Nâu đen
V4 29,88 ++ Nâu nhạt Nâu nhạt Xanh sáng Xanh sáng
V5 37,93 ++++ Nâu nhạt Vàng xanh Nâu đen Vàng tươi
V6 48,28 ++++ Vàng đậm Vàng cam Vàng sáng Vàng
V7 54,02 - - - Đỏ -
V8 58,62 + Vàng Vàng Xanh nhạt Xanh nhạt
V9 73,56 - - - Xanh Xanh
Bảng 3.3.2: Sự có mặt của các vết trên sắc ký đồ ở các mẫu chè dây trồng và thu hái tự nhiên vào các thời điểm khác nhau
ST1' K H mẫu V I V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 VIO 1 AC0408-02-01 + + + + + + + + 2 AC0408-02-02 + + + + + + + + 3 ACN(t)0504-03-03 + + + + + + + + 4 Ac0z(k)05-04-03-03 + + + + + + + + 5 Ac0z(t)0504-03-03 + + + + + + + + 6 AC0507-03-03 + + + + + + + + + + 7 AC0509-02-01 + + + + + + + 8 AC0509-01-01 + + + + + + + 9 AC0510-01-01 + + + + + + + 10 AC0511-01-01 + + + + + + + 11 AC0512-02-01 + + + + + + + 12 AC0509-03-03 + + + + + + + Chú thích: (+) có (-) không có
Nhận xét\ 12 mẫu đều có 7 vết V I, V2, V3, V4, V5, V6, V8 với vị trí và màu sắc giống nhau (chỉ khác nhau về mức độ đậm nhạt) cả dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại hay khi phun thuốc thử. Riêng mẫu trồng cả ở Sapa và Bản Khoang thu hái vào tháng 8/2004 và mẫu thu hái tự nhiên vào tháng 4/2005 và tháng 7/2005 có thêm vết VIO. Mẫu thu hái tự nhiên tháng 7/2005 còn có thêm vết V7, V9.
Khi phun thuốc thử AICI3 chỉ có 4 vết hiện màu với thuốc thử: VI, V2, V5, V6 -> Đây là các vết flavonoid. Những vết còn lại không hiện màu với thuốc thử AICI3 không phải là flavonoid, đó là những tạp chất cần loại đi trong quá trình định lượng. Vết V7 và VIO phát quang màu đỏ dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366 nm có thể là chlorophyl.
3.4. Định lượng chất chiết được trong phân đoạn ethyl acetat
Cân chính xác khoảng 2 g bột lá chè dây đã xác định độ ẩm. Cho vào bình soxhlet, chiết với ether dầu hoả trên cách thuỷ trong 10 giờ. Để dược liệu ở
nhiệt độ phòng cho bay hơi hết dung môi rồi chiết tiếp bằng CHCI3 trong
Soxhlet trên cách thuỷ đến khi dung dịch không còn màu xanh. Để dược liệu ở
nhiệt độ phòng cho bay hơi hết dung môi rồi chiết bằng 20 ml cồn 90° trong bình cầu có lắp sinh hàn ngược trong cách thuỷ sôi. Sau 10 phút rút dịch chiết rồi chiết tiếp bằng những lượng cồn khác đến khi hết Aavonoid (thử bằng cách nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc, để khô rồi đặt lên miệng lọ amoniac đặc không được có màu vàng). Gộp các dịch chiết, cất thu hồi cồn đến khi còn dịch chiết nước (khoảng 20 ml). Để nguội, nhỏ dung dịch gelatin 1% đến khi không còn tủa trắng. Lắc hỗn hợp dịch chiết và tủa với ethyl acetat trong bình gạn tới khi chiết hết Aavonoid. Gộp dịch chiết, cất thu hồi ethyl acetat, bốc hơi tới cắn, sấy ở50°c đến khối lượng không đổi, đem cân.
Hàm lượng chất chiết được trong phân đoạn ethyl acetat được tính theo công thức:
F = ---ị---x i o o M x ( l - x )
F: Hàm lượng chất chiéỉ được trong phân đoạn ethylacetat (%) a: Khối lượng cắn thu được (g).
M: Khối lượng dược liệu đem định lượng (g). x: Độ ẩm dược liệu (%)
S ơ đồỵu ỵ trình định lượng phân đoạn chiết ethylacetat:
Bột dược liệu
Tạp chất/ Ether dầu hoả <— Ether dầu hoả (Shoxlet) Bã dược liệu Tạp chất/CHCI3 <— CHCI3 (Shoxlet) Bã dược liệu <— Cồn 90° (Hồi lưu) Dịch chiết cồn Cồn thu hồi <- Dịch ehret nước Cất thu hổi Dịch Lắc trong bình gạn
+ Gelatin 1% (loại tanin) chiết + tủa
— Ethylacetat
Ethylacetat thu hồi
Dịch chiết ethylacetat Cất thu hồi
ethylacetat đậm đặc Bốc hơi dung môi Dịch chiêì
Ỷ
Cắn ethylacetat Sấy ở 50°c, cân
Bảng 3.4: Kết quả định lượng phân đoạn chiết bằng ethyl acetat trong lá chè dây trồng ở Sapa tại các thòi điểm thu hái khác nhau
ST T KH mẫu Số lần KL dược liệu (g) Độ ẩm (%) KL cắn (g) Hàm lượng (%) Hàm lượng TB (%) 1 2,2003 11,05 0,6605 33,75 33,96 1 AC0408-02-01 2 2,2144 11,05 0,6721 34,12 3 2,2297 11,05 0,6755 34,06 1 2,1207 13,96 0,5020 27,51 27,39. 2 AC0408-02-02 2 2,0924 13,96 0,4868 27,40 3 2,0439 13,96 0,4794 27,26 ACN(t)0504- 1 2,2320 12,85 0,8176 42,03 41,74 3 03-03 2 2,2313 12,85 0,8091 41,61 (TN) 3 2,1944 12,85 0,7948 41,56 Ac0z(k)0504- 1 2,2327 11,04 0,5418 27,28 27,06 4 03-03 2 2,2677 11,04 0,5471 27,12 (TN) 3 2,1519 11,04 0,5127 26,78 Ac0z(t)0504- 1 2,0701 12,17 0,7391 40,65 40,90 5 03-03 2 2,1665 12,17 0,7834 41,17 (TN) 3 2,1118 12,17 0,7584 40,89 1 2,1143 14,99 0,5496 30,58 30,86 6 AC0509-02-01 2 2,2796 14,99 0,6015 31,04 3 2,2621 14,99 0,5952 30,95 1 2,2210 11,09 0,6430 32,56 32,21 7 AC0509-01-01 2 2,0642 11,09 0,5860 31,93 3 2,1567 11,09 0,6163 32,14 1 2,2215 11,91 0,6321 32,30 32,33 8 AC0510-01-01 2 2,2133 11,91 0,6325 32,44 3 2,1897 11,91 0,6219 32,24
1 2,2223 12,50 0,6810 35,02 34,65 9 AC0511-01-01 2 2,2482 12,50 0,6820 34,67 3 2,2100 12,50 0,6623 34,25 1 2,2664 10,69 0,7263 35,88 36,05 10 AC0512-02-01 2 2,2688 10,69 0,7274 35,90 3 2,2967 10,69 0,7460 36,37 AC0509-03-03 1 2,2192 8,64 0,3899 19,23 19,30 11 (TN) 2 2,2682 8,64 0,4082 19,70 3 2,1682 8,64 0,3758 18,97 Nhận xét:
-Với mẫu chè dây trồng:
+Cùng thời điểm thu hái (tháng 8/2004) nhưng tại địa điểm trồng khác nhau (Sapa và Bản Khoang) thì mẫu thu hái tại Sapa có hàm lượng thấp hơn: Sapa 27,39%; Bản Khoang 33,96%.
+Cùng địa điểm trồng (Bản Khoang) nhưng tại các thời điểm thu hái khác nhau (từ tháng 9/2005 đến tháng 12/2005), hàm lượng có xu hướng tăng theo thời gian: Tháng 9: 30,86%; Tháng 10: 32,33%; Tháng 11: 34,65%; Tháng
12: 36,05%.
-Với mẫu chè dây thu hái tự nhiên:
+Cùng thời điểm thu hái (tháng 4/2005) nhưng xử lý mẫu theo các phương pháp khác nhau: mẫu rửa nước khi tươi (41,74%) và mẫu rửa khi tươi nhưng xử lý vi sinh bằng khí ô zôn (40,90%) có hàm lượng cao và chênh nhau không đáng kể. Trong khi đó, mẫu rửa nước khi khô có hàm lượng thấp hơn (27,06%).
+Mẫu thu hái vào tháng 9/2005 có hàm lượng thấp nhất: 19,30%. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về cây chè dây thu hái tự nhiên ở Sapa trong cùng thời gian (tháng 9).
3.5. Phân lập các chất trong lá chè dây trồng ở Sapa
3.5.1. Chất nhồi cột là Sephadex LH20
-Sử dụng cắn chiết đựơc trong phân đoạn ethylacetat ở mục 3.4 để tiến hành phân lập.
-Cột: đường kính 2,0 cm, chiều dài: 40 cm.
-Chất nhồi cột: Sephadex LH20 ngâm 48h trong Methanol cho trương hở hoàn toàn.
-Nạp Sephadex bằng phương pháp nhồi cột ướt. ổ n định cột trong 24h. -Hoà tan khoảng 0,5 g cắn trong lượng tối thiểu methanol rồi đưa lên cột. -Rửa giải:
+Hệ dung môi rửa giải: methanol- ether ethylic- nước [65:5:30].
+Hứng dịch rửa giải lần lượt vào các ống nghiệm nhỏ được đánh số theo thứ tự. Mỗi ống hứng khoảng 1,5-2,0 ml. Kiểm tra dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng. Kết quả thu được 2 phân đoạn tương ứng với 2 chất được ký hiệu F1 tương ứng với vết 6 và F2 tương ứng với vết 5 trong SKLM (Hình 3.5.1). F2 thu được từ ống số 29 đến 35. F1 thu được từ ống số 95 đến 107.
Gộp các ống có cùng một vết, bốc hết hơi dung môi hữu cơ. Để nguội cho kết tinh. Lọc hút chân không qua phễu sứ xốp để thu lấy tủa. Dịch nước bốc hơi bớt nước rồi lại để nguội cho kết tinh, lọc lấy tủa, Tủa thu được kết tinh lại nhiều lần trong hỗn hợp dung môi Methanol- Nước [2:1] thu được F l, F2 tinh khiết.
- Kiểm tra độ tinh khiết của F l, F2 bằng SKLM với 3 hệ dung môi Hệ I: Toluen- Ethylacetat- Acid formic [5:6:1,5].
Hệ II: Toluen- Ethylacetat- Acid formic- Nước [6:5:1,5:1]. Hệ III: Ethylacetat- Chloroform- Acid formic [4:1:1].
Kết quả: Trên cả 3 hệ dung môi đều cho 1 vết trên SKLM cả khi quan sát dưới ánh sáng thường, hơ trên lọ amoniac đặc và soi dưới đèn tử ngoại (Hình 3.5.2 và Hình 3.5.3).
5.5.2. Chất nhồi cột là sỉlỉcagen 60
- Sử dụng cắn chiết đựơc trong phân đoạn ethylacetat ở mục 3.4 để tiến hành phân lập.
- Cột: đường kính 2,2 cm, chiều dài: 30 cm.
- Chất nhồi cột: Silicagen 60 cỡ hạt 40-60 |j.m (MERCK) - Hoạt hoá silicagen 110)°c trong Ih.
- Nạp silicagen theo phương pháp nhồi cột ướt với hệ dung môi CHCI3:
MeOH [9:1]. Ổn định cột trong 24h.
- Cắn ethylacetat hoà tan trong khoảng 5 ml MeOH rồi trộn đều với Ig silicagen đã hoạt hoá ở 110°c trong Ih. Sấy ở 50°c đến khô rồi rắc lên bề mặt cột thành lớp mỏng.
- Rửa giải: dùng hệ dung môi CHCI3: MeOH [9:1\
Hứng dịch rửa giải lần lượt vào các ống nghiệm nhỏ được đánh số theo thứ tự. Mỗi ống hứng khoảng 1,5 - 2,0 ml. Kiểm tra dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng.
-Kết quả: Từ ống số 29 đến 41 có 1 vết ứng với vết số 8 trên sắc ký đồ flavonoid toàn phần. Kết tinh lại nhiều lần thu được 1 chất sạch ký hiệu là F3.
Hình 3.5.1: Vị trí F l, Hình 3.5.2: SKLM F1 Hình 3.5.3: SKLM F2 F2, F3 trên sắc ký đồ trên 3 hệ dung môi trên 3 hệ dung môi
3.6. Nhận dạng các chất phân lập được
3.6.1. Chất F1
-SKLM:
Dùng bản mỏng silicagen GF254 (Merck) đã tráng sẵn.
Hệ dung môi khai triển: Toluen- Ethylacetat- Acid formic [5:6:1,5]. Hiện màu bằng hơ trên lọ NH3 đặc.
Kết quả: Vết F1 có Rf và màu sắc giống vết myricetin
-Phổ u v đo trong MeOH cho 253,333 nm và 375,556 nm đặc trưng cho flavonoid có khung flavonol.
-Phổ IR đo trong KBr dạng viên nén cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở 3409,9 em ' (v-OH); 1662,2(v-C=0); 1595,0; 1519,6; 1463,9; 1377,0; 1228,6; 1201,4; 1169,3; 1109,5; 1028,7; 855,6; 830,2; 770,0; 721,0; 644,0; 574,1; 504,0 em '.
-Phổ MS cho [M]'*’ = 318 mu tương ứng với công thức phân tử CisHjoOg và các pic mảnh 289; 245; 153; 136; 108; 9 1 ...mu.
Căn cứ vào SKLM đối chiếu với myricetin, phổ uv, IR và MS, chúng tôi
nhận dạng F1 là myricetin.
3.6.2. Chất F2
-SKLM:
Dùng bản mỏng silicagen GF254 (Merck) đã tráng sẵn.
Hệ dung môi khai triển: Toluen- Ethylacetat- Acid formic [5:6:1,5]. Hiện màu bằng hơ trên lọ NH3 đặc.
Kết quả: Vết F2 có Rf và màu sắc giống vết dihydromyricetin.
-Phổ u v đo trong MeOH cho 291,111 nm đặc trưng cho flavonoid có khung ílavanon.
-Phổ IR đo trong KBr dạng viên nén cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở 3268,2; em ' (v-OH), 1639,3(v-C=0); 1547,9 (v-C=C nhân thơm); 1475,4; 1343,2; 1270,8; 1214,6; 1167,5; 1136,3; 1082,7; 1026,4; 990,0; 955,9; 814,5; 727,2; 692,4; 643,7; 540,2 cm-‘.
Phổ MS cho [M]"^ = 320 mu tương ứng với công thức phân tử Cj jHijOg và các pic mảnh 291; 284; 273; 245; 228; 195; 182; 166; 153; 139...mu.
Căn cứ vào SKLM đối chiếu với dihydromyricetin, phổ uv, IR và MS,
chúng tôi nhận dạng F2 là dihydromyricetin,
OH
Dihydromyricetin
3.6.3. Chất F3
- SKLM chất F3 cho 1 vết có Rf = 58,54 ở hệ dung môi Toluen- Ethylacetat- Acid formic [5:6:1,5].
c m ‘
- Phổ IR đo trong KBr dạng viên nén cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 3427,0 cm '(v-OH); 2925; 2863,1; 1638,3 (v-C=0); 1603,1; 1512,7; 1450,4; 1312,0;
1187,0; 1054,9 ... em '.
- Phổ MS cho các pic hấp thụ mạnh (100%) ở 194 mu và cũng xuất hiện pic 396 mu. Tìm trong thư viện phổ không có cấu trúc tương ứng với 396 mu, còn 194 mu thì phù hợp với cấu trúc 3,4- diethoxybenzaldehyd với độ trùng lặp 49%. Do đó, chúng tôi chưa dự kiến được cấu trúc của F3.
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 4.1. Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu, em đã thu được một số kết quả sau:
-Đã định tính được các nhóm chất hữu cơ có trong lá chè dây trồng ở Sapa. Kết quả cho thấy, trong lá chè dây trồng ở Sapa có ílavonoid, tanin, đường khử tự do, sterol, caroten và acid hữu cơ.
-Đã định tính được 2 nhóm chất chính (Aavonoid và tanin) trong 12 mẫu lá chè dây thu hái tại các thời điểm khác nhau.
-Đã phân tích Aavonoid toàn phần bằng SKLM thấy cả 12 mẫu đều có 7 vết. Ngoài ra, số lượng vết chất trên SKLM tại các thời điểm thu hái khác nhau cũng khác nhau.
-Đã định lượng được phân đoạn chiết ethylacetat bằng phương pháp cân thấy:
+Hàm lượng phân đoạn chiết ethylacetat trong lá chè dây trồng cao hơn chè dây thiên nhiên tại cùng thời điểm thu hái.
+Các mẫu chè dây thiên nhiên thu hái cùng thời điểm nhưng xử lý mẫu theo phương pháp khác nhau thì hàm lượng phân đoạn chiết ethylacetat cũng khác nhau: mẫu rửa khi tươi hàm lượng cao hơn mẫu rửa khi khô.
+Với mẫu chè dây trồng tại các thời điểm thu hái khác nhau, hàm lượng tăng theo thời gian.
-Đã phân lập được 2 Aavonoid tinh khiết để làm chất chuẩn định lượng riêng biệt 2 thành phần này bằng HPLC. Căn cứ vào SKLM, phổ uv, phổ IR và phổ MS đối chiếu với chất chuẩn đã nhận dạng F1 là myricetin, F2 là dihydromyricetin. Ngoài ra còn chất F3 chưa xác định được cấu trúc hoá học.
4.2. Đê xuất
-Xây dựng phương pháp định lượng Aavonoid toàn phần khác đảm bảo độ