2.2.3. Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố(thời gian nuôi cấy, pH, nhiệt độ
môi trường) tới khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.2.4. Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.2.5.Đánh giá tác động của các chủng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn được đến sinh trưởng, năng suất lúa trồng tại Gia Lâm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các chủng vi khuẩn
- Thu mẫu: Thu 3 mẫu lúa ở mỗi địa diểm, mỗi mẫu chọn 4-5 cây lúa đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh. Sau đó rửa cây lúa dưới vòi nước chảy mạnh cho thật sạch đất bám ở thân và rễ, bảo quản ở 4ºC.
- Xử lý mẫu
+ Cắt rời thân, lá và rễ ra thành từng đoạn nhỏ.
+ Khử trùng bề mặt thân, lá, rễ lần lượt bằngcồn 70% và H2O2 3% trong 3 phút, sau đó, rửa sạch 4 lần bằng nước cất vô trùng.
+ Để kiểm tra vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt thân, lá, rễ cây lúa sau khi khử trùng, lấy 200 µl nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần cuối (lần 4) chủng trên các đĩa chứa môi trường Tryptone -Yeast extract - glucose agar và ủ ở 30ºCtrong 24 giờ. Nếu sau 24 giờ,các đĩa môi trường này không xuất hiện các khuẩn lạc thì các mẫu thân lá rễđã khử trùng đạt yêu cầu.
- Mẫu thân,lá và rễ sau khi đã khử trùng cho vào cối vô trùng, giã nhuyễn, thêm 1 ml nước cất vô trùng vào cối, trộn đều và hút dịch trích mẫu cho vào tube 1,5 ml vô trùng.
- Hút 50 µl dịch trích mẫu cho vào đĩa môi trường RMRsau đó dùng que cấy vô trùng chang đều lên mặt thạch, ủ ở 30ºC trong khoảng 1-2 ngày.Sau 1-2 ngày, chọn các khuẩn lạc (khác nhau về hình dạng, màu sắc, kích thước) từ đĩa môi trường trên cấy chuyển nhiều lần đến khi các khuẩn lạc rời ra.Cấy các chủng vi khuẩn đã thuần vào ống nghiệm chứa môi trường RMR đặc và giữ ở 4ºC.
2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào.
2.3.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc.
Trong khi cấy chuyển vi khuẩn trên môi trường đặc, ta tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng…
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
2.3.2.2.Phương pháp quan sát tế bào vi khuẩn.
Chuẩn bị:
• Dụng cụ, thiết bị
- Lam kính, lamen đã được rửa sạch và ngâm qua cồn 96º, với lam kính mới mua cần làm sạch bằng cách đun sôi trong dung dịch NaOH 1% trong 10 phút, rửa bằng nước cất, HCl loãng và sau cùng rửa sạch bằng nước cất; lam kính đã được sử dụng, nhất là được dùng để nhuộm mẫu cần được xử lý bằng cách ngâm trong dung dịch sulfocromate (100g H2SO4đậm đặc, 50g K2Cr2O7 và 1000 ml nước cất). Lamen được rửa sạch với xà phòng, làm khô và ngâm trong cồn 96º.
- Tăm, đầu tip vô trùng.
- Kính hiển vi quang học (có dầu soi kính).
• Hóa chất
- Pha thuốc nhuộm:
+ Tím gentian: dung dịch 1: 1g tím gentian + 10ml ethanol 96%; dung dịch 2: 5% phenol + nước (100ml), khi tan hết tím gentian thì trộn 2 dung dịch với nhau.
+ Fuchsin (thuốc thử Schiff): 97.5ml H2O; 2.5ml HCl đậm đặc; 0,5g Fuchsin basic; 1.5g Kali metadisunfit hoặc Natri metadisunfit.
Hòa tan các chất này vào lọ theo thứ tự, không lắc, để kín trong tối 2 ngày đêm.
+ Lugol: dung dich 1: 100g KI + 1l H2O; dung dịch 2: 50g Iot dạng tinh thể vào 100ml acetic acid, trộn (1) + (2).
- Nước cất vô trùng.
Lưu ý: Sử dụng tế bào vi khuẩn được nuôi trong 24 - 48 giờ để làm tiêu bản.
Tiến hành:
- Nhỏ 1 giọt nước lên lam kính, thêm tế bào, khuấy đều, hơ trên ngọn lửa đèn cồn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
- Sau đó, thêm 1 giọt tím gentian (để 1 phút) rồi rửa bằng Lugol trong 1 phút cho đến khi thẫm lại.
- Đổ Lugol đi rồi khử màu bằng ethanol 96% (20 giây), thay cồn vài lần (để nghiêng lam kính tạo dòng chảy).
- Dùng nước sạch rửa tiêu bản.
- Nhuộm bổ sung Fuchsin trong 20 giây. - Rửa lại bằng nước.
- Soi kính, ở vật kính x100, sử dụng dầu soi kính (chú ý thao tác sử dụng kính hiển vi). Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn và chụp lại hình ảnh thông qua hệ thống chụp ảnh tự động từ kính hiển vi.
Kết quả: vi khuẩn gram dương bắt màu tím, vi khuẩn gram âm bắt màu hồng đỏ.
2.3.3.Xác định khả năng cốđịnh đạm, phân giải lân, tổng hợp IAAcủa các chủng vi khuẩn nội sinh.
2.3.3.1. Định lượng đạm bằng phương pháp Indophenol blue (Page et al., 1982).
Nguyên tắc: Dựa vào phương pháp Indophenol Blue hàm lượng đạm NH4+được đo bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ kế Spectrophotomecter ở bước sóng 636 nmđể đánh giá khả năng tổng hợp đạm của các chủng vi khuẩn.Trong phương pháp Indophenol, phenol và Hypochlorite phản ứng trong môi trường kiềm hình thành phenylquinone-monoimine, rồi trở lại phản ứng với ammonia tạo thành Indophenol có màu xanh, được minh họa qua phương trình sau:
Phương pháp Indophenol blue cho phép xác định hàm lượng NH4+ từ 0,2 đến 12,5 ppm.
Cường độ màu tùy thuộc vào nồng độ hiện diện của ammonia, hàm lượng NH4 càng cao thì màu xanh càng đậmvà sodium nitroprusside được thêm vào để làm tăng cường độ hiện màu trong dung dịch.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
Chuẩn bị mẫu
Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập được nuôi cấy trong môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005) đặc nuôi ở 30o C trong 1-2 ngày, sau đó kiểm sự phát triển của chúng. Những chủng vi khuẩn nào có khả năng sống sót và phát triển trên môi trường Burk không đạm đặc thì cấy sang môi trường Burk không đạm lỏng.Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường Burk không đạm lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút từ 2- 3 ngày. Sau đó lấy mẫu vào các ống eppendorf, đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Hút 0,5 ml phầndịch trong sau khi ly tâm dịch nuôi vi khuẩn cho vào các ống nghiệm đã chứa sẵn 2 ml nước cất khử trùng cộng với 0,5 ml EDTA. Thêm 1 ml dung dịch Phenol nitroprusside và 2 ml dung dịch Sodium hypocloride vào mỗi ống trộn đều dung dịch bằng máy Vortex. Để ổn định ở 30oC khoảng 30 phút. Sau tiến hành so màu ở bước sóng 636 nm (OD636nm). Kết quả đo OD của các chủng vi khuẩn được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đó suy ra được hàm lượng ammonium sinh ra trong dung dịch.
Phương pháp xây dựng đường chuẩn (NH4+
).
Xây dựng đường chuẩn NH4+: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0-1-2-3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng4. Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0; 0,2;0,4; 0,6; 0,8; 1 mg/l NH4+(Cao Ngọc Điệp, 2011).
Bảng 2.2: Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+ Ống nghiệm
Hóa chất 0 1 2 3 4 5
Nước cất (ml) 2,5 2 1,5 1 0,5 0
Dung dich NH4+ chuẩn (1 mg/l) (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Dung dịch EDTA (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Dung dịch Phenol- Sodium nitroprusside (ml) 1 1 1 1 1 1 Dung dịch Sodium hypochloride (ml) 2 2 2 2 2 2
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
- Trộn đều vàđể ổn định ở 30oC khoảng 15-20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra.
- Tiến hành đo hàm lượng đạm tổng hợpNH4+ bằng phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 636 nm (OD636nm).
- Đo giá trị OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm.
- Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD636 nm của mẫu để tính hàm lượng đạm NH4+ tương đương lượng NH4+ có trong mẫu theo công thức: X = (Y– b)/a. x : hàm lượng NH4+ tổng hợp, y : giá trị OD 636nm, a, b giá trị của phương trình đường chuẩn.
2.3.3.2. Xác định khả năngphân giải lân khó tan(Phương pháp Acid ascorbic) (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Nguyên tắc
- Trong môi trường axit, photpho sẽ phản ứng với amonimolipdat với sự có mặt của kali antimonyl tartrat làm xúc tác để hình thành phức dị đa photphomolipdat có màu vàng:
- Phức này bị khử bởi axit ascorbic tạo thành một hợp chất màu xanh:
- Nồng độ của PO43- sẽ được xác định bởi máy so màu quang phổ ở bước sóng 880 nm.Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân có trong dịch huyền phù vi khuẩn, pH và điều kiện khử của môi trường.
Chuẩn bị mẫu
- Các chủng vi khuẩn được nuôi trênmôi trường NBRIP lỏng có bổ sung apatit, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Sau đó lấy mẫu vào các ống eppendorf, đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37
- Xây dựng đường chuẩn PO43- gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0- 1-2-3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng 5. Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0;0,2; 0,4; 0,6;0,8;1mg/lPO43- (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Bảng 2.3: Thành phần của dãy đường chuẩn PO43-
Ống nghiệm
Hóa chất 0 1 2 3 4 5
Nước cất (ml) 5 4.8 4.6 4.4 4.2 4 Dung dich PO43- chuẩn (1mg/l) (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Dung dịch B (ml) 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 Nồng độ PO43- 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Tổng thể tích (ml) 12,5
- Trộn đều và để ổn định khoảng 15-20 phút ở 30oC.
- Tiến hành đo hàm lượng lân PO43- bằng phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 880 nm (OD880nm).
- Đo giá trị OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm.
- Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD880nm của mẫu để tính hàm lượng lân tương đương lượng PO43- có trong mẫu theo công thức : X=(Y– b)/a.x: hàm lượng PO43-phân giải, y: giá trị OD 880nm, a, b giá trị của phương trình đường chuẩn.
- Chú ý: Nếu hàm lượng lân trong mẫu sau khi ly tâm cao hơn so với đường chuẩn lân sẽ tiến hành pha loãng mẫu (2, 5, 10, 20, 50 lần) để hàm lượng lânđo được có giá trị chính xác.
2.3.3.3. Xác định khả năng tổng hợp IAA của vi khuẩn bằng phương pháp Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38
- Các chủng vi khuẩn đã được nuôi trong môi trường King B lỏng và lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày.Sau đó lấy mẫu vào các ống eppendorf, đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Hút 1 ml phần dịch trong sau khi ly tâm vào các ống nghiệm chứa sẵn 2 ml thuốc thử Salkowski, trộn đều bằng máy vortex. Ủ hỗn hợp trên trong tối 10-15 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Tiến hành đo OD ở bước sóng 530 nm (OD530nm). Kết quả đo OD của các chủng vi khuẩn được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn IAA, từ đó suy ra được hàm lượng IAA sinh ra trong dung dịch. Hàm lượng IAA càng cao thì màu hồng sinh ra do phản ứng của IAA với thuốc thử càng đậm.
Phương pháp xây dựng đường chuẩnIAA.
- Xây dựng đường chuẩn IAA: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0- 1-2-3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng 6. Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0, 5, 10, 20, 40, 80 µg/ml IAA.
Bảng 2.4: Thành phần của dãy đường chuẩn IAA Ống nghiệm Hóa chất 0 1 2 3 4 5 Dung dịch đệm (ml) 2 1,9375 1,875 1,75 1,5 1 Dung dịch IAA 160 µg /ml(µl) 0 0,0625 0,125 0,25 0,5 1 Tổng thể tích (ml) 2 Nồng độIAA chuẩn (µg/ml) 0 5 10 20 40 80 Dung dịch thuốc thử Salkowsky (ml) 4 4 4 4 4 4
- Trộn đều và để ổn định ở 30oC, trong tối khoảng 15-20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra.
- Tiến hành đo hàm lượng IAA bằng phương pháp so màu Salkowsky ở bước sóng 530 nm (OD530nm).
- Đo giá trị OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39
- Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD của mẫu tính ra hàm lượng IAA trong các mẫu vi khuẩntheo công thức : X=(Y–b)/a. x : hàm lượng IAA tổng hợp, y: giá trị OD 530 nm, a, b giá trị của phương trình đường chuẩn.
2.3.4.Xác định ảnh hưởng của thời gian và pH đến khả năng cốđịnh đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.3.4.1.Ảnh hưởng của thời gian đến đến khả năng cố định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường Burk không đạm, NBRIP, King B trong 1; 2; 3; 4; 5; 6 ngày ở 30oC, lắc 120 vòng/phút. Sau đó tiến hành kiểm tra các hoạt tính cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.3.4.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến khả năng cố định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường Burk không đạm, NBRIP, King B ở các dải nhiệt độ 25; 32; 37; 45oC, lắc 120 vòng/phút. Sau đó tiến hành kiểm tra các hoạt tính cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.3.4.3. Ảnh hưởng của pH đến đến khả năng cố định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường Burk không đạm, NBRIP, King B ở các pH 5; 6; 7; 8; 9 ở 30oC, lắc 120 vòng/phút. Sau đó tiến hành kiểm tra các hoạt tính cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA của các chủng.
2.3.5.Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của vi khuẩn có khả năng cốđịnh đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA cao.
2.3.5.1.Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấyđến sinh trưởng phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên 3 loại môi trường khác nhau Nfb, King B, Fallik ở 30oC, lắc 120 vòng/ phút. Tiến hành đo OD 660nm sau 48 h nuôi cấy để kiểm tra khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độđến sinh trưởng phát triển của các chủng vi khuẩn.
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường King B ở các nhiệt độ 25; 32; 37; 45oC, lắc 120 vòng/phút. Tiến hành đo OD 660nm sau 48 h nuôi cấyđể kiểm tra khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.3.5.3. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường King B ở 30oC, ở các dải pH 5;6;7;8; 9 Tiến hành đo OD 660nm sau 48hnuôi cấy để kiểm tra khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.3.6.Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng
Chuẩn bị đất: Đất được phơi khô tán nhỏ rồi cho vào các chậu vại với trọng lượng 5kg/ chậu.
Chuẩn bị hạt giống: Chọn hạt giống đều nhau, chắc không nấm bệnh ngâm
trong nước 24h. Rửa lại bằng nước máy. Sau đó khử trùng bằng cồn 70o trong 3 phút, rửa lại bằng nước cất. Sau đó khử trùng bằng Javen trong 3 phút . Sau đó rửa lại bằng nước cất nhiều lần(4- 5 lần). Sau đó ủ trong đĩa petri chứa giấy thấm vô trùng được tẩm ướt bằng nước cất vô trùng. Ủ ở 30oC cho đến khi khi thấy hạt lúa nảy mầm có chiều dài rễ 0,5-1,0 cm để thì bổ sung dịch vi khuẩn có mật độ 107CFU/ml và ủ trong 3h. Sau đó đem đi gieo vào chậu vại. Gieo 5 hạt/ chậu khi cây lúa được 10 ngày thì tỉa bớt để lại 3 cây/ chậu. Mỗi công thức lặp lại 3 lần trên hai giống lúa lai TH 3-3 và Lúa thuần Bắc Thơm 7.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41
Các công thức thí nghiệm
Bảng 2.5: Công thức thí nghiệm
CT Lúa lai TH 3-3 Lúa thuần Bắc Thơm 7 1 Bón 100%(140N + 90P +60K) Bón 100%(100N + 60P +60K)
2 Bón 75%(105N + 67,5P+ 45K) Bón 75% (175N+45P+ 45K)
3 Bón 50%(70N +45P+30K) BÓN 50%(50N +30P+30K)
4 Bón 25%(35N + 22,5P+15K) Bón 25%(25N+15P+15K)
5 Không bón phân Không bón phân
6 Bón 75% (105N + 67,5P+ 45K) + VSV Bón 75% (175N+45P+ 45K)+ VSV
7 Bón 50%(70N +45P+30K)+ VSV Bón 50%(50N +30P+30K)+ VSV
8 Bón 25%(35N+22,5P+15K)+ VSV Bón 25%(25N+15P+15K)+VSV