Các chất dinh dưỡng cần thiết, không thể thiếu được đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa bao gồm: đạm (N), lân (P), kali (K), vôi, sắt, kẽm, đồng, silic, lưu huỳnh, carbon, oxy và hydro,... Phân bón đều có thể cung cấp được tất cả các chất dinh dưỡng trên (trừ carbon, oxy, hydro) cho cây lúa. Trong đó, 3 yếu tố dinh dưỡng mà cây lúa cần với lượng lớn và cũng là các chất cần thiết cho các quá trình sống diễn ra trong cây lúa là đạm, lân và kali. Các nguyên tố khoáng còn lại, cây lúa cần với lượng rất ít và hầu như đã có sẵn ở trong đất, nếu thiếu thì có thể tuỳ theo điều kiện cụ thể mà bón bổ sung. Các yếu tố dinh dưỡng cung cấp cho cây lúa có vai trò khác nhau, với hàm lượng cung cấp khác nhau trong quá trình sinh trưởng, phát triển của cây lúa.
Phân bón có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của cây lúa, từ giai đoạn mạ cho đến lúc thu hoạch. Cùng với các yếu tố khác, phân bón cung cấp cho cây nguồn nguyên liệu để tái tạo ra các chất dinh dưỡng như: tinh bột, chất đường, chất béo và protein,… Ngoài ra, chúng còn giữ vai trò duy trì sự sống của toàn bộ cây lúa, không có nguồn dinh dưỡng thì cây lúa sẽ chết. Tuy nhiên, trong thực tế, cây lúa chỉ hút được khoảng 2/3 - 3/4 lượng phân bón, lượng phân bón còn lại bị trông theo nước, bốc hơi và tồn dư trong đất.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
Đạm có vai trò quan trọng trong việc phát triển bộ rễ, thân, lá, chiều cao và đặc biệt ảnh hưởng tới quá trình đẻ nhánh của cây lúa (Nguyễn Như Hà., 2006). Theo Ladha và Reddy (2003), đạm cũng là dưỡng chất quan trọng, là yếu tố cấu thành năng suất lúa trồng và 1 kg đạm sản xuất được 15-20 kg lúa hạt. Đạm còn có vai trò quan trọng đối với việc hình thành đòng và các yếu tố cấu thành năng suất lúa khác như số hạt/bông, trọng lượng 1000 hạt và tỷ lệ hạt chắc. Vì vậy, việc cung cấp đạm đủ và đúng lúc cho cây lúa có vai trò quyết định đến việc đạt năng suất cao (Nguyễn Như Hà., 2006).
Cây lúa hút đạm ở hai dạng : amoni (NH4+) và nitrate (NO3-). Trong ruộng ngập nước lúa hút amon nhiều hơn còn trong ruộng cạn nước lúa hút nitrate nhiều hơn. Đạm amon hút vào rễ có thể kết hợp ngay với các loại acid hữu cơ ở đó tạo thành các dạng amino acid và sẽ được chuyển lên lá để tổng hợp protein. Các giống lúa Indica thân cao hút đạm ít hơn so với giống lúa Japonica.
Lúalàcâytrồngrấtmẫncảmvớiviệcbónđạm.Nếugiaiđoạnđẻnhánhmàthiếuđạmsẽlà mnăngsuấtlúagiảmdođẻnhánhít,dẫnđếnsốbôngít.Nếubónkhôngđủđạmsẽlàmthấpcây,đ ẻnhánhkém,phiếnlánhỏ,lácóthểbiếnthànhmàuvàng,bôngđòngnhỏ,từđólàmchonăngsuấ tlúagiảm.Nhưngnếubónthừađạmlàmchocâylúacóláto,dài,phiếnlámỏng,dễbịsâubệnh;n goàirachiềucaopháttriểnmạnh,dễbịđổ,nhánhvôhiệunhiều,trỗmuộn,năngsuấtgiảm.Ngo ài ra, đạm cũng làm tăng hàm lượng protein trong gạo, ảnh hưởng tới khả năng vật lý và sức đề kháng đối với sâu bệnh hại cây lúa (Nguyễn Ngọc Đệ., 2008).
Yêu cầu về đạm của cây lúa thay đổi trong quá trình sinh trưởng của nó. Cây lúa cần nhiều đạm nhất vào hai thời kỳ: thời kỳ đẻ nhánh khoảng 70% - là thời kỳ hút đạm có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất lúa và thời kỳ làm đòng khoảng 10- 15% - là thời kỳ hút đạm có hiệu suất cao (Nguyễn Như Hà., 2006). Các giống lúa thân cao thường thường có nhu cầu cao về đạm ở thời kỳ đẻ nhánh và lúc sắp trổ bông. Còn các giống lúa thân thấp thì thường có nhu cầu về đạmtăng đều suốt thời kỳ đẻ nhánh đến lúc trổ bông, chỉ sau khi trỗ nhu cầu về đạm mới giảm xuống.
Cây lúa đòi hỏi lượng phân đạm từ 60-100 kg/ha để đạt năng suất lúa từ 5-8 tấn/ha và cây lúa cần một lượng phân đạm hóa học cao hơn để có năng suất ổn định
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
(Stoltzfus et al., 1997). Tuy nhiên, hiệu suất sử dụng phân đạm cho lúa lại thấp, thường không quá 40% (Nguyễn Như Hà., 2006) dẫn đến việc lạm dụng quá mức phân bón hóa học gây nên ô nhiễm môi trường và làm hại đến sức khỏe của nông dân cũng như người tiêu dùng. Bên cạnh đó, giá thành sản xuất phân đạm hóa học không ngừng tăng cũng ảnh hưởng tới thu nhập của nông dân. Trong khi đó, ở vùng nhiệt đới, nhiều nghiên cứu cho thấy nguồn đạm sinh học chỉ thỏa mãn được khoảng 50 kg N/ha/vụ (Roger và Ladha., 1992). Hơn nữa, theo Fischer et al. (2003), nguồn đạm tự nhiên từ sự cố định đạm sinh học với vi sinh vật sống tự do chỉ đủ sản xuất ra lúa gạo có năng suất từ 2 - 3,5 tấn/ha. Do đó, nguồn đạm sinh học được cung cấp từ nguồn phân xanh, phân chuồng và phân bón sinh học với những vi sinh vật cố định đạm nội sinh cây lúa sẽ giúp tăng năng suất, đảm bảo chất lượng hạt lúa, giảm chi phí sản xuất, phục hồi độ phì nhiêu cho đất, không gây ô nhiễm môi trường và đảm bảo sự phát triển bền vững hệ sinh thái nông nghiệp (Sturz et al., 2000). 1.2.3.2. Nhu cầu về lân Lânlà mộtyếutốdinhdưỡngquantrọngđốivớisinhtrưởngvàpháttriểncủacâytrồngvìlà thànhphầnchủyếucủa acid nucleic,làchấtchủyếucủanhântếbào.Lâncóquanhệchặtchẽvớisựhìnhthànhdiệplục,prot itvàsựdichuyểntinhbột.Vaitrò chủyếucủalânthểhiệnởcácmặtsau: - Xúctiếnsựpháttriểncủabộrễlúa,đặcbiệtlàrễbênvà lông hút. - Làm tăngsốnhánhvàtốcđộ đẻnhánhcủalúa,sớmđạtsốnhánhcựcđại,tạothuận lợichoviệctăngsố bông,dẫnđếnlàm tăngnăngsuấtlúa.
- Thúcđẩyviệcrahoa,hìnhthànhquả,tăngnhanhquátrìnhtrỗ, chín củalúavàảnhhưởngtíchcựcđếnchấtlượnghạt. - Tăngkhảnăngchốngchịuvới cácđiềukiệnbấtlợivàsâubệnhhại. - Thúcđẩyphânchiatếbào,tạothànhcáchợpchấtbéovàprotein. - Ngoàira,lâncòncómốiquanhệchặtchẽvớisựhìnhthànhdiệplục,protitvàsựvậnc huyểntinhbột.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 Khithiếulân,lálúacómàuxanhđậm,bảnlánhỏhẹpvàmềmyếu,méplácómàuvàngtía ,đẻnhánhkém,kéodàithờikỳchỗchín.Nếuthiếulânởthờikỳlàmđòngsẽảnhhưởngrấtrõđế nnăngsuấtlúa,cụthể làlàmgiảmnăngsuấtlúa. Khicây lúađượccungcấplânthoảđángsẽtạođiềukiệnchobộrễpháttriểntốt,tăngkhảnăngchốnghạ n,tạođiềukiệnchosinhtrưởng,pháttriển,thúcđẩysựchín củahạtvàcuốicùnglàtăngnăngsuấtlúa.
Để tạo ra một tấn lúa, cây lúa cần khoảng 7,1 kg P2O5, trong đó có khoảng 6 kg P2O5 tích lũy chủ yếu vào hạt (Nguyễn Như Hà., 2006).
Lượng hữu dụng của lân trong đất rất thấp. Thời gian ngập nước càng lâu, giúp pH đất gia tăng và độ hữu dụng của lân cũng gia tăng. Do đó, lượng lân hữu dụng lúc chuẩn bị sạ vụ hè thu thì thấp hơn đầu vụ đông xuân. Lân rất ít di chuyển, nên bón lân chôn vùi vào trong đất ở độ sâu vùng rễ thì giúp cho lúa hấp thụ tốt hơn. Nhu cầu hấp thụ lân của cây lúa chủ yếu vào thời kỳ sinh trưởng đầu của cây lúa. Cây lúa hút lân mạnh nhất vào thời kỳ đẻ nhánh và làm đòng nhưng xét về cường độ thì cây lúa hút lân mạnh nhất vào thời kỳ đẻ nhánh (Nguyễn Như Hà., 2006). 1.2.3.3.Nhu cầu về kali Cùngvớiđạm,lânthìkalilàmột nguyêntốđalượngquantrọngđốivớisựsinhtrưởngvàpháttriểncủacâylúa.Kalicótácdụng xúctiếnsựdichuyểncủacácchấtđồnghoátrongcây.Ngoàira,kalicònlàmchosựdiđộngcủa sắttrongcâyđượctốtdođóảnhhưởnggiántiếpđếnquátrìnhhôhấp.Kalicũngrấtcầnchosựtổ nghợpprotit,quanhệmậtthiếtvớisựphânchiatếbào. Vaitròcủakaliđốivớisinhtrưởng,cácyếutốcấuthànhnăngsuấtvànăngsuấtlúađãđượ cnhiềutácgiảtrongvàngoàinướcnghiêncứu.Nóichung,khithiếukalithìdẫnđếnsựquangh ợpcủacâybịgiảmsútrõrệt,kéotheocườngđộhôhấptănglên,làmchosựtíchluỹsảnphẩmcủa quátrìnhquanghợptrongcâybịgiảm,trườnghợpnàyđượcthểhiệnrấtrõtrongđiềukiệnthiếu ánh sáng đặcbiệtvaitròcủakaliđượcthểhiệnrõnhấttrongthờikỳđầulàmđòng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
Trongthờikỳnày,nếuthiếukalisẽlàmchogiébông bịthoáihoánhiều,số bông ít,trọnglượngnghìnhạtgiảm,hạtxanh,léplửngvàbạcbụngnhiều,phẩmchấtgạobịgiảmsút. Kếtquảnghiêncứutừnăm1994đếnnăm1996củaNguyễnNhưHàchothấy,khôngbónph ânkaliảnhhưởngxấuđếncácyếutốcấuthànhnăngsuấtlúa(số bông đượctạothànhgiảm,đồngthờilàmtăngtỷlệléplửng),năngsuấtlúagiảmrõ rệtsovới bónđủkali,(PhạmVănCườnget al.,2007) Khôngbónkalilàmgiảmtíchluỹkalivàđạmtrongsảnphẩmthu hoạch,đạmtíchluỹnhiềutrongrơmrạkhôngđượcvậnchuyểnvềhạtlànguyênnhânlàmgiả mnăngsuấtvàchấtlượnggạo.
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước. 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Các nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trên cây lúa đã được tiến hành rất nhiều trên thế giới.Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã phát hiện các nhóm vi khuẩn có khả năng cố định đạm cho cây lúa giúp tăng năng suất cây trồng từ 15- 54% (Favilli et al., 1987; Omar et al., 1989).
Theo nghiên cứu của Puneet khi phối hợp chủng Azotobacter sp với các chủng phân giải phosphat như Bacillus sp, Pseudomonas sp. Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa, bông vải lên 10-20% (Puneet.,1998)
Abbas Akbari và cộng sự (2007) đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng
Azospirillum sp có khả năng sinh tổng hợp IAA kích thích sinh trưởng của cây lúa mì. Kết quả là sự nhiễm các chủng Azospirillumsppđã làm tăng đường kính gốc lúa, chiều dài rễ, trọng lượng khô và số lượng lông rễ so với đối chứng.
Andres D. Naiman và cộng sự (2009) đã nghiên cứu xử lý gây nhiễm vi khuẩn
Azospirillum brasilense và Pseudomonas fluorescens cho lúa mì. Kết quả cho thấy chiều cao cây tăng 12%,đường kính gốc thân tăng 40%, năng suất tăng 16%.
El-Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố định N Azospirillum và phân giải lânBacillus megaterium xử lý cho lúa mì. Kết quả cho thấy hàm lượng N trong thân lúa mì của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này tăng 37-53%; hàm lượng P trong thân tăng 48,6%; hàm lượng K tăng 10-14,3% so với đối chứng không xử lý. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy xử lý phối hợp hai chủng có tác dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý đơn chủng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
Tiến hành chủng vi khuẩn Herpaspirillum seropedicae và giống vi khuẩnBurkholderia vào cây lúa, kết quả cho thấy vi khuẩn có khả năng cố định đạm khoảng19% tổng số đạm cần thiết cho cây (Vera et al., 2000).
Ở Hy Lạp (mùa hè 1990) đã sử dụng phân đạm sinh học làm cho năng suất lúa tăng 15%-20%, sản lượng của bắp, lúa mì, lúa mạch tăng 3%-54% so với những vụ đối chứng không bón phân. Với những nghiên cứu chủng vi khuẩn cố định đạm trên lúa mì ở Mexico làm cho năng suất tăng từ 23%-63% và 24%-43% (Okon và Labandera-Gonzalez, 1994).
1.3.2.Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở nước ta, việc nghiên cứu các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp kích thích tố IAA ở các cây nông nghiệp đã được tiến hành khá nhiều trong những năm gần đây. Tại Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học - Đại học Cần Thơ, Nguyễn Hữu Hiệp et al., (2005) đã phân lập và nhận diện các chủngAzospirillum bằng kỹ thuật PCR từ rễ và thân lúa hoang, lúa trồng và một số loại cỏ ở ruộng lúa.
Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng cố định N trong rễ lúa đến sinh trưởng của mầm lúa CR 203,Nhóm tác giả đã phân lập được 78 chủng cộng sinh với rễ lúa. Các chủng này có đặc điểm của chi
Azospirillum. Các chủng này kích thích sự nảy mầm và rễ của lúa CR 203,
Ngô Thanh Phong, Cao Ngọc Diệp (2012) đã nghiên cứu xác định mức độ cố định đạm sinh học của Burkholderia sp. KG1 và Pseudomonas sp. BT1 trên cây lúa cao sản OM2517 trồng ngoài đồng. Kết quả 2 chủng này có thể thay thế 25 - 50% N cho năng xuất cao hơn đối chứng khi bón 100%N mà không nhiễm vi khuẩn.
Loài Burkholderia vietnamiensis được tìm thấy ở rễ cây lúa trồng ở miền nam Việt Nam, thí nghiệm ở cây lúa chủng Burkholderia vietnamiensis sau 14 ngày chúng giúp tăng khả năng đâm chồi 33%, rễ tăng 57% diện tích lá tăng 30% năng xuất lúa tăng 13-22% (La Nguyễn Tường Vi., 2010).
Theo thí nghiệm của Cao Ngọc Điệp (2005), khi tưới dịch vi khuẩn
Pseudomonas spp. lên lúa cao sản trồng trên đất phù sa ở Cần Thơ đã giúp tăng năng suất lúa lên 20-37%.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1.Đối tượng vật liệu nghiên cứu
-Các chủng vi sinh vật nội sinh phân lập từ lúa. -Hai giống lúaTH 3 - 3 và Bắc Thơm 7.
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
Dụng cụ: cối và chày, đĩa petri, ống nghiệm, ốngeppendorf, đầu cone xanh, đầu conevàng, micropipets, cốc thủy tinh, bình tam giác các loại, ống falcon,…
Thiết bị: tủ cấy, máy đo OD, máy ly tâm, máy lắc, cân điện tử, máy Vortex, máy đo pH, máy khuấy từ, tủ sấy, tủ lạnh, tủ nuôi, nồi khử trùng nhiệt ướt, máy ảnh,…
2.1.3. Hóa chất
+ Hóa chất dùng để khử trùng mẫu rễ, thân của cây lúa
-Ethanol 70%
-Hydrogen peroxide (H2O2) 3% -Nước cất vô trùng
+ Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh
Bảng 2.1: Thành phần môi trường RMR (Elbeltagy et al., 2001) Hóa chất Khối lượng (g/l) Dung dịch A K2HPO4 0,8 g/l KH2PO4 0,2 g/l NaCl 0,1 g/l Na2FeEDTA 28 mg/l Na2MoO4.2H2O 25 mg/l Yeast extract 100 mg/l Mannitơl 3 g/l
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
Sucrose 5 g/l
Sodium lactate 60% 0,5 ml/l
Malic acid 2 g/l
Agar 18 g/l cho môi trường đặc
hoặc 1,8 g/l cho môi trường bán đặc Nước cất 900 ml/l pH 7,0 Dung dịch B MgSO4.7H2O 0,2 g/l CaCl2.2H2O 0,06 g/l Nước cất 100 ml/l
+ Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng cốđịnh đạm của vi khuẩn.
Thuốc thử
- Dung dịch EDTA (Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt - C10H14N2O8Na2.2H2O): hòa tan 6 gram EDTA trong 100ml nước cất. - Dung dịch Phenol (C5H5OH)-Sodium nitroprusside dihydrate
(Na2Fe(CN)5NO.2H2O): hòa tan 7 gram phenol + 0,034 gram sodium nitroprusside trong 100mlnước cất.
- Dung dịch Sodium hypochloride(NaOCl): hòa tan 1,48 gram NaOH + 4,98 gram Na2HPO4+ 20ml NaOCl (5% - 5,25%) trong nước cấtcho đủ thể tích 100ml.
- Dung dịch đạm chuẩn NH4+1mg/l:
+ Dung dịch (NH4)2SO4 500mg/l: hòa tan 0,2358g (NH4)2SO4 trong 100ml nước cất.
+ Dung dịch(NH4)2SO4 1mg/l: hòa tan 1m dd (NH4)2SO4 500mg/l thành 500ml với nước cất.
+ Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng phân giải lân khó tan của vi khuẩn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
Thuốc thử
- H2SO4 5N: Pha 70 mL H2SO4đậm đặc với nước cất thành 500 mL.
- Dung dịch Potassium antimonyl tartrate: Hòa tan 0,12 g K(SbO)C4H4O6.1/2H2O trong 400 mL nước cất. sau đó pha loãng thành 500 mL.
- Dung dịch ammonium molybdate: hòa tan 20 g (NH4)6Mo7O24.4H2O trong 500 mL nước cất.
- Acid Ascorbic 0,1M: hòa tan 1,76 g trong 100 mL nước cất. Dung dịch ổn định khoảng 1 tuần ở 4oC.
- Thuốc thử kết hợp (combined reagent): Trộn các thuốc thử trên lại với nhau theo tỉ lệ sau để được 100 mL thuốc thử kết:
+ 50 mL H2SO4 5N
+ 5 mL potassium antimonyl tartrate + 15 mL ammonium molybdate + 30 mL acid ascorbic.
Trộn đều mỗi khi cho vào từng loại thuốc thử theo thứ tự nêu trên. Cho phép các thuốc thử trên ở 30oC trước khi phối hợp. Nếu độ đục xuất hiện trong thuốc thử hỗn hợp thì lắc đều rồi để yên cho đến khi độ đục không còn xuất hiện. Thuốc thử này ổn định trong 4 giờ.
- Dung dịch mẹ (stock phosphate solution): Hòa tan 219,5 mg KH2PO4 trong 1000mL nước cất để được dung dịch có nồng độ chất chuẩn là 50 µg/mL hay 50 mg/L.
- Dung dịch chuẩn (Standard phosphate solotion): Hòa tan 50 mL dung dịch mẹ với 1000 mL nước cất để có được dung dịch chuẩn có nồng độ 2,5
µg/mL hay 2,5 mg/L.
Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng tổng hợp Indole-3-Acetic Acid (IAA) của vi khuẩn
- Dung dịch đệm phosphate
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
B: 0,174g K2HPO4 + 100ml nước cất
Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, điều chỉnh pH =7. - Thuốc thử Salkowsky
Thêm từ từ 553 ml H2SO4 vào nước cất cho đủ 1 lít, để nguội được dung dịch H2SO4 đậm đặc 10,8M.
Cân 4,5 gram FeCl3 và thêm từ từ dung dịch H2SO4 đậm đặc 10,8M vào rồi khuấy cho FeCl3 tan đều.
Bảo quản trong chai sậm màu và đặt trong tối.
- Dung dịch IAA chuẩn 160 µg/ml.: Cân 1,6mg IAA hòa tan với 10ml dung dịch đệm.
2.1.4.Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.4.1.Địa điểm nghiên cứu
Viện sinh học nông nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
2.1.4.2. Thời gian nghiên cứu
- Từ tháng 6/2014 đến tháng6/2015
2.2. Nội dụng nghiên cứu
2.2.1.Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây lúa.
2.2.2. Đánh giá khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được, tuyển chọn được các chủng ưu việt. chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được, tuyển chọn được các chủng ưu việt. 2.2.3. Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố(thời gian nuôi cấy, pH, nhiệt độ
môi trường) tới khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.2.4. Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.2.5.Đánh giá tác động của các chủng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn được đến sinh trưởng, năng suất lúa trồng tại Gia Lâm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các chủng vi khuẩn
- Thu mẫu: Thu 3 mẫu lúa ở mỗi địa diểm, mỗi mẫu chọn 4-5 cây lúa đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh. Sau đó rửa cây lúa dưới vòi nước chảy mạnh cho thật sạch đất bám ở thân và rễ, bảo quản ở 4ºC.
- Xử lý mẫu
+ Cắt rời thân, lá và rễ ra thành từng đoạn nhỏ.
+ Khử trùng bề mặt thân, lá, rễ lần lượt bằngcồn 70% và H2O2 3% trong 3 phút, sau đó, rửa sạch 4 lần bằng nước cất vô trùng.
+ Để kiểm tra vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt thân, lá, rễ cây lúa sau khi khử trùng, lấy 200 µl nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần cuối (lần 4) chủng trên các đĩa chứa môi trường Tryptone -Yeast extract - glucose agar và ủ ở 30ºCtrong 24 giờ. Nếu sau 24 giờ,các đĩa môi trường này không xuất hiện các khuẩn lạc thì các mẫu thân lá rễđã khử trùng đạt yêu cầu.
- Mẫu thân,lá và rễ sau khi đã khử trùng cho vào cối vô trùng, giã nhuyễn, thêm 1 ml nước cất vô trùng vào cối, trộn đều và hút dịch trích mẫu cho vào tube 1,5 ml vô trùng.
- Hút 50 µl dịch trích mẫu cho vào đĩa môi trường RMRsau đó dùng que cấy vô trùng chang đều lên mặt thạch, ủ ở 30ºC trong khoảng 1-2 ngày.Sau 1-2 ngày, chọn các khuẩn lạc (khác nhau về hình dạng, màu sắc, kích thước) từ đĩa môi trường trên cấy chuyển nhiều lần đến khi các khuẩn lạc rời ra.Cấy các chủng vi khuẩn đã thuần vào ống nghiệm chứa môi trường RMR đặc và giữ ở 4ºC.
2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào.
2.3.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc.
Trong khi cấy chuyển vi khuẩn trên môi trường đặc, ta tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng…
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33