nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trưởng, phát triển, năng suất lúa tại gia lâm

Đánh giá khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được, tuyển chọn được các chủng ưu việt... Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh t

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM THỊ HẢI

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHỦNG

VI KHUẨN NỘI SINH ĐẾN SINH TRƯỞNG,

PHÁT TRIỂN, NĂNG SUẤT LÚA TẠI GIA LÂM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM THỊ HẢI

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHỦNG

VI KHUẨN NỘI SINHĐẾN SINH TRƯỞNG,

PHÁT TRIỂN, NĂNG SUẤT LÚA TẠI GIA LÂM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ:60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH

HÀ NỘI, 2015

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng trong các công bố

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn

và các thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Học viên

Phạm Thị Hải

Lời cảm ơn

Sau một thời gian làm việc và thực tập tại Viện sinh học nông nghiệp, được

sự quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị cán bộ tại Viện, cùng sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch đã tận tình hướng dẫn và dạy dỗ tôi trong suốt quá trình làm việc cũng như nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các anh chị đồng nghiệp, bạn bè, cùng toàn thể cán bộ bộ môn bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, ban chủ nhiệm Khoa và các thầy, cô giáo Khoa Công nghệ sinh họcđã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập

Và cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm

ơn tới Bố, Mẹ, anh chị em và những người thân của tôi đã nuôi nấng, động viên và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Học viên

Phạm Thị Hải

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khát quát về vi khuẩn nội sinh 3

1.1.2 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 4

1.1.3 Một số vi khuẩn nội sinh 13

1.2 Tổng quan về cây lúa 20

1.2.1 Vị trí phân loại 20

1.2.2 Đặc điểm hình thái 21

1.2.3 Nhu cầu về dinh dưỡng của cây lúa 22

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 28

2.1.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 28

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 28

2.1.3 Hóa chất 28

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 31

2.2 Nội dụng nghiên cứu 31

2.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây lúa 31

2.2.2 Đánh giá khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được, tuyển chọn được các chủng ưu việt 31

2.2.3 Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố(thời gian nuôi cấy, pH, nhiệt độ môi trường) tới khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi

khuẩn tuyển chọn 31

2.2.4 Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 31

2.2.5 Đánh giá tác động của các chủng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn được đến sinh trưởng, năng suất lúa trồng tại Gia Lâm 31

2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các chủng vi khuẩn 32

2.3.2 Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào 32

2.3.3 Xác định khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh 34

2.3.4 Xác định ảnh hưởng của thời gian và pH đến khả năng cố định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 39

2.3.5 Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của vi khuẩn có khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA cao 39

2.3.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng 40

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 42

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Phân lập và xác định các đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn nội sinh lúa phân lập được 43

3.2 Xác định khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn 44

3.2.1 Khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn 44

3.2.2 Khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn 47

3.2.3 Khả năng tổng hợp IAA 50

3.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năngcố định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 53

3.3.1.Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng cố định đạm, phân giải lân,

tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 53

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 55

3.3.3 Ảnh hưởng của pH đến khả năng cố định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 58

3.4 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 60

3.4.1 Ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 60

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 61

3.4.3 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 62

3.5 Ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật nội sinh có khả năng cố định đạm phân giải lân, tổng hợp IAA mạnh lên sự sinh trưởng, phát triển, năng suất lúa tại Gia Lâm 64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

Kết luận 71

Kiến nghị 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần môi trường RMR (Elbeltagy et al., 2001) 28

Bảng 2.2: Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+ 35

Bảng 2.3: Thành phần của dãy đường chuẩn PO43- 37

Bảng 2.4: Thành phần của dãy đường chuẩn IAA 38

Bảng 2.5: Công thức thí nghiệm 41

Bảng 3.1: Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn phân lập được 43

Bảng 3.2: Đường chuẩn NH4+ (mg/l) 45

Bảng 3.3 : Đường chuẩn PO43- 48

Bảng 3.4: Đường chuẩn IAA 50

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh và phân bón đến chiều cao, số nhánh tối đa, số bôngcủa lúa lai TH 3-3 65

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh và phân bón tới năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của lúa lai TH3-3 66

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn và phân bón đến chiều cao, số nhánh tối đa, số bông của lúa thuầnBắc thơm 7 68

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh và phân bón tới năng suất và các yếu tố cấu thànhnăng suất của lúa thuần Bắc thơm 7 69

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1: Tổng quát các lộ trình sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn(Spaepen et al.,

2007) 9

Hình 1.2: Cây lúa 20

Hình 3.1: Hình ảnh khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn 44

Hình 3.2: Đồ thị đường chuẩn NH4+ 46

Hình 3.3: Đồ thị biểu hiện hàm lượng NH4+tổng hợp của các chủng vi khuẩn 46

Hình 3.4: Khả năng tổng hợp NH4+của các chủng vi khuẩn 47

Hình 3.5: Phương trình đường chuẩn PO43- 48

Hình 3.6: Hàm lượng PO43- phân giải của các chủng vi khuẩn 49

Hình 3.7: Khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn 49

Hình 3.8: Phương trình đường chuẩn IAA 51

Hình 3.9: Hàm lượng IAA tổng hợp của các chủng vi khuẩn 52

Hình 3.10: Khả năng tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn 52

Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 54

Hình 3.13: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 55

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 56

Hình 3.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến năng phân giải lân của các 57

chủng tuyển chọn 57

Hình 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 57

Hình 3.17 Ảnh hưởng của pH đến khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 58

Hình 3.18 Ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải lân của các 59 chủng vi khuẩn tuyển chọn 59 Hình 3.19: Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp IAA của các chủngvi khuẩn tuyển chọn 60 Hình 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 62 Hình 3.22: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng

vi khuẩn tuyển chọn 63

IPDC Indole-3-pyruvate decarboxylase

NBRIP NationalBotanical Research Institute's phosphate

NSLT Năng suất lý thuyết

NSTT Năng suất thực thu

N Nitrogen

P Phosphor

TSO Tryptophan side-chain oxidase

RMR Rennie medium supplemented with rice and malate

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn nội sinh có mặt trong nhiều loại cây trồng và thực vật hoang dại Chúng thường được tìm thấy trong những cây ngũ cốc quan trọng, nhiều loài có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, phân giải lân khó tan, kích thích cây tăng trưởng

và làm tăng năng suất cây trồng (Muthukumarasamy et al., 2002a, Prabudoss và Stella, 2009) Một số chủng đã mang lại hiệu quả cao trong kiểm soát bệnh cây,

nhất là hạn chế nguồn bệnh trong đất như Fusarium oxysporum, Gaeumannomyces

graminis, Phytophthora spp., Pythium spp, Rhizoctonia solani, và Verticillium

spp (Prabudoss và Stella, 2009) Ảnh hưởng của vi khuẩn lên sự phát triển của thực vật, chủ yếu là từ những thay đổi hình thái và sinh lý của cây qua việc rễ thực vật được chủng vi khuẩn sẽ tăng số lượng rễ tơ, làm tăng cường độ hô hấp, tăng hoạt động của enzym trong dịch trích rễ làm tăng sự tổng hợp kích thích tăng trưởng của cây (Muller et al., 1989),tăng cường khả năng hấp thu nước và chất khoáng cho cây làm tăng sự phát triển, năng suất cây

Lúa là cây lương thực chính cho nhiều người đặc biệt là các nước Châu Á.Để tăng năng suất lúa cần rất nhiều phân bón đặc biệt là các loại phân bón hóa học nhưng hiện nay giá cả phân bón hóa học ngày càng tăng cao làm tăng giá thành sản xuất và giảm hiệu quả kinh tế trong nông nghiệp Ngoài ra, các loại phân bón hóa học hầu như cây trồng không hấp thu hết được sẽ dẫn đến những hậu quả như thay đổi lý, hóa tính của đất, giảm độ phì, mất cân bằng sinh thái gây ảnh hưởng tiêu cực lên hệ sinh thái, môi trường canh tác nông nghiệp(Kannaiyan, 1999)

Để giảm tải việc sử dụng quá nhiều phân hóa học, việc sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh có các khả năng cố định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA là một trong những biện pháp có hiệu quả mà không gây ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí sản xuất nhưng vẫn đảm bảo chất lượng đồng thời vẫn tăng năng suất cây trồng Trên thế giới, nhiều vi khuẩn nội sinh được tìm thấy ở rễ, vùng rễ và thân cây lúa như Azospirillum sp., Burkholderiasp., Enterobacter sp.,

Herbaspirillium sp.Klebsiella sp…(Koomnok et al., 2007; Mano và Morisaki,

2008) Ở Việt Nam, đặc biệt ở vùng đồng bằng sông Cửu Long đã có nhiều nghiên

cứu và ứng dụng vi khuẩn nội sinh ở cây lúa như phân lập được Burkholderia

vietnamiensi, Azospirillum lipoferum từ cây lúa trồng ở miền Nam Việt Nam(Van et al., 1994; Cao Ngọc Điệp et al., 2007) Tuy nhiên, việc nghiên cứu và hiểu biết về các loài vi khuẩn nội sinh hữu ích ở cây lúa trồng ở đồng bằng sông Hồng chưa được tập trung nghiên cứu

Vì các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trưởng, phát triển, năng suất lúa tại Gia Lâm”được thực hiện Mục tiêu đề tài

- Phân lập, tuyển chọn được các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây lúa có các khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA cao

- Đánh giá được tác động của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được đến sinh trưởng, năng suất một số giống lúa trồng tại Gia Lâm

Yêu cầu:

- Phân lập được các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây lúa

- Đánh giá đượckhả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được, tuyển chọn được các chủng ưu việt

- Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố (thời gian nuôi cấy, pH, nhiệt độ môi trường) tới khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn

- Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn

- Đánh giá được tác độngcủa các chủng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn được đến sinh trưởng, năng suất của một số giống lúa trồng tại Gia Lâm

CHƯƠNGI: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Khát quát về vi khuẩn nội sinh

1.1.1 Giới thiệu

Mối quan hệ giữa vi khuẩn có ích và thực vật trong đó có các nhóm vi khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật là chủ đề của nhiều nghiên cứu gần đây Hầu hết các nghiên cứu này đều tập trung vào vi khuẩn vùng rễ của thực vật trong đó có các vi khuẩn nội sinh (Ryan et al., 2008) Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống toàn bộ hay một phần thời gian của chu kì sống của chúng trong mô thực vật, không làm tổn thương mô mà những loại vi khuẩn này có lợi ích đối với cây (Schulz và Boyle., 2005) Hơn 300 loài thực vật trên trái đất có vi khuẩn nội sinh (Strobel et al.,2004) Tuy nhiên một số ít cây trồng được nghiên cứu tường tận vì hiệu quả kinh tế của chúng và đã tìm thấy nhiều loại vi khuẩn nội sinh với nhiều khả năng tốt (Ryal et al., 2008).Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như

Azotobacter, Beijerinckia, Derxia, Enterobacteriaeae , Klebsiella, Enterobacter,

Pantonae), Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus ,Burkholderia, Campylobacter,

Herbaspirillum, Gluconacetobacter và Paenibacillus (Elmerich., 2007) Tuy nhiên,

chúng cũng có thể xâm nhập vào các mô thông qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá (Roos và Hattingh., 1983) Sau khi xâm nhập vào cây chủ có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hoặc di chuyển đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của

rễ, thân, lá, hoa (Zinniel et al., 2002) thúc đẩy các quá trình chuyển hóa trong cây,

sự phát triển lông rễ một cáchmạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ Ảnh hưởng của vi khuẩn lên sự phát triển của thực vật, chủ yếu là từ những thay đổi hình thái và sinh

lý của cây qua việc rễ thực vật được chủng vi khuẩn sẽ tăng số lượng rễ tơ, làm tăng cường độ hô hấp, tăng hoạt động của enzym trong dịch trích rễ làm tăng sự tổng hợp kích thích tăng trưởng của cây trồng(Muller et al., 1989), tăng cường khả năng hấp thu nước và chất khoáng cho cây làm tăng sự phát triển, năng suất cây trồng.Hiện nay, các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều đến những loài vi khuẩn nội

sinh có khả năng tốt như vi khuẩn có khả năng cố định nitơ trong không khí, tổng hợp kích thích tố auxin giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường, tănghàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh, phân giải lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng bằng nhiều cơ chế trực tiếp hay gián tiếp (Hill et al.,1972; Hallmann et al., 1997; Kobayashi và Palmudo.,2000) Ngoài ra vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp các chất kiểm soát sinh học hay chất kháng sinh chống lại các mầm bệnh như vi khuẩn, nấm… gây bệnh cho cây trồng (Ryal et al., 2008)

1.1.2 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh

Là nhóm vi khuẩn tiền nhân liên kết với thực vật, chúng hình thành sự liên hợp với cây chủ của chúng bằng cách hình thành tập đoàn ở các mô bên trong Đối với nông nghiệp, phần lớn vi khuẩn nội sinh không gây hại cho sinh vật chủ mà ngược lại chúng còn thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích thích sinh trưởng thực vật cố định đạm từ không khí (Sturz et al., 2000) Một số chủng vi khuẩn nội sinh có thể hạn chế sự phát triển của mầm bệnh (Benhamou et al., 1996) và kích thích sự chống chịu của cây trồng đối với tác động của các nhân tố vô sinh và hữu sinh (Hallmann et al., 1997)

1.1.2.1 Khả năng cố định đạm

Đạm là chất dinh dưỡng cần thiết và quan trọng cho sự phát triển của cây trồng Trong không khí có khoảng 78% là khí nitơ nhưng cây trồng không thể hấp thu trực tiếp khí Nitơtrong không khí được Cây trồng chỉ có thể hấp thu đạm có sẵn trong đất ở dạng ammonium và nitrate thông qua rễ của chúng Các vi khuẩn nội sinh thực vật có khả năng chuyển hóa Nitơ trong không khí thành dạng đạm mà cây

có thể hấp thu được nhờ quá trình cố định đạm sinh học Cố định đạm sinh học là quá trình chuyển Nitơ trong không khí thành dạng đạm nguyên tử rồi thành dạng đạm vô cơ ammonia - dạng đạm mà cây trồng có thể hấp thụ được, sau đó vi khuẩn

sẽ chuyển hóa tiếp một phần thành dạng acid amin hữu cơ để vi khuẩn sử dụngnhờ

sự xúc tác của enzyme nitrogenase (Santi et al., 2013)

Nitrogenase là một loại enzyme phức hợp gồm 2 thành phần:

- Protein chứa sắt hay nitrogenase khửhay thành phần II gồm 2 tiểu phần giống nhau mỗi tiểu phần có khối lương phân tử 29000đvC, ở giữa có 4 nguyên tử sắt và 4 nguyên tử lưu huỳnh không ổn định với axit

- Đơn phân protein lớn hơn chứa sắt và molipden hay thành phần I có khối lượng 220000 đvC gồm 2 nguyên tử Mo và 30 nguyên tử sắt và nhiềunguyên tử lưu huỳnh không ổn định với axitgồm 4 tiểu phần gồm 2 loại, một loại có khối lượng phân tử 50 đvC và một loại có khối lượng phân tử 60000 đvC (Nguyễn Lân Dũng, 2007)

Phản ứng cố định đạm:

N2 + 8H+ + 8e− + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi

Quátrình này gồm nhiều phản ứng khử kế tiếp nhau:

N2 + 2 H+ → [NH=NH] + 2 H+ → [NH-NH] + 2 H+ → 2 NH3

Phản ứng cố định đạm xảy ra theo trình tự protein Fe sẽ khử và cung cấp điện tử trước để cung cấp điện tử trong Ferredoxin Kế đến, protein Mo-Fe khử và cung cấp điện tử đến N2để tạo thành HN=NH Trong 2 chu kỳ tiếp theo cũng đòi hỏi cung cấp điện tử để tạo ra H2N=NH2 từ HN=NH, và cuối cùng tạo NH3 từ

H2N=NH2 Tùy theo nhóm vi sinh vật mà Ferredoxin khử sẽ được cung cấp điện tử

từ quá trình quang hợp hoặc hô hấp hay lên men Quá trình này được điều khiển bởi các gen nif (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)

Ngoài ra, trong quá trình vận chuyển e– cần năng lượng do ATP cung cấp ATP kết hợp với protein chứa Fe qua 1 cầu Mg và sau đó được thuỷ phân thành ADP và Pi.Sự thuỷ phân đã làm thay đổi hình dạng của protein enzyme, e– được vận chuyển lên phức hệ Fe–Mo Để vận chuyển 1e– cần 2 ATP

Hoạt tính của enzyme nitrogenase có thể được xác định nhờ hoạt tính khử axetylen (ARA-Acetylene Reduction Assay) Theo Dilworth (1966), enzyme nitrogenase cũng khử C2H2 (acetylene) thành C2H4 (ethylene) Tại phòng thí nghiệm

về lý thuyết để khử một phân tử N2 cần 6e, còn để khử 1 phân tử C2H2 chỉ cần 2e do

đó phải khử 3 phân tử C2H2 mới tương đương với việc khử một phẩn tử N Căn cứ

vào lượng C2H4sinh ra mà người ta xác định được lượng nitơ cố đinh được của loại

vi sinh vật có định nitơ

Nitrogenase dễ bất hoạt trong môi trường hiếu khí ở nhiệt độ thấp (0oC) Phản ứng cố định nitơ phân tử nhờ hệ nitrogenase diễn ra ở nhiệt độ bình thường và áp suất khí quyển, nhưng cần rất nhiếu năng lượng của tế bào: cần 147,2 Kcal trong điều kiện kị khí để giải phóng được 2 NH3(trung bình cần 15 đến 20 phân tử ATP

để giải phóng 2 NH3) Hệ enzyme cố định nitơ không hoạt động hay hay hoạt động yếu khi có oxi khí quyển, hay sự có mặt của các hợp chất nitơ khác

hệthốnggennif(nilàchữviếttắtcủanitrogen–nitơvàflàfixing–cốđịnh) trong bộ genome

của tế bào vi khuẩn Ở Klebsiella pneumonia chức năng hoạtđộng của nitrogenase

được xác định ở 17 gen (gen Nit, operon Nit) và ở 7 -8 operon Người ta chuyển

được gen cố định đạm từ vi khuẩn trên sang E.coli(Postgate., 1998) nhờ tiếp hợp

Ở một số sự cộng sinh như Klebsiella sp với cây lúa hay Azospirillum sp với

bắp, việc bổ sung nguồn carcbon như sodium malate là rất cần thiết cho hoạt động của enzyme nitrogenase trong quá trình cố định đạm (Santi et al., 2013)

1.1.2.2 Khả năng phân giải lân khó tan

Lân là một trong những dưỡng chất cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển của cây trồng và cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến năng suất cây trồng Cây trồng chỉ có thể sử dụng được lân dưới dạng hòa tan trong đất Tuy nhiên, nồng

độ lân hòa tan trong đất thường rất thấp, ở mức 1 ppm hoặc ít hơn (10M H2PO4-) (Goldstein., 1994) Lân thường được bổ sung vào đất dưới dạng phân bón dạng hòa tan mà cây trồng dễ sử dụng nhưng lượng lân vô cơ hòa tan này nhanh chóng bị cố định và kết tủa thành dạng không hòa tan và trở nên không có giá trị đối với cây trồng (Rodríguez và Fraga., 1999) Bên cạnh đó, nhều loại đất như đất đỏ bazan, đất đen,… có hàm lượng lân trong đất khá cao nhưng cây lại không hút được để sử dụng do lân ở dạng khó tan

Phân hữu cơ trong đất chủ yếu ở dạng inositol phosphate (phytate đất) Nó được tổng hợp bởi vi sinh vật và cây và là dạng hữu cơ ổn định của P trong đất, chiếm

trên 50% tổng số P hữu cơ (Paul và Clark., 1988).Hợp chất P hữu cơ khác trong đất

là dạng phosphomonoeste, phosphodieste bao gồm phospholipid và acid nucleic, và phosphotrieste Sự chuyển hoá các hợp chất photpho hữu cơ thành muối của

H3PO4được thực hiện bởi nhóm vi sinh vật phân huỷ photpho hữu cơ Những vi sinh vật này có khả năng tiết ra enzym photphatase để xúc tác cho quá trình phân giải.Sự chuyển hóa các hợp chất phosphate hữu cơ thành muối của H3PO4theo sơ đồ sau (Bạch Phương Lan., 2004)

1 Nucleoprotein Nuclein Acid nucleic Nucleotic H3PO4

2 Lơxitin Glixerphosphate H3PO4

Sự khoáng hóa của những hợp chất này được thực hiện bởi hoạt động của nhiều phosphatase (còn được gọi là phosphohydrolase) Những phản ứng khử phosphoryl này liên quan đến sự thủy phân cầu nối phosphoeste hoặc phosphoanhydride Phosphohydrolase acid, không giống phosphatase kiềm, hoạt động xúc tác tối ưu ở giá trị pH từ acid đến trung tính Hơn thế nữa, chúng còn được phân nhóm thành phosphatase acid đặc hiệu hoặc không đặc hiệu, liên quan đến tính đặc hiệu cơ chất của chúng Phosphohydrolase đặc hiệu với những hoạt tính khác nhau bao gồm 3’-nucleotidase, 5’-nucleotidase, hexose phosphatase và phytase Một nhóm đặc hiệu của enzyme giải phóng P có thể cắt cầu nối C-P từ phosphonate hữu cơ

Các hợp chất lân vô cơ được hình thành do quá trình phân giải lân hữu cơ (còn gọi là quá trình khoáng hóa lân hữu cơ), phần lớn là các muối phosphat khó tan mà cây trồng không thể hấp thu như Ca3(PO4)2, FePO4, Al2(PO4)3, Những dạng khó tan này trong những môi trường có pH thích hợp sẽ chuyển hóa thành dạng dễ tan(Trần Cẩm Vân., 2005)

Về cơ chế của quá trình phân giải photpho vô cơ do vi sinh vật cho đến nay vẫn còn nhiều tranh cãi Nhưng đại đa số các nhà nghiên cứu đều cho rằng: sự sinh sinh axit trong qúa trình sống của một số nhóm vi sinh vật đã làm cho nó có khả năng chuyển các hợp chất photpho từ dạng khó tan sang dạng có thể hoà tan (Kucey

et al.,1989; Rashid et al.,2004) Một số vi khuẩn có khả năng phân giải lân do chúng

có thể tiết ra các acid hữa cơ hòa tan các hợp chất lân khó tan (Yahya and

Al-Aseawi., 1989).Các acid hữu cơ này có trọng lượng phân tử thấp, chủ yếu là acid gluconic và acid 2-ketogluconic (Goldstein., 1995; Rodríguez và Fraga., 1999) Các acid hữu cơ khác như acid glycolic, acid oxalic, acid malonic và acid succinic cũng được nhận diện trong một số vi khuẩn có khả năng phân giải lân (Banik and Dey., 1982; Illmer và Schinner., 1992) Đa số các vi sinh vật có khả năng phân giải lân vô

cơ yếu sinh CO2 trong quá trình sống, CO2sẽ phản ứng với H2O có trong môi trường trở thành H2CO3,H2CO3 sẽ phản ứng với photphat khó tan thành photphat dễ tan theo phương trình sau:

Ca3(PO4)2+ 4 H2CO3+ H2O> Ca(H2PO4)2 + H2O + 2 Ca(HCO3)2

Hầu hết các vi sinh vật phân huỷ lân vô cơ trong quá trình sống đều làm giảm pH môi trường Tuy nhiên, gần đây có một vài tác giả đã công bố tìm ra một vài chủng vi khuẩn phân giải lân mà trong quá trình nuôi cấy không làm giảm pH môi trường

Ngoài cơ chế acid hóa, theo Moghimi và Tate (1978), các vi khuẩn còn có thể phân giải lân khó tan bằng sự tạo phức và các phản ứng trao đổi ion Trong đó, phức cation có thể là cơ chế quan trọng trong các trường hợp phân giải lân khó tan khi có cấu trúc acid hữu cơ thích hợp để tạo ra phức

1.1.2.3 Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)

Indole-3-acetic acid (IAA) là một loại auxin phytohormone tự nhiên mà nhiều loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp được (Spaepen et al., 2007) IAA chi phối sự phân chia tế bào ở giai đoạn đầu phát tiển của cây trồng, sự giản dài tế bào, phân hóa sinh mô và phát triển quả và hạt.Ngoài ra, IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên

và sự tạo thành lông rễ (Theologis và Ray., 1982; Gray et al., 2001) Theo Spaepen

và Vanderleyden (2011) trên 80% vi khuẩn được phân lập từ vùng rễ có khả năng tổng hợp IAA Nhiều loài vi khuẩn cố định đạm sống tự do, vi khuẩn sống cộng

sinh có cơ chế tổng hợp IAA từ tiền chất chính là L-tryptophan như Azospirillum

brasilense (Somers et al., 2005), Azotobacter (Ahmad etal., 2005) và Enterobacter

cloacae (Koga et al., 1991) Từ tiền chất là L-tryptophan, có ít nhất 5 lộ trình được

mô tả cho sự tổng hợp IAA, trong

Con đường tổng hợp IAA t

Con đườngtổng hợp IAA theo l

tốt nhất và đặc trưng cho s

(IAM) là lộ trình được tìm th

giống Rhizobium và

monooxygenase (được m

theo IAM được thủy phân th

(được mã hóa bởi gene iaaH

al (1998), Pseudomonas syringae

Tryptophan→indole

ợp IAA, trong đó vi khuẩn tổng hợp IAA chủ y3-acetamide (IAM), lộ trình indole-3-pyruvate (IPA) và l(TAM) và các lộ trình khác như, lộ trình Tryptophan sideình indole-3-acetonitrile (IAN) (Spaepen và Vanderleyden

ng quát các lộ trình sinh tổng hợp IAA ở vi khu

(Spaepen et al., 2007)

ợp IAA từ lộ trình Indole-3-acetamide(IAM)

ợp IAA theo lộ trình indole-3-acetamit (IAM)

o sự tổng hợp IAA của vi khuẩn Lộ trình indole

ìm thấy ở vi khuẩn cộng sinh cố định đạm của các lo

Bradyrhizobium Đầu tiên, enzyme

ợc mã hóa bởi gene iaaM) chuyển tryptophan th

y phân thành IAA và ammonia bởi enzyme an IAM hydrolase

iaaH) (Spaepen và Vanderleyden., 2011) Theo Glickmann

Pseudomonas syringae cũng tổng hợp IAA theo lộ trình này

indole-3-acetamide(IAM)→IAA

p IAA chủ yếu qua ba lộ pyruvate (IPA) và lộ ình Tryptophan side-chain Spaepen và Vanderleyden.,

vi khuẩn

acetamit (IAM) được đánh giá

ình indole-3-acetamide

m của các loài thuộc

ên, enzyme

tryptophan-2-n tryptophatryptophan-2-n thàtryptophan-2-nh IAM, tiếp

an IAM hydrolase Theo Glickmann et ình này

Con đường tổng hợp IAA từ lộ trình indole-3-pyruvate (IPA)

Lộ trình indole-3-pyruvate (IPA) được tìm thấy ở nhiều loài vi khuẩn như

Azospirillum brasilense , Azospirillum lipoferum , Enterobacter cloacae,

Pseudomonas putida và Pseudomonas agglomerans (Spaepen và Vanderleyden.,

2011) Lộ trình này bao gồm 3 bước: đầu tiên, tiền chất tryptophan được chuyển thành IPA nhờ enzyme tryptophan transaminase; sau đó, enzyme indole-3-pyruvate

decarboxylase (IPDC) (được mã hóa bởi gene ipdC) xúc tác sự khử nhóm carboxyl

ở IPA thành indole-3-acetaldehyde (IAAld) và IAAld bị oxy hóa thành IAA bởi enzyme indole-3-acetaldehyde oxidase (Ryu et al., 2008b)

Tryptophan→indole-3pyruvic acid(IPA)→indole-3-acetaldehyde→IAA

Con đường tổng hợp IAA từ lộ trình Tryptamine(TAM)

Ở vi khuẩn, con đường tổng hợp tryptamine (TAM) đã được xác định trong vi

khuẩn Bacillus cereus bằng cách xác định hoạt động của tryptophan decarboxylase (Perley và Stowe., 1966) và trong Azospirillum bởi phát hiện việc chuyển đổi

tryptamine ngoại sinh thành IAA (Hartmann et al., 1983) Trong thực vật tryptamine được xác định là một hợp chất nội sinh và gen mã hóa cho enzyme decarboxylases tryptophan (xúc tác decarboxylation chuyển tryptophan thành tryptamine) đã được nhân lên và đặc trưng từ các loài thực vật khác nhau cho thấy một con đường sinh tổng hợp IAA qua tryptamine trong thực vật Các quá trình làm hạn chế cho con đường này trong thực vật có lẽ được xúc tác bởi một loại protein monooxygenase giống như flavin (YUCCA) (chuyển đổi tryptamine N - hydroxyl - tryptamine) Sự hiện diện của các chất trung gian, đó là vùng dưới N - hydroxyl - tryptamine (có lẽ là indole -3- acetaldoxime và indole -3- acetaldehyd) cần phải được khẳng định (Bak et al., 2001; Zhao et al., 2001) Bước cuối cùng của con đường này trong vi khuẩn là khác với các nhà máy: trong vi khuẩn TAM là chuyển đổi trực tiếp với IAAld bởi một oxidase amin (Hartmann et al., 1983)

Tryptophan→tryptamine→ indole-3-acetaldehyde→IAA

Con đường tổng hợp IAA từ lộ trình Tryptophan side-chain oxidase (TSO)

Lộ trình Tryptophan side-chain oxidase (TSO) chỉ được tìm thấy ở

Pseudomonas fluorescens CHA0,Ở lộ trình này, tryptophan được chuyển hóa trực tiếp thành IAAld qua IPA và IAAld bị oxy hóa thành IAA như ở lộ trình IPA (Oberhansli et al., 1991)

Tuy nhiên, một số loài trong Pseudomonas spp còn có cơ chế tổng hợp IAA

không sử dụng tiền chất tryptophan, trong đó indole-3-glycerol phosphate → IPA

→ IAAld → IAA

Con đường tổng hợp IAA từ lộ trình indole-3- axetonitril (IAN)

Sinh tổng hợp IAA thông qua indole-3- axetonitril (IAN) đã được nghiên cứu rộng rãi ở cây trồng trong những năm gần đây Cuối cùng bước vào con đường này

ở vi khuẩn thì việc chuyển đổi IAN thành IAA do một nitrilase đã được xác định bởi Bartling et al (1992); các bước dẫn đến sự hình thành của IAN từ tryptophan vẫn là một vấn đề đang được tranh luận Gần đây, hai con đường đã được đề xuất cho sự hình thành này: một qua glucosinolate indolic (glucobrassicin) và hai là thông qua indole -3- acetaldoxime (Bak et al, 2001; Zhao et al, 2001) Trong vi

khuẩn như Alcaligenes faecalis(Kobayashi et al., 1993) nitrilases đã phát hiện với

độ đặc hiệu cho indole-3- acetonitrile Trong Agrobacterium tumefaciens và

Rhizobium spp thì nitrile hydratase và amidase được xác định, cho thấy việc

chuyển đổi của IAN thành IAA thông qua IAM(Kobayashi et al., 1995)

Như chúng ta đã biết vi khuẩn có thể sử dụng các con đường khác nhau cho sinh tổng hợp IAA Hầu hết trong số chúng sử dụng tryptophan được tiết ra từ thực vật như một phần của dịch tiết ở rễ là một tiền chất (Spaepen et al., 2007).Kamilova et

al (2006) quan sát thấy rằng P fluorescens WCS365 kiểm soát điều kiện sinh học

bất lợi trong khi sản xuất IAA trong sự hiện diện của tryptophan, có thể kích thích tăng trưởng rễ của củ cải, một loại cây tiết ra một lượng lớn tryptophane trong dịch tiết của nó

Theo nghiên cứu mới nhất của Lugtenberg et al (2013) về khả năng tương tác của nhóm vi khuẩn tổng hợp IAA đến khả năng phát triển của thực vật đã được

phân tích trên chủng Azospirillum brasilense, một vi khuẩn cố định đạm thúc đẩy

tăng trưởng thực vật bằng cách tăng sự xuất hiện ở bề mặt rễ của mình thông qua việc rút ngắn chiều dài rễ chính và nâng cao hình thành rễ bên, lông hút Quan điểm hiện nay sản xuất auxin là yếu tố chính chịu trách nhiệm cho những thay đổi ở rễ thực vật và do đó chúng là tác nhân tăng thúc đẩy tăng trưởng ở thực vật (Pliego et al., 2011)

Từ kết quả nghiên cứu quá trình tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan ở vi

khuẩn Enterobacter cloacae của Koga et al(1991) cho thấy trong các điều kiện có

oxi phần lớp (50-90%) lượng IAA được tạo ra chủ yếu bằng lộ trình pyruvic acid Đồng thời ở các điều kiện có chất khử thì indole-3-pyruvic acid và indole-3-acetaldehyde (các chất trung gian của lộ trình) lần lượt bị khử thành indole-3-lactic acis và tryptophol có thể là các sản phẩm tích lũy quan trọng liên quan đến sự điều hòa sinh tổng hợp IAA

ngăn chặn sự tác hại của nấm Fusarium oxysporum f sp vasinfectum trên bông vải; nấm Fusarium oxysporumf sp pisi trên đậu pea Một số chủng Bacillus như B

amyloliquefaciens , B subtilis, B pasteurii, B cereus, B pumilus, B mycoides và

B sphaericusđược ghi nhận là có ý nghĩa giảm tỷ lệ mắc bệnh ở hàng loạt các loài thực vật (Ryu et al., 2004) Một số vi khuẩn nội sinh tổng hợp kháng sinh chống

nấm, ví dụ P fluorescens sản xuất 2,4-diacetyl phloroglucinol ức chế sự tăng

trưởng của nấm bệnh Một số vi khuẩn nội sinhphân giải axit fusaric được sản sinh

bởi Fusarium sp gây bệnh héo và do đó ngăn ngừa bệnh phát sinh (Toyoda và

Utsumi., 1991) Một số vi khuẩn nội sinh cũng có thể sản sinh các enzyme phân hủy

tế bào nấm.Ví dụ, Pseudomonas stutzeri sản xuấtchitinase ngoại bào và laminarinase có thể phân hủy các sợi nấm Fusarium solani (Mauch et al., 1988)

Các vi khuẩn nội sinh có thể sản sinh các chất hạn chế sự phá hoại cây của tác nhân gây bệnh Các chất này gồm chất mang sắt, kháng sinh, các phân tử nhỏ khác và hàng loạt các enzyme(Glick và Pasternak., 2003) Vi khuẩn nội sinh(ví dụ như

Pseudomonas putida) có thể ngăn chặn sự tăng sinh của nấm gây bệnh thực vật bằng cách sinh chất mang sắt (pseudobactin) liên kết với hầu hết Fe3+ ở vùng quanh

rễ cây, cạnh tranh sắt với nấm bệnh Một số chủng vi khuẩn nội sinhcó thể sinh tổng

hợp các enzyme như chitinaza, β-1,3-glucanaza, proteaza và lipaza, có thể phân hủy

vách tế bào, do đó phá vỡ tế bào nấm Một trong những cơ chế hiệu quả nhất mà vi khuẩn nội sinh có thể sử dụng để ngăn cản sự tăng sinh của các tác nhân gây bệnh thực vật là tổng hợp kháng sinh như agroxin,pyoluteorin và pyrrolnitrin(GlickvàPasternak.,2003)

1.1.2.5 Tác nhân kiểm soát sinh học

Một ứng dụng quan trọng khác của vi khuẩn nội sinhtrong nông nghiệp là khả năng kiểm soát sinh học.Với cơ chế cạnh tranh các chất dinh dưỡng, tạo sức đề kháng hệ thống và sản sinh các chất chuyển hóa chống nấm (AFMs) là phương thức hoạt động kiểm soát sinh học của vi khuẩn nội sinh Trong số các chủng vi khuẩn

nội sinh, Pseudomonasđược xem là tác nhân kiểm soát sinh học tốt nhất

Pseudomons aeruginosa Sha8 sản sinh hợp chất dễ bay hơi độc hại làm giảm sự

tăng trưởng của cả F oxysporium và Helmithosporium sp P FluorescensWCS374

đã được báo cáo là có tác dụng hàng đầu trong việc ngăn chặn bệnh héo Fusarium ở

củ cải, tăng 40% về sản lượng so với mức trung bình.Pseudomonas fluorescens còn

bảo vệ thực vật chống lại một loạt các bệnh nấm cây trồng quan trọng như thối đen

rễ thuốc lá, thối rễ đậu, thối rễ lúa mì, củ cải đường (Kumar et al, 2002) và triển vọng nâng cao hiệu quả của các tác nhân kiểm soát sinh học khác

1.1.3.Một số vi khuẩn nội sinh

1.1.3.1 Vi khuẩn Azoarcus

Azoarcuslà vi khuẩn cố định đạm, Gram âm, hình quevà có khả năng chuyển động(Bilal and Malik., 1987; Bilal et al., 1990; Malik et al., 1991; Reinhold et al., 1986) Loài vi khuẩn này vừa có khả năng cố định đạm trong điều kiện vi hiếu khí vừa có khả năng tổng hợp IAA và phát triển tốt trên môi trường chứa muối acid hữu

cơ nhưng không tốt trên môi trường chứa carbohydrate (Malik et al., 1997)

Hầu hết các giống Azoarcus được phân lập từ cỏ Kallar trồng ở vùng đất mặn thuộc Pakistan (Reinhold-Hurek et al., 1993; Hurek et al., 1995).Azoarcus hiện diện

trong rễ, bề mặt rễ (Bilal and Malik, 1987; Reinhold-Hurek et al., 1993)và cả trong thân cỏ Kallar (Hurek et al., 1993, 1994; Egener et al., 1998).Ngoài ra, vi khuẩn này còn được phân lập từ rễ lúa và giúp kích thích sự sinh trưởng của lúa (Malik et al., 1997; Egener et al., 1998; Engelhard et al., 2000) Theo Malik et al (1980), khi khai phá những vùng có cỏ Kallar phát triển tốt để trồng lúa mì thì thấy lúa mì có năng suất cao mà không cần bón nhiều phân đạm hóa học

Theo Reinhold-Hurek et al (1993), dựa vào nhiều nghiên cứu về hình thái, tính năng dinh dưỡng và sinh hóa cũng như một số kỹ thuật sinh học phân tử, giống

Azoarcus được xác định có 2 loài là A communisvàA indigenous Năm 1995, theo một nghiên cứu tại đại học Michigan State, một loài khác thuộc giống Azoarcus -

Azoarcus tolulyticus lần đầu tiên được mô tả, là một vi khuẩn cố định đạm tự do, chịu được ở điều kiện kỵ khí và được phân lập từ đất, biển và nước ngọt bị nhiễm dầu

của các loại ngũ cốc, cỏ và cây có củ.Azospirillum spp có khả năng cố định đạm,

phân giải lân khó tan, hấp thu khoáng chất, sản xuất nhiều loại kích thích tố thực vật, trong đó chủ yếu là IAA và gibberellins, phân hủy siderophores và sản xuất enzyme (Bashan et al., 2004)

Azospirillum giúp tăng năng suất lúa từ 32 - 81% ở điều kiện nhà lưới (Mirza

và ctv, 2000; Malik et al., 2002) Nhưng ở điều kiện ngoài đồng vi khuẩn nầy chỉ làm tăng năng suất lúa được 10 - 30%

Azospirillumtăng sinh ở cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí với sự hiện diện hoặc không có hợp chất nitơ trong môi trường, nhưng thích hợp là vi hiếu khí Nhiệt

độ tối hảo từ 35 – 37oC Một số chủngAzospirillum là những vi sinh vật tự dưỡng không bắt buộc Vi khuẩn Azospirillum phát triển tốt trên muối của những acid hữu

cơ như malate, succinate, hay pyruvate Fructore và những đường đôi khác cũng có

thể được vi khuẩn sử dụng như là nguồn carbon.Một số chủngAzospirillum cần

biotin cho sự phát triển của chúng

Ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn có khả năng khử nitrat, chống lại vi

khuẩn gây bệnh thối lá ở cây dâu tằm Theo Eckert (2001) chi Azospirillum có 7 loài là: A brasilense; A lipoferum ; A amazonense; A irakense; A halopraeferens;

A largimobile và A doebereineae

Một số báo cáo gần đây cho thấy vi khuẩn này có thể tiết ra những kích thích

tố tăng trưởng như: IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric acid), ABA (abscisic acid) và cytokynins Những kích thích tố đó làm tăng chiều dài rễ, tăng thể tích rễ và số lượng rễ Từ đó, chúng làm tăng khả năng hấp thu khoáng chất

và nước, tăng khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như tăng năng suất của cây Ngoài ra, chúng còn giúp cho cây chống chịu được điều kiện khô hạn

1.1.3.3.Vi khuẩn Burkholderia

Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn Gram âm, hình que, có thể sinh trưởng và

phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí nhưng phát triển tốt nhất trong điều kiện ít khí oxy (Caballero-Mellado et al., 2004) Vi khuẩn này sống cộng sinh với cây trồng, có khả năng cố định đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây Ngoài ra,

một số chủng của loài Burkholderia như B tropica và B unamae có khả năng hòa

tan phosphate và sản xuất siderophores (Caballero-Mellado et al., 2007)

Theo Coenye và Vandamme (2003) có hơn 40 loài Burkholderiađược tìm

thấy,chúng có mặt khắp nơi trong tự nhiên Tuy nhiên, trong một thời gian dài, khả

năng cố định đạm của giống Burkholderia chỉ được tìm thấy ở loài Burkholderia

vietnamiensis, là một loài vi khuẩnđược phân lập từ rễ cây lúa trồng ở miền Nam Việt Nam (Gillis et al., 1995) Theo Estrada-de los Santos et al (2001) cũng tìm

thấy Burkholderia vietnamiensis và một loài Burkholderia kururiensis có khả năng

cố định đạm trong rễ của bắp, sorghum và cà phê trồng tại Mexico.Hiện nay, nhiều

loài Burkholderiađược xác nhận có khả năng cố định đạm được tìm thấy nhưB

tropica ở thân và trái khóm (Cruz et al., 2001) và ở cây bắp, cây teosinte trồng tại

Mexico, ở rễ cây mía trồng tại Brazil và Nam Phi (Reis et al., 2004); B phymatum

và B tuberum ở rễ cây họ đậu (Vandamme et al., 2002); B unamae ở bắp, mía

đường và cà phê (Caballero-Mellado et al., 2004) và ở vùng rễ cây cà chua trồng tại

Mexico (Caballero-Mellado et al., 2007);B xenovorans ở vùng rễ bắp trồng tại Hà

Lan (Salles et al., 2006) và ở ở vùng rễ cây cà chua trồng tại Mexico

(Caballero-Mellado et al., 2007) và B silvatlanticaở bắp và mía đường (Perin et al., 2006),… Theo thí nghiệm của Van et al (2000), cây lúa được chủngBurkholderia

vietnamiensis TVV75 - một chủng vi khuẩn được phân lập từ đất phèn ở miền Nam Việt Nam – đã cho những hiệu quả đáng kể như bề mặt lá tăng 30% ở ngày 14, khả năng đâm chồi tăng 33% và số lượng rễ tăng 57% ở ngày 24, sản lượng hạt lúa tăng

từ 13-22% và cho năng suất tương đương với lúa trồng được bón phân đạm hơn

25-30 kg N/ha

1.1.3.4 Vi khuẩn Enterobacter

Vi khuẩn Enterobacterthuộc nhóm γ-Proteobacteria, hầu hết vi khuẩn

Enterobacter là vi khuẩn Gram âm, kỵ khí không bắt buộc và có dạng hình que Một số loài của vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nộisinh bên trong các mô thực vật,

là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực có khả năng tổng hợp phytohormones, cố định đạm từ không khí và hoạt động kiểm soát sinh học (Madhaiyan et al., 2010)

Hwangbo et al (2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng rễ một số cây cỏ ở Triều Tiên Loài Enterobacter intermedium này có khả

năng hòa tan các phosphate khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2-ketogluconic acid

Năm 2010, một chủng vi khuẩn Ah-143T với tên gọiEnterobacter arachidis

sp nov.được phân lập từ vùng đất rễ của cây lạc (Arachis hypogaea L ‘ALR-2’)

thu từ mảnh đất thí nghiệm của đại học nông nghiệp Tamilnadu thuộc Coimbatore

Ấn Độ Chủng vi khuẩn này có khả năng cố định đạm từ không khí và tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA), siderophore,phytohormone và 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACCD) (Madhaiyan et al., 2010)

Hardoim et al (2013) đã phân lập được 2 loài Enterobacter mới là

Enterobacter oryziphilus sp nov (các chủngREICA_084, REICA_142T và

REICA_191) và Enterobacter oryzendophyticus sp nov (các chủngREICA_032,

REICA_082T và REICA_211) từ rễ lúa Cả 2 loài này đều có khả năng cung cấp đạm và phospho để kích thích sự phát triển của lúa

1.1.3.5 Vi khuẩn Gluconacetobacter Diazotrophicus

Năm 1988, một giống vi khuẩn nội sinh hấp thụ acid acetic có khả năng cố

định đạm - Acetobacter diazotrophicus được phát hiện và phân lập từ rễ và thân cây

mía đường trồng ở Brazil bởi Cavalcante và Döbereiner Chúng hiện diện trong các khoảng trống gian bào của tế bào nhu mô và được xem là vi khuẩn nội sinh bắt buộc

(Cavalcante và Döbereiner, 1988) A diazotrophicus cũng được phân lập từ những cây trồng khác như cỏ Cameroon (Pennisetum purpureum), sweet potato (Ipomoea

batatas ), coffee (Coffea arabica), trà, chuối, ragi, lúa và khóm và kể cả trên những

côn trùng gây hại cây mía (Muthukumarasamy et al., 2002) Sau đó, căn cứ vào

phân tích trình tự 16s rRNA, Acetobacter diazotrophicusđược đổi tên lại thành

Gluconacetobacter diazotrophicus (Yamada et al., 1997)

Gluconacetobacter diazotrophicus là vi khuẩn Gram âm, chịu được acid, sống trong môi trường hiếu khí bắt buộc, có thể tăng trưởng được ở pH rất thấp 3,0 và có khả năng cố định đạm trong điều kiện vi hiếu khí Loài vi khuẩn này sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau như sucrose, gluconate, glucose, fructose, mannitose và arabinose,… nhưng nguồn carbon tốt nhất cho sự phát triển là sucrose ở nồng độ cao 10% và thậm chí ở nồng độ sucrose cao hơn (30%) chúng vẫn có thể phát triển

(Muthukumarasamy et al., 2002) Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus có

thể cố định đạm trong điều kiện O2 thay đổi liên tục, có khả năng nội cộng sinh cố định đạm mà không gây hại cho cây và có thể cung cấp hơn một nửa lượng đạm ở

dạng hữu ích cho cây trồng Hơn nữa, Gluconacetobacter diazotrophicus còn tổng

hợp được hormone thực vật như auxin, gibberellin, tổng hợp chất kích thích tăng trưởng (phytohormone) như IAA, có thể hòa tan kẽm và lân khó tan, tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng của cây và tạo ra vitamin cũng như enzyme giúp cây phát triển (Muthukumarasamy et al., 2002b; Munoz et al., 2003; Madhaiyan et al., 2004)

1.1.3.6 Vi khuẩn Herbaspirillium

Vi khuẩn Herbaspirillum thuộc nhóm β-Proteobacteria, là vi khuẩn Gram âm,

vi hiếu khí và là vi khuẩn cố định đạm sống trong rễ của nhiều cây không phải là họ

đậu (James et al., 1997) Hầu hết các loài của Herbaspirillum thuộc nhóm vi khuẩn

nội sinh trong các mô thực vật Chúng có khả năng cố định đạm mạnh trong vùng rễ (Baldani et al., 1986) và phát tán đến cả những vùng ở thân và lá (Barraquio et al.,

1997) Ngoài ra, Herbaspirillum còn tổng hợp được các phytohormone như IAA,

auxin và gibberellin (Muthukumarasamy et al., 2007)

Herbaspirillumđược báo cáo lần đầu tiên bởi Baldani et al (1986) như một

loài vi khuẩn cố định đạm cộng sinh với rễ của cây lúa (Oryza sativa), bắp (Zea

mays ) và cây cao lương (sorghum) (Sorghum bicolor) và được cho là loài

Herbaspirillum seropedicae vì ở thời điểm này, chỉ có một loài thuộc giống

Herbaspirillumđược biết đến Sau đó, Baldani et al (1996) đã phân lập được

Herbaspirillum rubrisubalbicans từ rễ, thân và lá của cây mía (Saccharurn spp.)

Cả hai loài vi khuẩn này đã được tìm thấy ở, rễ, thân và cả lá của các cây bắp, cỏ voi, sorghum và mía đường (Olivares et al., 1996); chuối và khóm (Cruz et al., 2001); lúa hoang và lúa trồng (Elbeltagy et al., 2001)

Gần đây, một vài loài Herbaspirillum mới đã được phát hiện nhưHerbaspirillum frisingense sp nov.được phân lập từ rễ của các loài cây C4 cho sợi (Kirchhof et al., 2001) và Herbaspirillum hiltneri sp nov.được phân lập từ rễ

của lúa mì (Rothballer et al., 2006)

1.1.3.7 Vi khuẩn Klebsiella

Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm γ-Proteobacteria, là vi khuẩn Gram âm, có

dạng hình que, không hay ít chuyển động Giống vi khuẩn này có khả năng cố định

đạm, tổng hợp IAA và phân giải lân khó tan Vi khuẩn Klebsiella thường xuất hiện

tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng và sống nội sinh trong cây

Giống Klebsiella có 2 loài quan trọng là Klebsiella pneumoniae và Klebsiella

oxytoca Khoảng 30% các chủng của Klebsiella pneumoniae có thể cố định đạm

trong các điều kiện kỵ khí (Postgate, 1998)

Nhiều chủng vi khuẩn Klebsiellađã được phân lập và nghiên cứu về khả năng tổng hợp IAA như Klebsiella pneumoniachủng GR9 ở rễ và thân cây mía (Govindarajan et al., 2007), Klebsiella oxytocachủng GR-3 ở rễ và thân của cây cỏ đuôi mèo (Typha australis) (Jha và Kumar, 2007), Klebsiella pneumoniae ở vùng rễ của lúa mì (Triticum aestivum) (Sachdev et al., 2009) và chủngKlebsiella SN 1.1 ở

đất vùng rễ lúa (Chaiharn và Lumyong, 2011)

Theo Lü và Song (2000), vi khuẩn Klebsiella oxytoca chủng SG-11 được phân

lập từ rễ lúa có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật nhờ vào khả năng cố định đạm từ nitơ không khí và khả năng tổng hợp IAA từ tryptophan theo lộ trình indole-3-pyruvicacid của chúng

Ở Ấn Độ, các nhà nghiên cứu sử dụng K oxytocachủng GR-3 chủng cho giống lúa Malviya dhan-36 thì nhận thấy vi khuẩn này giúp gia tăng toàn bộ chiều

dài cây và tăng hàm lượng chlorophyll-a có hiệu quả,đồng thời chúng còn kích thích

sự thành lập rễ bên và rễ bất định cho cây (Jha và Kumar, 2007)

Theo nghiên cứu của Chaiharn và Lumyong (2011), chủngKlebsiella SN 1.1

có khả năng tổng hợp IAA cao nhất (291,97 ± 0,19 ppm) trong môi trường nuôi cấy

có bổ sung L-tryptophan và hòa tan phosphat vô cơ cao trong 216 chủng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa ở miền Bắc Thái Lan

1.1.3.8 Vi khuẩn Pseudomonas

GiốngPseudomonas thuộc nhóm γ-Proteobacteria, thường là Gram âm, hiếu

khí, có hình que, có chiên mao ở cực và không có khả năng tạo bào tử Chúng có

khả năng hô hấp hiếu khí hay kỵ khí trong môi trường không có oxy Nhiệt độ phát

triển thuận lợi của Pseudomonas spp là 30-37ºC (Cao Ngọc Điệp, 2011)

Nhiều loài trong giống Pseudomonas được xác định là vi khuẩn nội sinh trong

cây bông vải và bắp ngọt (McInroy và Klopper, 1995), đậu nành (Hung và Annapurana, 2004), cây lúa hoang và lúa trồng (Koomnok et al., 2007),…

Pseudomonas fluorescens vàPseudomonas putida là 2 loài Pseudomonas có sắc tố 992), ở đất vùng rễ và rễ của cây lanh (flax) (Linum usitatissinumhuỳnh quang chính được tìm thấy ở vùng rễ chuối (Vlassak et al 1992) và cà chua (Lycopersicon

esculentum Mill.) (Lemanceau et al 1995)

Một số loài vi khuẩn Pseudomonascó khả năng cố định đạm như P diminuta,

P fluorescens , P paucimobilis, P pseudoflava, P putida, P.saccharophila, P

stuzeri và P vesicularis có khả năng phân giải lân ở dạng khó tan thành dạng dễ tan giúp cây trồng hấp thụ như P chlororaphis, P fluorescens, P putida, và P stuzeri

(Cattenlla et al., 1999) có thể tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như auxin

và cytokinin giúp kích thích sự phát triển của rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu

chất dinh dưỡng trong đất ở một số cây trồng bao gồm cả cây lúa như P

fluorescens , P putida và P syringae (Glickmann et al., 1998; Vlassak et al 1992)

1.2.Tổng quan về cây lúa

- Lúa Indica: thường trồng ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, có thân cao,

dễ đổ ngã, nhiều chồi, lá ít xanh và cong, kháng được nhiều sâu bệnh nhiệt đới Hạt gạo dài hoặc trung bình, có nhiều tinh bột.Năng suất kém hơn lúa Japonica

- Lúa Janponica: thường được trồng ở những vùng ôn đới hoặc những nơi có

độ cao trên 1000m (trên mặt biển), có thân ngắn, chống đổ ngã, lá xanh đạm, thẳng đứng, ít chồi, hạt gạo thường tròn, ngắn hoặc trung bình, dẻo khi nấu vì ít tinh bột Lúa Japonica có năng suất cao

- Lúa Javanica hay lúa Japonica nhiệt đới được trồng ở Indonexia, có khả năng ở giữa hai loại lúa Japonica và Indica Hình thức gần giống như lúa Japonica,

có lá rộng, với nhiều lóng và ít chồi Thân cứng chắc và ít cảm quang Hạt lúa thường có đuôi

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Rễ: Rễ lúa là loại rễ chùm, rễ lúa có hai loại: rễ mầm mọc từ phôi hạt, có tác

dụng hút nước và chất dinh dưỡng đến lúc cây có 3 lá và rễ đốt mọc ra từ các đốt thân nằm dưới mặt đất, có tác dụng hút chất dinh dưỡng nuôi cây, trao đổi không khí và giữ cho cây lúa đứng vững

Thân: Là loại thân thảo Thời kỳ mạ và lúa non, thân lúa do các bẹ lá tạo

thành Sau khi làm đốt, thân lúa do các lóng và đốt tạo thành, bên ngoài có bẹ lá bao bọc Số lóng trên mỗi thân phụ thuộc vào giống: giống dài ngày 7-8 lóng, giống trung ngày 6-7 lóng và giống ngắn ngày có 4-5 lóng

Lá: Lúa có lá mầm và lá thật Lá mầm mọc trong quá trình ngâm ủ và thời

gian đầu sau khi gieo.Lá thật là lá mọc trong quá trình sinh trưởng sinh dưỡng của cây lúa và tồn tại trong suốt quá trình sinh trưởng của cây lúa Số lá trên cây phụ thuộc vào giống: giống dài ngày ≥ 20 lá, giống trung ngày 16-18 lá và giống ngắn ngày 12-15 lá

Bông lúa: Bông lúa mọc trên đốt trên cùng của thân từ trong lá cờ và mang

nhiều hoa trong một bông Cụm hoa là một chùm thưa, thẳng, hẹp, đầu hơi cong xuống, dài 15-30cm hoặc dài hơn Hoa nhỏ hình thuôn dài, mày hoa thuôn dài hình

mũi mác, hoa màu hồng, vàng hay tím, có hoa lưỡng tính, tự thụ phấn Hoa có 6 nhị đực mảnh, bao phấn dài, bầu hoa có vòi, nhụy ngắn và hai đầu nhụy có lông tơ

Hạt lúa: Mỗi một hạt lúa được hình thành từ một hoa lúa Các hạt lúa xếp sát

và gối lên nha tạo thành bông lúa Tùy vào các giống lúa khác nhau mà độ dài bông,

số lượng hạt cũng như mật độ xếp hạt của bông lúa khác nhau Hạt lúa là noãn sào thụ tinh đã chín, có hai mày trấu nhỏ trên và dưới, hai vỏ trấu trên và dưới, cuống trấu ở phần dưới của hạt và đuôi ở chót hạt (ngắn hoặc dài).Mộthạtlúanặngkhoảng12-44mg.Chiềudài,rộng,độdàycủahạtthayđổi

nhiềugiữacácgiống

1.2.3 Nhu cầu về dinh dưỡng của cây lúa

Các chất dinh dưỡng cần thiết, không thể thiếu được đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa bao gồm: đạm (N), lân (P), kali (K), vôi, sắt, kẽm, đồng, silic, lưu huỳnh, carbon, oxy và hydro, Phân bón đều có thể cung cấp được tất cả các chất dinh dưỡng trên (trừ carbon, oxy, hydro) cho cây lúa Trong đó, 3 yếu tố dinh dưỡng mà cây lúa cần với lượng lớn và cũng là các chất cần thiết cho các quá trình sống diễn ra trong cây lúa là đạm, lân và kali Các nguyên tố khoáng còn lại, cây lúa cần với lượng rất ít và hầu như đã có sẵn ở trong đất, nếu thiếu thì có thể tuỳ theo điều kiện cụ thể mà bón bổ sung Các yếu tố dinh dưỡng cung cấp cho cây lúa có vai trò khác nhau, với hàm lượng cung cấp khác nhau trong quá trình sinh trưởng, phát triển của cây lúa

Phân bón có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của cây lúa, từ giai đoạn mạ cho đến lúc thu hoạch Cùng với các yếu tố khác, phân bón cung cấp cho cây nguồn nguyên liệu để tái tạo ra các chất dinh dưỡng như: tinh bột, chất đường, chất béo và protein,… Ngoài ra, chúng còn giữ vai trò duy trì sự sống của toàn bộ cây lúa, không có nguồn dinh dưỡng thì cây lúa sẽ chết Tuy nhiên, trong thực tế, cây lúa chỉ hút được khoảng 2/3 - 3/4 lượng phân bón, lượng phân bón còn lại bị trông theo nước, bốc hơi và tồn dư trong đất

1.2.3.1 Nhu cầu về đạm

Đạm có vai trò quan trọng trong việc phát triển bộ rễ, thân, lá, chiều cao và đặc biệt ảnh hưởng tới quá trình đẻ nhánh của cây lúa (Nguyễn Như Hà., 2006) Theo Ladha và Reddy (2003), đạm cũng là dưỡng chất quan trọng, là yếu tố cấu thành năng suất lúa trồng và 1 kg đạm sản xuất được 15-20 kg lúa hạt Đạm còn có vai trò quan trọng đối với việc hình thành đòng và các yếu tố cấu thành năng suất lúa khác như số hạt/bông, trọng lượng 1000 hạt và tỷ lệ hạt chắc Vì vậy, việc cung cấp đạm đủ và đúng lúc cho cây lúa có vai trò quyết định đến việc đạt năng suất cao

(Nguyễn Như Hà., 2006)

Cây lúa hút đạm ở hai dạng : amoni (NH4+) và nitrate (NO3-) Trong ruộng ngập nước lúa hút amon nhiều hơn còn trong ruộng cạn nước lúa hút nitrate nhiều hơn Đạm amon hút vào rễ có thể kết hợp ngay với các loại acid hữu cơ ở đó tạo thành các dạng amino acid và sẽ được chuyển lên lá để tổng hợp protein Các giống lúa Indica thân cao hút đạm ít hơn so với giống lúa Japonica

Lúalàcâytrồngrấtmẫncảmvớiviệcbónđạm.Nếugiaiđoạnđẻnhánhmàthiếuđạmsẽlàmnăngsuấtlúagiảmdođẻnhánhít,dẫnđếnsốbôngít.Nếubónkhôngđủđạmsẽlàmthấpcây,đẻnhánhkém,phiếnlánhỏ,lácóthểbiếnthànhmàuvàng,bôngđòngnhỏ,từđólàmchonăngsuấtlúagiảm.Nhưngnếubónthừađạmlàmchocâylúacóláto,dài,phiếnlámỏng,dễbịsâubệnh;ngoàirachiềucaopháttriểnmạnh,dễbịđổ,nhánhvôhiệunhiều,trỗmuộn,năngsuấtgiảm.Ngo

ài ra, đạm cũng làm tăng hàm lượng protein trong gạo, ảnh hưởng tới khả năng vật

lý và sức đề kháng đối với sâu bệnh hại cây lúa (Nguyễn Ngọc Đệ., 2008)

Yêu cầu về đạm của cây lúa thay đổi trong quá trình sinh trưởng của nó Cây lúa cần nhiều đạm nhất vào hai thời kỳ: thời kỳ đẻ nhánh khoảng 70% - là thời kỳ hút đạm có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất lúa và thời kỳ làm đòng khoảng 10-15% - là thời kỳ hút đạm có hiệu suất cao (Nguyễn Như Hà., 2006) Các giống lúa thân cao thường thường có nhu cầu cao về đạm ở thời kỳ đẻ nhánh và lúc sắp trổ bông Còn các giống lúa thân thấp thì thường có nhu cầu về đạmtăng đều suốt thời

kỳ đẻ nhánh đến lúc trổ bông, chỉ sau khi trỗ nhu cầu về đạm mới giảm xuống Cây lúa đòi hỏi lượng phân đạm từ 60-100 kg/ha để đạt năng suất lúa từ 5-8 tấn/ha và cây lúa cần một lượng phân đạm hóa học cao hơn để có năng suất ổn định

(Stoltzfus et al., 1997) Tuy nhiên, hiệu suất sử dụng phân đạm cho lúa lại thấp, thường không quá 40% (Nguyễn Như Hà., 2006) dẫn đến việc lạm dụng quá mức phân bón hóa học gây nên ô nhiễm môi trường và làm hại đến sức khỏe của nông dân cũng như người tiêu dùng Bên cạnh đó, giá thành sản xuất phân đạm hóa học không ngừng tăng cũng ảnh hưởng tới thu nhập của nông dân Trong khi đó, ở vùng nhiệt đới, nhiều nghiên cứu cho thấy nguồn đạm sinh học chỉ thỏa mãn được khoảng 50 kg N/ha/vụ (Roger và Ladha., 1992) Hơn nữa, theo Fischer et al (2003), nguồn đạm tự nhiên từ sự cố định đạm sinh học với vi sinh vật sống tự do chỉ đủ sản xuất ra lúa gạo có năng suất từ 2 - 3,5 tấn/ha Do đó, nguồn đạm sinh học được cung cấp từ nguồn phân xanh, phân chuồng và phân bón sinh học với những vi sinh vật cố định đạm nội sinh cây lúa sẽ giúp tăng năng suất, đảm bảo chất lượng hạt lúa, giảm chi phí sản xuất, phục hồi độ phì nhiêu cho đất, không gây ô nhiễm môi trường và đảm bảo sự phát triển bền vững hệ sinh thái nông nghiệp (Sturz et al., 2000)

1.2.3.2 Nhu cầu về lân

Lânlà

mộtyếutốdinhdưỡngquantrọngđốivớisinhtrưởngvàpháttriểncủacâytrồngvìlà

nucleic,làchấtchủyếucủanhântếbào.Lâncóquanhệchặtchẽvớisựhìnhthànhdiệplục,protitvàsựdichuyểntinhbột.Vaitrò chủyếucủalânthểhiệnởcácmặtsau:

- Xúctiếnsựpháttriểncủabộrễlúa,đặcbiệtlàrễbênvà lông hút

- Làm tăngsốnhánhvàtốcđộ đẻnhánhcủalúa,sớmđạtsốnhánhcựcđại,tạothuận lợichoviệctăngsố bông,dẫnđếnlàm tăngnăngsuấtlúa

- Thúcđẩyviệcrahoa,hìnhthànhquả,tăngnhanhquátrìnhtrỗ, chín củalúavàảnhhưởngtíchcựcđếnchấtlượnghạt

- Tăngkhảnăngchốngchịuvới cácđiềukiệnbấtlợivàsâubệnhhại

- Thúcđẩyphânchiatếbào,tạothànhcáchợpchấtbéovàprotein

- Ngoàira,lâncòncómốiquanhệchặtchẽvớisựhìnhthànhdiệplục,protitvàsựvậnchuyểntinhbột

Khithiếulân,lálúacómàuxanhđậm,bảnlánhỏhẹpvàmềmyếu,méplácómàuvàngtía,đẻnhánhkém,kéodàithờikỳchỗchín.Nếuthiếulânởthờikỳlàmđòngsẽảnhhưởngrấtrõđếnnăngsuấtlúa,cụthể làlàmgiảmnăngsuấtlúa

Khicây

lúađượccungcấplânthoảđángsẽtạođiềukiệnchobộrễpháttriểntốt,tăngkhảnăngchốnghạn,tạođiềukiệnchosinhtrưởng,pháttriển,thúcđẩysựchín

củahạtvàcuốicùnglàtăngnăngsuấtlúa

Để tạo ra một tấn lúa, cây lúa cần khoảng 7,1 kg P2O5, trong đó có khoảng 6

kg P2O5 tích lũy chủ yếu vào hạt (Nguyễn Như Hà., 2006)

Lượng hữu dụng của lân trong đất rất thấp Thời gian ngập nước càng lâu, giúp pH đất gia tăng và độ hữu dụng của lân cũng gia tăng Do đó, lượng lân hữu dụng lúc chuẩn bị sạ vụ hè thu thì thấp hơn đầu vụ đông xuân Lân rất ít di chuyển, nên bón lân chôn vùi vào trong đất ở độ sâu vùng rễ thì giúp cho lúa hấp thụ tốt hơn Nhu cầu hấp thụ lân của cây lúa chủ yếu vào thời kỳ sinh trưởng đầu của cây lúa Cây lúa hút lân mạnh nhất vào thời kỳ đẻ nhánh và làm đòng nhưng xét về cường độ thì cây lúa hút lân mạnh nhất vào thời kỳ đẻ nhánh (Nguyễn Như Hà., 2006)

1.2.3.3.Nhu cầu về kali

Cùngvớiđạm,lânthìkalilàmột

nguyêntốđalượngquantrọngđốivớisựsinhtrưởngvàpháttriểncủacâylúa.Kalicótácdụngxúctiếnsựdichuyểncủacácchấtđồnghoátrongcây.Ngoàira,kalicònlàmchosựdiđộngcủasắttrongcâyđượctốtdođóảnhhưởnggiántiếpđếnquátrìnhhôhấp.Kalicũngrấtcầnchosựtổnghợpprotit,quanhệmậtthiếtvớisựphânchiatếbào

Vaitròcủakaliđốivớisinhtrưởng,cácyếutốcấuthànhnăngsuấtvànăngsuấtlúađãđượcnhiềutácgiảtrongvàngoàinướcnghiêncứu.Nóichung,khithiếukalithìdẫnđếnsựquanghợpcủacâybịgiảmsútrõrệt,kéotheocườngđộhôhấptănglên,làmchosựtíchluỹsảnphẩmcủaquátrìnhquanghợptrongcâybịgiảm,trườnghợpnàyđượcthểhiệnrấtrõtrongđiềukiệnthiếuánh sáng đặcbiệtvaitròcủakaliđượcthểhiệnrõnhấttrongthờikỳđầulàmđòng

Trongthờikỳnày,nếuthiếukalisẽlàmchogiébông bịthoáihoánhiều,số bông ít,trọnglượngnghìnhạtgiảm,hạtxanh,léplửngvàbạcbụngnhiều,phẩmchấtgạobịgiảmsút Kếtquảnghiêncứutừnăm1994đếnnăm1996củaNguyễnNhưHàchothấy,khôngbónph

đượctạothànhgiảm,đồngthờilàmtăngtỷlệléplửng),năngsuấtlúagiảmrõ rệtsovới bónđủkali,(PhạmVănCườnget al.,2007)

Khôngbónkalilàmgiảmtíchluỹkalivàđạmtrongsảnphẩmthu

hoạch,đạmtíchluỹnhiềutrongrơmrạkhôngđượcvậnchuyểnvềhạtlànguyênnhânlàmgiảmnăngsuấtvàchấtlượnggạo

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trên cây lúa đã được tiến hành rất nhiều trên thế giới.Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã phát hiện các nhóm vi khuẩn có khả năng cố định đạm cho cây lúa giúp tăng năng suất cây trồng từ 15-54% (Favilli et al., 1987; Omar et al., 1989)

Theo nghiên cứu của Puneet khi phối hợp chủng Azotobacter sp với các chủng phân giải phosphat như Bacillus sp, Pseudomonas sp Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa, bông

vải lên 10-20% (Puneet.,1998)

Abbas Akbari và cộng sự (2007) đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng

Azospirillum sp có khả năng sinh tổng hợp IAA kích thích sinh trưởng của cây lúa mì Kết

quả là sự nhiễm các chủng Azospirillumsppđã làm tăng đường kính gốc lúa, chiều dài rễ,

trọng lượng khô và số lượng lông rễ so với đối chứng

Andres D Naiman và cộng sự (2009) đã nghiên cứu xử lý gây nhiễm vi khuẩn

Azospirillum brasilense và Pseudomonas fluorescens cho lúa mì Kết quả cho thấy chiều cao

cây tăng 12%,đường kính gốc thân tăng 40%, năng suất tăng 16%

El-Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố định N Azospirillum và phân giải lânBacillus megaterium xử lý cho lúa mì Kết quả cho thấy hàm lượng N trong thân lúa mì

của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này tăng 37-53%; hàm lượng P trong thân tăng 48,6%; hàm lượng K tăng 10-14,3% so với đối chứng không xử lý Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy xử lý phối hợp hai chủng có tác dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý đơn chủng

Tiến hành chủng vi khuẩn Herpaspirillum seropedicae và giống vi khuẩnBurkholderia vào cây lúa, kết quả cho thấy vi khuẩn có khả năng cố định đạm

khoảng19% tổng số đạm cần thiết cho cây (Vera et al., 2000)

Ở Hy Lạp (mùa hè 1990) đã sử dụng phân đạm sinh học làm cho năng suất lúa tăng 15%-20%, sản lượng của bắp, lúa mì, lúa mạch tăng 3%-54% so với những vụ đối chứng không bón phân Với những nghiên cứu chủng vi khuẩn cố định đạm trên lúa mì ở Mexico làm cho năng suất tăng từ 23%-63% và 24%-43% (Okon và Labandera-Gonzalez, 1994)

1.3.2.Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, việc nghiên cứu các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp kích thích tố IAA ở các cây nông nghiệp đã được tiến hành khá nhiều trong những năm gần đây Tại Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học - Đại học Cần Thơ, Nguyễn Hữu Hiệp et al., (2005) đã phân lập và nhận

diện các chủngAzospirillum bằng kỹ thuật PCR từ rễ và thân lúa hoang, lúa trồng và

một số loại cỏ ở ruộng lúa

Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng cố định N trong rễ lúa đến sinh trưởng của mầm lúa CR 203,Nhóm tác giả đã phân lập được 78 chủng cộng sinh với rễ lúa Các chủng này có đặc điểm của chi

Azospirillum Các chủng này kích thích sự nảy mầm và rễ của lúa CR 203,

Ngô Thanh Phong, Cao Ngọc Diệp (2012) đã nghiên cứu xác định mức độ cố

định đạm sinh học của Burkholderia sp KG1 và Pseudomonas sp BT1 trên cây lúa

cao sản OM2517 trồng ngoài đồng Kết quả 2 chủng này có thể thay thế 25 - 50% N cho năng xuất cao hơn đối chứng khi bón 100%N mà không nhiễm vi khuẩn

Loài Burkholderia vietnamiensis được tìm thấy ở rễ cây lúa trồng ở miền nam Việt Nam, thí nghiệm ở cây lúa chủng Burkholderia vietnamiensis sau 14 ngày

chúng giúp tăng khả năng đâm chồi 33%, rễ tăng 57% diện tích lá tăng 30% năng xuất lúa tăng 13-22% (La Nguyễn Tường Vi., 2010)

Theo thí nghiệm của Cao Ngọc Điệp (2005), khi tưới dịch vi khuẩn

Pseudomonas spp lên lúa cao sản trồng trên đất phù sa ở Cần Thơ đã giúp tăng năng suất lúa lên 20-37%

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1.Đối tượng vật liệu nghiên cứu

-Các chủng vi sinh vật nội sinh phân lập từ lúa

-Hai giống lúaTH 3 - 3 và Bắc Thơm 7

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm

Dụng cụ: cối và chày, đĩa petri, ống nghiệm, ốngeppendorf, đầu cone xanh, đầu conevàng, micropipets, cốc thủy tinh, bình tam giác các loại, ống falcon,… Thiết bị: tủ cấy, máy đo OD, máy ly tâm, máy lắc, cân điện tử, máy Vortex, máy đo pH, máy khuấy từ, tủ sấy, tủ lạnh, tủ nuôi, nồi khử trùng nhiệt ướt, máy ảnh,…

+ Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh

Bảng 2.1: Thành phần môi trường RMR (Elbeltagy et al., 2001)

Sucrose 5 g/l Sodium lactate 60% 0,5 ml/l

hoặc 1,8 g/l cho môi trường bán đặc

- Dung dịch EDTA (Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt

-C10H14N2O8Na2.2H2O): hòa tan 6 gram EDTA trong 100ml nước cất

- Dung dịch Phenol (C5H5OH)-Sodium nitroprusside dihydrate (Na2Fe(CN)5NO.2H2O): hòa tan 7 gram phenol + 0,034 gram sodium nitroprusside trong 100mlnước cất

- Dung dịch Sodium hypochloride(NaOCl): hòa tan 1,48 gram NaOH + 4,98 gram Na2HPO4+ 20ml NaOCl (5% - 5,25%) trong nước cấtcho đủ thể tích 100ml