ứng dụng phương pháp arisa (automated ribosomal intergenic spacer analysis) trong phân tích sự biến động và đa dạng của cộng đồng vi khuẩn sống tự do ở vịnh tachibana theo thời gian

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP ARISA (AUTOMATED RIBOSOMAL INTERGENIC SPACER ANALYSIS) TRONG PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỘNG VÀ ĐA DẠNG CỦA CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN SỐNG TỰ DO Ở VỊNH TACHIBANA THEO THỜI GIAN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG NGUYỄN THI ̣ ĐỖ QUYÊN PGS TS WADA MINORU MSSV: 3092435 LỚP: CNSH TT K35 Cần Thơ, 09/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP ARISA (AUTOMATED RIBOSOMAL INTERGENIC SPACER ANALYSIS) TRONG PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỘNG VÀ ĐA DẠNG CỦA CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN SỐNG TỰ DO Ở VỊNH TACHIBANA THEO THỜI GIAN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG NGUYỄN THI ̣ ĐỖ QUYÊN PGS TS WADA MINORU MSSV: 3092435 LỚP: CNSH TT K35 Cần Thơ, 09/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG Nguyễn Thi ̣Đỗ Quyên DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Luận văn tốt nghiệp đại học cột mốc đánh dấu phát triển mặt kiến thức kỹ sinh viên Để hoàn thành tốt, sinh viên cần phải vận dụng tất kiến thức hiểu biết tích lũy đƣợc suốt q trình học tập Chính vậy, tơi vơ trân trọng kiến thức tiếp thu đƣợc năm học Viện NC PT Công nghệ Sinh học-Trƣờng Đại học Cần Thơ nhƣ năm học tập trƣờng Nagasaki, Nhật Bản Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến với: Cha mẹ, ngƣời dìu dắt định hƣớng tơi đến với đƣờng nghiên cứu khoa học vô bổ ích Thầy, Cơ giảng dạy tạo lập tảng kiến thức vững cho suốt năm đại học Cô Ngô Thị Phƣơng Dung thầy Wada Minoru (Khoa Thủy Sản, Đại học Nagasaki, Nhật Bản) cán hƣớng dẫn thực luận văn Cô thầy không giảng dạy lý thuyết mà truyền vốn kinh nghiệm thực hành vơ q báu cho tơi q trình thực luận văn Thầy Huỳnh Xuân Phong cố vấn học tập lớp quan tâm giúp đỡ tơi q trình học tập Cuối cùng, xin cảm ơn tất bạn làm việc phịng thí nghiệm Thực Phẩm nhƣ bạn làm việc Khoa Thủy Sản, Đại học Nagasaki, Nhật Bản khơng ngại khó khăn ln giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Cần Thơ, ngày 12 tháng 08 năm 2014 Sinh viên thực Nguyễn Thi Đỗ Quyên ̣ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Sự tương tác phức tạp yếu tố không gian thời gian gây tác động mạnh mẽ đến cấu trúc chức quần xã vi khuẩn sống tự môi trường biển Luận văn đề cập trực tiếp đến biến động cộng đồng vi khuẩn sống tự vịnh Tachibana, Nhật Bản cách ứng dụng phương pháp Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA) Các mẫu DNA vi khuẩn thu thập lưu trữ từ mùa xuân đến đầu mùa hè (tháng tư, tháng năm, tháng sáu) khoảng thời gian từ năm 2009 đến năm 2012, sử dụng cho nghiên cứu Trong số yếu tố phân tích tháng, năm độ sâu, năm xem nhân tố quan trọng việc làm biến động quần xã vi khuẩn sống tự (ANOSIM, Global R = 0.422, p = 0,1%) Đặc biệt, tháng năm 2011 (ANOSIM, Global R = 0,969, p = 2,9%) có tác động đáng kể vào thay đổi quần xã vi khuẩn Bên cạnh đó, tùy thuộc vào năm, đoạn ribosomal ITS 234 bp, 235 bp, 215 bp 216 bp chiếm tỷ lệ cao toàn cấu trúc quần xã Trong bốn năm (2009-2012), hai đoạn ribosomal ITS 234 bp (được cho có nguồn gốc từ Pseudomonas) 216 bp (được cho có nguồn gốc từ Actinobacteia) chiếm ưu tần suất xuất tồn cấu trúc quần xã cao Vì thế, hai chi vi khuẩn xem có vai trị quan trọng mơi trường biển Từ khóa: ARISA, Actinobacteia, Pseudomonas, ribosomal ITS Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ i TÓM LƢỢC ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài CHƢƠNG LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU .3 2.1 Biển Ariake vịnh Tachibana .3 2.2 Quần xã vi khuẩn sống tự môi trƣờng biển (Zhang et al., 2007) 2.3 Vùng 16S – 23S rDNA (ribosomal intergenic spacer regions (rITS)) 2.4 Phƣơng pháp rRNA intergenic spacer analysis (RISA) 2.5 Phƣơng pháp Automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA) (Brown et al., 2005) .7 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .9 3.1 Nguyên vật liệu .9 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 11 3.2.1 Quy trình chung 11 3.2.2 ARISA-PCR 11 3.2.3 ARISA sốc nhiệt 12 3.2.4 Phân tích DNA mẫu 12 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT 4.1 Ảnh hƣởng số tháng mùa hè đến biến động quần xã vi khuẩn biển 13 4.2 Ảnh hƣởng năm (2009-2012) đến biến động quần xã vi khuẩn biển 13 4.3 Ảnh hƣởng độ sâu đến biến động quần xã vi khuẩn biển 14 4.4 Ảnh hƣởng nhân tố (tháng độ sâu) năm đến biến động quần xã vi khuẩn biển 15 4.5 Đa dạng chiều dài đoạn rITS biến động số lƣợng mẫu 20 4.6 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm 25 4.7 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm 27 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30 5.1 Kết luận .30 5.2 Đề nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC PL-1 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT DANH MỤC BẢNG Trang Bảng Mẫu nƣớc biển điểm nghiên cứu A6 10 Bảng Các thành phần số lƣợng cho phản ứng PCR 11 Bảng Các thành phần số lƣợng cho phản ứng ARISA sốc nhiệt 12 Bảng Tập hợp đoạn rITS quan trọng mẫu 24 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT DANH MỤC HÌNH Trang Hình Biển Ariake Hình Vịnh Tachibana Hình Nhóm vi khuẩn sống sống tự (trái) nhóm sống cố định (phải) Hình Sự xếp vùng chức rITS Hình Phƣơng pháp Automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA) Hình Quy trình chung 11 Hình Cluster MDS diagrams phần trăm giống 24 mẫu (ANOSIM, Global R=0.085, p=11.4%, Stress = 0.07) 13 Hình Cluster MDS diagrams phần trăm giống 24 mẫu (ANOSIM, Global R=0.422, p=0.1%, Stress = 0.07) 14 Hình Cluster MDS diagrams phần trăm giống 24 mẫu (ANOSIM, Global R= -0.151, p=99.4%, Stress = 0.07) 15 Hình 10 Cluster MDS diagrams phần trăm giống mẫu (ANOSIM, Global R= 0.188, p= 33.3%, stress = 0) 15 Hình 11 Cluster MDS diagrams phần trăm giống mẫu (ANOSIM, Global R= 0, p= 60%, stress = 0) 16 Hình 12 Cluster MDS diagrams phần trăm giống mẫu (ANOSIM, Global R= 1, p= 33.3%, stress = 0) 17 Hình 13 Cluster MDS diagrams phần trăm giống mẫu (ANOSIM, Global R= -0.5, p= 100%, stress = 0) 17 Hình 14 Cluster MDS diagrams phần trăm giống mẫu (ANOSIM, Global R= 0.969, p= 2.9%, stress = 0) 18 Hình 15 Cluster MDS diagrams phần trăm giống mẫu (ANOSIM, Global R= -0.479, p= 90.5%, stress = 0) 18 Hình 16 Cluster MDS diagrams phần trăm giống mẫu (ANOSIM, Global R= -0.009, p= 45.7%, stress = 0) 19 Hình 17 Cluster MDS diagrams phần trăm giống mẫu (ANOSIM, Global R= -0.074, p= 57.1%, stress = 0) 20 Hình 18 Sự đa dạng chiều dài đoạn rITS biến động số lƣợng mẫu năm 2009 20 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT Hình 19 Sự đa dạng chiều dài đoạn rITS biến động số lƣợng mẫu năm 2010 21 Hình 20 Sự đa dạng chiều dài đoạn rITS biến động số lƣợng mẫu năm 2011 22 Hình 21 Sự đa dạng chiều dài đoạn rITS biến động số lƣợng mẫu năm 2012 23 Hình 22 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm 2009 25 Hình 23 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm 2010 26 Hình 24 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm 2011 26 Hình 25 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm 2012 27 Hình 26 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm 28 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT 4.5.4 Năm 2012 Trục ngang (trục x) thể số đoạn mẫu (bp) Trục dọc (trục y) thể tỷ lệ tập trung đoạn (% chiều cao) Hình 21 Sự đa dạng chiều dài đoạn rITS biến động số lƣợng mẫu năm 2012 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT 4.5.5 Tập hợp đoạn rITS quan trọng mẫu Dựa tỷ lệ tập trung mẫu, có đoạn có tỷ lệ % cao nhƣ Bảng Bảng Tập hợp đoạn rITS quan trọng mẫu % % Độ Số Kích Độ Số Kích Năm Tháng phân Năm Tháng phân sâu mẫu thƣớc sâu mẫu thƣớc bố bố 0m 1049 Đáy 1051 2009 0m Chl 205 Đáy 207 0m 203 959 Đáy 961 0m 995 Đáy 997 0m 271 Giữa 273 Giữa 275 Đáy 277 2010 2011 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 216 234 371 216 235 194 216 234 371 216 234 371 140 233 520 216 234 205 216 235 205 216 234 148 227 234 209 215 233 188 215 233 188 215 233 186 215 233 188 23,2 74,4 2,4 24,4 72,0 3,6 42,5 53,8 3,8 32,3 57,5 10,2 31,5 37,7 30,9 27,3 63,5 9,2 32,0 60,1 7,9 26,8 70,2 3,0 55,0 21,5 23,6 31,2 52,7 16,0 41,5 52,4 6,0 35,8 59,7 4,5 41,2 51,0 7,7 24 0m Giữa 307 Giữa 309 Đáy 311 0m 709 Giữa 711 Giữa 2011 305 713 Đáy 715 Giữa 779 Giữa 781 Đáy 783 2012 189 234 779 215 234 485 215 234 778 215 234 778 140 210 214 235 371 187 216 235 305 216 234 305 216 234 278 216 234 278 216 235 278 Viện NC PT Công nghệ Sinh học 26,7 43,4 29,8 24,1 65,7 10,2 28,1 63,2 8,7 27,8 64,1 8,1 33,9 34,5 31,6 75,6 9,1 15,3 24,0 63,7 12,3 37,5 56,3 6,1 37,1 59,4 3,5 30,7 63,5 5,8 32,0 64,5 3,5 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT Trong số đoạn thể bảng 4, đoạn 216 bp đoạn đáng quan tâm với tần suất xuất cao (n=12), tỷ lệ hầu hết trƣờng hợp nhỏ 40 Kế đó, đoạn 234 bp đứng vị trí thứ hai với 11 lần lặp lại tỷ lệ phần trăm cao (gần nhƣ nửa) Vị trí thứ ba gồm đoạn 215, 235 233 bp Trong đó, đoạn 215 bp đƣợc thể với lần lặp lại tỷ lệ khoảng 20% đến 50% Tƣơng tự, đoạn 235 bp 233 bp xuất lần (n=5), nhƣng tỷ lệ chúng hầu hết lớn 50% Cuối cùng, đoạn cịn lại khơng đáng kể, chúng có tần suất xuất nhƣ tỷ lệ tập trung thấp 4.6 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm 4.6.1 Năm 2009 Tỷ lệ tập trung đoạn quan trọng tăng dần từ 1% đến 37% (Hình 22) Có thể thấy rõ đoạn 234 bp có tỷ lệ tập trung cao nhất, trái lại đoạn 194 bp đoạn có tỷ lệ thấp đoạn Một đoạn khác quan trọng 216 bp tỷ lệ tập trung cao thứ hai nhóm Với tỷ lệ thấp từ đến 6, đoạn 194 bp, 371 bp, 520 bp 140 bp không đáng kể so sánh với đoạn khác Vì vậy, phần tiếp theo, đoạn có tỷ lệ cao đƣợc tập trung nhiều miêu tả chi tiết % Avarage contribution Fragments of samples (bp) Hình 22 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm 2009 4.6.2 Năm 2010 Biểu đồ 23 phản ánh tăng ổn định đoạn năm 2010 Đầu tiên, đoạn 235 có tỷ lệ tập trung thấp nhất, trái lại với 216 bp đạt tỷ lệ cao Bên cạnh đó, thấy rõ tỷ lệ đoạn 227 bp, 205 bp, 234 bp 216 bp nhau, tƣơng ứng 18%, 18%, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT 20% 20% Nói cách khác, điều tạo khác biệt lớn với đoạn lại Vì vậy, đoạn đáng ý đƣợc xem xét nhiều phần Hình 23 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm 2010 4.6.3 Năm 2011 Nhƣ đƣợc thể hình 24, có đoạn với tỷ lệ tập trung tăng ổn định Tỷ lệ đoạn 215 bp xấp xỉ ¼, xếp hạng cao năm Trong đó, đoạn 779 bp 485 bp xếp hạng thấp với tỷ lệ nhỏ 1%, đƣợc xem đoạn quan trọng đoạn Bởi số liệu lớn (hơn 1/10) nên đoạn 778 bp, 188 bp, 233 bp, 234 bp 215 bp đƣợc thảo luận nhiều phần % Avarage contribution 50% 40% 30% 26% 21% 16% 20% 14% 10% 11% 7% 4% 1% 1% 0% 215 bp 234 bp 233 bp 188 bp 778 bp 189 bp 186 bp 485 bp 779 bp Fragments of samples (bp) Hình 24 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm 2011 4.6.4 Năm 2012 Dựa hình 25, từ đoạn 371 bp đến 216 bp, có tăng tỷ lệ tập trung từ 0% đến 18% Rất rõ ràng đoạn 216 bp thể tỷ lệ cao (18%) 371 bp có tỷ lệ thấp (thấp 1%) Ngồi ra, đoạn 210 bp, 140 bp 187 bp đƣợc xem xét có tỷ lệ (5%) Tƣơng tự, đoạn 305 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT bp, 235 bp, 278 bp 234 bp có tỷ lệ tập trung 14% (ít ⅕) Cuối cùng, cần tập trung nhiều vào đoạn quan trọng với tỷ lệ nhiều 1/10 phần % Avarage contribution 50% 40% 30% 20% 18% 14% 14% 14% 14% 11% 10% 5% 5% 5% 187 bp 140 bp 210 bp 0% 0% 216 bp 234 bp 235 bp 278 bp 305 bp 214 bp 371 bp Fragments of samples (bp) Hình 25 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm 2012 4.7 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm Những đoạn ITS đáng kể bao gồm 233 bp, 234 bp 235 bp Từ nghiên cứu trƣớc, đoạn số chúng đƣợc xem nhƣ đoạn chênh lệch thống kê chúng khơng đáng kể Bên cạnh đó, để đơn giản hóa vấn đề thống kê, 234 bp đƣợc chọn nhƣ đại diện đoạn độc lập; sau đó, tỷ lệ tập trung 234 bp kết hợp tỷ lệ chúng Tƣơng tự, 216 bp trở thành đại diện cho đoạn ITS 214 bp, 215 bp 216 bp Hơn nữa, 778 bp 779 bp, 778 bp đƣợc chấp nhận; bên cạnh đó, cặp 186 bp - 187 bp 188 bp - 189 bp, số chẵn đƣợc chọn, tƣơng ứng 186 bp 188 bp Cuối cùng, dựa điều trên, thay đổi đoạn quan trọng năm đƣợc thể đồ thị bên dƣới Bất kể đoạn không quan trọng với tỷ lệ tập trung thấp, chắn 234 bp 216 bp đoạn ITS đoạn quan trọng với tỷ lệ tập trung cao năm (2009-2012) Đoạn 234 bp dao động 25% 58% năm, trƣớc kết thúc 28% vào 2012 Trái lại, tỷ lệ tập trung đoạn 216 bp có xu hƣớng không thay đổi so với đoạn 234 bp Ví dụ: năm đầu (2009-2010), tỷ lệ tập trung khơng có thay đổi; sau đó, tăng chậm đạt cao với 28% Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT % phân bổ trung bình Năm nghiên cứu Hình 26 Những thay đổi đoạn rITS quan trọng năm Dựa nghiên cứu Ohta (2013), đoạn ITS 234 bp đƣợc cho thuộc Pseudomonas, chi vi khuẩn gamma-proteobacteria, Gram âm, hiếu khí, đóng vai trị to lớn xử lý sinh học, loại bỏ chất gây nhiễm đất nƣớc Ví dụ: Pseudomonas putida có khả phân hủy toluene, xylene benzene, chúng thành phần độc hại dầu bị rò rỉ biển từ cố tràn dầu Bên cạnh đó, dầu thơ đƣợc Chun ngành Cơng nghệ Sinh học 28 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT Pseudomonas putida dùng nhƣ nguồn carbon hữu cơ, dẫn đến phá hủy thành phần dầu thô thành hợp chất có khối lƣợng phân tử thấp (Zhang 2005) Kế tiếp, Pseudomonas frederiks bergensis thể khả đáng kể việc phân hủy thuốc trừ sâu chọn lọc (Hussaini et al.2003) Ngoài ra, Pseudomonas sp.khác đƣợc cân nhắc nhƣ vi khuẩn phân hủy polythene plastic tiềm Những hợp chất polymer chất thải rắn khơng có khả phân hủy thƣờng đƣợc tìm thấy mà gần đƣợc công nhận đe dọa cho sinh vật biển Các polymer gây tắc nghẽn ruột loài cá, chim thú có vú biển (Spear et al., 1995; Secchi Zarzur, 1999) Sự phân hủy chúng thực thách thức lớn loại vật liệu đƣợc sử dụng ngày nhiều Trong số vi khuẩn, Pseudomonas sp có ích việc phân hủy 20.54% polyethene 8.16% nhựa thời gian tháng (Kathiresan K., 2003) Vì lý này, Pseudomonas, với tỷ lệ tần suất diện cao quần xã vi khuẩn, có tiềm đáng kể việc kiểm sốt nhiễm vịnh Bên cạnh đó, nhƣ đƣợc thể hình 27, thay đổi đáng ngạc nhiên đa dạng quần xã vi khuẩn thời gian qua mức độ ô nhiễm biển thay đổi từ năm qua năm khác vịnh Tachibana Mặt khác, đoạn ITS 216 bp đƣợc cho Actinobacteria, nhóm vi khuẩn gram âm, hiếu khí sống cố định Những vi sinh vật đa dạng kiểu hình đƣợc tìm thấy hầu hết mơi trƣờng tự nhiên, đặc biệt nƣớc Ngoài ra, theo liệu khí hậu gần đây, có nhiều mƣa vào mùa hè (tháng 4, 6), làm tăng lƣợng nƣớc từ sông đổ biển Vì vậy, nói phong phú đoạn ITS pha trộn nhiều nƣớc sông vào nƣớc biển mùa hè Theo Kim S.K (2013), Actinobacteria có vai trị quan trọng mơi trƣờng biển, đặc biệt với expressive microbial abundance Ví dụ: phân hủy biến đổi vật liệu khác trình liên tục đƣợc điều hịa hoạt động nhiều lồi vi sinh vật Có thể thấy tăng giảm vi sinh vật riêng biệt sản sinh enzyme cho thấy nồng độ chất tự nhiên điều kiện mơi trƣờng Actinobacteria cịn đƣợc cho có đóng góp vào phân cắt tái sinh hợp chất hữu môi trƣờng biển Cuối nhƣng không phần quan trọng, không giống nhƣ trƣờng hợp Pseudomonas, tỷ lệ tập trung Actinobacteria gần nhƣ không đổi theo thời gian Điều lƣợng chất dinh dƣỡng điều kiện môi trƣờng vịnh Tachibana, thứ phù hợp cho sinh trƣởng phát triển Actinobacteria, thay đổi không đáng kể từ 2009 đến 2012 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trong nhân tố nhƣ tháng, năm độ sâu, thấy rõ năm nhân tố quan trọng nhất, tạo tập trung đáng kể đến tính biến động quần xã vi khuẩn biển Dựa dự liệu thống kê, hầu hết trƣờng hợp, tháng mùa hè độ sâu có ảnh hƣởng khơng đáng kể đến biến động quần xã vi khuẩn vịnh Tachibana năm khác Trong năm 2009, đoạn 234 bp thể tỷ lệ tập trung cao nhất, đoạn 194 bp có tỷ lệ thấp đoạn Tiếp theo, vào năm 2010, đoạn 235 bp có tỷ lệ thấp nhất, trái ngƣợc với đoạn 216 bp, đạt tỷ lệ cao Sau đó, tỷ lệ đoạn 215 bp xếp hạng cao vào năm 2011, nhiên đoạn 779 bp 485 bp vị trí thấp nhất, với tỷ lệ nhỏ đoạn quan trọng đoạn Vào năm 2012, đoạn 216 bp có tỷ lệ cao nhất, tỷ lệ thấp thuộc đoạn 317 bp Trong suốt năm từ 2009 đến 2012, đoạn 234 bp (Pseudomonas) 216 bp (Actinobacteria) đoạn ITS đƣợc xem đoạn quan trọng Nói cách khác, Pseudomonas Actinobacteria chiếm tỷ lệ tần suất xuất cao quần xã vi khuẩn vịnh Tachibana, đặc biệt vào thời gian mùa hè lồi đƣợc xem có vai trị quan trọng mơi trƣờng biển 5.2 Đề nghị - Khi làm việc PCR, tất mẫu năm nên đƣợc chuẩn bị tiến hành lúc - Việc tiến hành lại thí nghiệm nhiều lần cần thiết để có đƣợc kết ổn định Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh Avaniss-Aghajani, E., Jones, K., Chapman, D & Brunk, C 1994 A molecular technique for identification of bacteria using small subunit ribosomal RNA sequences BioTeachniques, 17 144-149 Brown M.V., Schwalbach M.S., Hewson I., and Fuhrman J.A 2005 Coupling 16SITS rDNA clone libraries and automated ribosomal intergenic spacer analysis to show marine microbial diversity: development and application to a time series Environmental Microbiology, 7: 1466–1479 Fisher M.M., and Triplett E.W 1991 Automated approach for ribosomal intergenic spacer analysis of microbial diversity and its application to freshwater bacterial communities Environmental Microbiology, 65: 4630–4636 Fisher M M and E W Triplett 1999 Automated Approach for Ribosomal Intergenic Spacer Analysis of Microbial Diversity and Its Application to Freshwater Bacterial Communities Appl Environ Microbiol, 65(10): 4630– 4636 Fuhrman J A., I Hewson, M S Schwalbach, J A Steele, M V Brown, and S Naeem 2006 Annually reoccurring bacterial communities are predictable from ocean conditions PNAS, Proceedings of the National Academy of Sciences, vol 103 no 35 13104–13109 Matsuno T., Shigeoka M., Tamaki A., Nagata T., and Nishimura K 1999 Distributions of water masses and currents in Tachibana Bay, west of Ari-ake Sound, Kyushu, Japan Journal of oceanography, 55: 515-529 Muyzer G., E C de Waal and A G Uitterlinden 1993 Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA Appl Environ Microbiol., 59(3):695 Gürtler V and Stanisich V 1996 New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region Microbiology, 142 3-16 Kathiresan K 2003 How mangrove forests induce sedimentation Rev Biol Trop, 51(29):355-360 Pérez Luz S., F Rodríguez-Valera, R Lan, and P R Reeves 1998 Variation of the Ribosomal Operon 16S-23S Gene Spacer Region in Representatives of Salmonella enterica Subspecies Journal of bacteria, 180(8): 2144–2151 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 31 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT Zhang R., Liu B., Lau S., Ki J., and Qian P Y 2007 Par ticle - attach e d and f re e living bacterial community es in a contrasting marine environment: Victoria Harbor, Hong Kong Federation of European Microbiological Societies Wada M., Suzuki S., Nara T., Umezawa Y., Shimanaga M., Matsuoka K., Nakata H 2012 Microbial community respiration and structure of dead zone sediments of Omura Bay, Japan Journal of oceanography, 68:857–867 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 32 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT PHỤ LỤC 4.1 Ảnh hƣởng số tháng mùa hè đến biến động quần xã vi khuẩn biển Chuyên ngành Công nghệ Sinh học PL-1 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT 4.2 Ảnh hƣởng năm (2009-2012) đến biến động quần xã vi khuẩn biển Chuyên ngành Công nghệ Sinh học PL-2 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT 4.3 Ảnh hƣởng độ sâu đến biến động quần xã vi khuẩn biển Chuyên ngành Công nghệ Sinh học PL-3 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT Thống kê MDS Chuyên ngành Công nghệ Sinh học PL-4 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT CLUSTER Hierarchical Cluster analysis Chuyên ngành Công nghệ Sinh học PL-5 Viện NC PT Công nghệ Sinh học ... (AUTOMATED RIBOSOMAL INTERGENIC SPACER ANALYSIS) TRONG PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỘNG VÀ ĐA DẠNG CỦA CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN SỐNG TỰ DO Ở VỊNH TACHIBANA THEO THỜI GIAN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VI? ?N THỰC HIỆN PGS.TS NGÔ... yếu tố không gian thời gian gây tác động mạnh mẽ đến cấu trúc chức quần xã vi khuẩn sống tự môi trường biển Luận văn đề cập trực tiếp đến biến động cộng đồng vi khuẩn sống tự vịnh Tachibana, Nhật... học Vi? ??n NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT 1.2 Mục tiêu đề tài Bằng kỹ thuật ARISA, phân tích biến động đa dạng cộng đồng vi khuẩn sống tự vịnh Tachibana