Ảnh hưởng của kinetin và sự kết hợp giữa kinetin và 2,4d đến quá trình hình thành protocorm like bodies ở cây lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume)

ẢNH HƯỞNG CỦA KINETIN VÀ SỰ KẾT HỢP GIỮA KINETIN VÀ 2, 4-D ĐẾN QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH PROTOCORM-LIKE BODIES Ở CÂY LAN KIM TUYẾN Anoectochilus setaceus Blume Trần Thị Hồng Thúy 1 , La Việ

ẢNH HƯỞNG CỦA KINETIN VÀ SỰ KẾT HỢP GIỮA KINETIN

VÀ 2, 4-D ĐẾN QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH PROTOCORM-LIKE

BODIES Ở CÂY LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume)

Trần Thị Hồng Thúy 1 , La Việt Hồng 2 , Phạm Bích Ngọc 3 , Chu Hoàng Hà 4

Tóm tắt: Cây lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thuộc họ phong lan

(Orchidaceae), Chi Anoectochilus, loài Anoectochilus setaceus, là một trong những loài dược

liệu quý ở Việt Nam Sự hình thành protocorm-like bodies (PLBs) đóng một vai trò quan trọng trong quá trình vi nhân giống cây hoa lan Trong nghiên cứu này, chồi của cây lan kim tuyến được sử dụng làm nguyên liệu ban đầu để cảm ứng hình thành PLBs trong môi trường Knudson C lỏng chứa 100 ml.L-1

nước dừa và bổ sung kinetin hoặc sự kết hợp giữa kinetin với 2, 4-D Kết quả cho thấy PLBs được hình thành tốt nhất trên môi trường Knudson C lỏng chứa 1% saccarozơ, 100 ml.L-1

nước dừa và 0,5 mg.L-1 kinetin, tỉ lệ hình thành PLBs đạt 86,25%, PLBs sinh trưởng tốt Trong khi đó, sự kết hợp giữa 2, 4-D ở nồng độ 0,5 mg.L-1 với một số nồng độ của kinetin (0,5; 1,0; 1,5 mg.L-1) không có tác dụng lớn trong việc cảm ứng hình thành PLBs ở cây lan kim tuyến Đây là lần đầu tiên ở Việt Nam có công trình nghiên cứu cảm ứng hình thành PLBs từ chồi của cây lan kim tuyến Kết quả này mở ra triển

vọng phát triển vi nhân giống cây lan kim tuyến thông qua cảm ứng hình thành PLBs

Từ khóa: protocorm-like bodies, in vitro, kinetin, lan kim tuyến, vi nhân giống

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume hay Anoectochilus roxburghii Wall Ex Lindl) thuộc họ Phong lan (Orchidaceae), là một loài thảo dược quý có giá trị thương mại rất

cao [1] Ở nước ta, cây lan kim tuyến mọc rải rác ở trên các núi đá vôi có độ cao từ 300 -

1000 m như Sa Pa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), Tảo Đảo (Vĩnh Phúc), Mỹ Đức (Hà Tây)… Lan kim tuyến được cấp báo thuộc nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại[2] và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a, c, d, trong sách đỏ Việt Nam [1] Để bảo tồn và phát triển được nguồn giống lan kim tuyến, việc ứng dụng kĩ thuật vi nhân giống là một giải pháp hữu ích Trong quá trình nhân giống cây hoa lan, tạo protocorm-like bodies (PLBs) là một kĩ thuật quan trọng [5] PLBs lần đầu tiên được Morel (1960) quan sát thấy trong quá trình nuôi cấy đỉnh chồi của cây hoàng lan

(Cymbidium) [16] Theo Arditti và Ernst (1993), mẫu cấy như mô hoặc callus của cây hoa lan hình thành cấu trúc tương tự như protocorm in vitro, do đó các thể cấu trúc này được gọi là protocorm-like bodies (PLBs) [5] Theo Ishiiet al (1998) [13], Huan et al (2004) [11] về hình

1

Học viên Cao học, K16, Trường ĐHSP Hà Nội 2

2

Th, Trường ĐHSP Hà Nội 2

3

TS, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

4

PGS.TS, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

thái học PLBs là phôi sôma hay quá trình phát sinh phôi sôma ở giai đoạn sớm chính là bước đầu tiên trong quá trình hình thành PLBs [23] PLBs có thể được cảm ứng trực tiếp từ nhiều loại nguyên liệu mẫu khác nhau như chồi [20], cành hoa (phát hoa) [12], đầu rễ [19] và mảnh

lá [18] PLBs cũng có thể được hình thành gián tiếp trong quá trình nuôi cấy phôi callus trên môi trường đặc [13], [21] và nuôi cấy huyền phù [22] Mặc dù về hình thái học cũng như các khía cạnh phát triển của PLBs đã được sáng tỏ, tuy nhiên các nghiên cứu chi tiết về sự phát

sinh cá thể của PLBs vẫn chưa được đề cập nhiều Ở chi Phalaenopsis, sau khi cấy chuyển

huyền phù tế bào lên môi trường đặc, Tokuhara và Mii (2003) [22] đã chứng minh được rằng

PLBs có nguồn gốc từ tế bào đơn Một nghiên cứu khác cho kết quả tương tự ở chi Oncidium

(Jheng et al 2006) [14] PLBs cũng có thể được hình thành trực tiếp từ bề mặt của mẫu thông qua sự biệt hóa của các tế bào biểu bì [6] và trong trường hợp này, PLBs cũng bắt nguồn từ tế bào đơn Theo tác giả Park và CS (2002, 2003) [17], [18] các tế bào nội bì có thể tăng trưởng tạo thành PLBs Từ nguồn gốc phát sinh PLBs, cho thấy số lượng PLBs được tạo ra trong quá

trình nuôi cấy in vitro là rất lớn, đây là nguyên liệu dồi dào cho quá trình tái sinh cây lan in vitro

Hiện nay ở Việt Nam, chưa có công bố về quá trình cảm ứng hình thành PLBs ở cây lan kim tuyến Xuất phát từ lí do này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự phát sinh trực tiếp PLBs

từ chồi in vitro cây lan kim tuyến

2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Cây lan kim tuyến in vitro 30 ngày tuổi do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công

nghệ Sinh học cung cấp Môi trường nuôi cấy Knudson C, kinetin, 2, D (2, 4-Dichlorophenoxy acetic acid)

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

Bố trí thí nghiệm

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành hai thí nghiệm để xác định ảnh hưởng của kinetin và sự kết hợp kinetin với 2, 4-D đến quá trình hình thành protocorm-like bodies Thí nghiệm 1: xác định ảnh hưởng của kinetin bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1 nước dừa + saccarozơ 1% Thí nghiệm 1 bố trí với 4 công thức

Công thức 1: 0,5 mg.L-1 kinetin bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1

nước dừa + 1% sacarozơ

Công thức 2: 1,0 mg.L-1 kinetin bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1

nước dừa + 1% sacarozơ

Công thức 3: 1,5 mg.L-1 kinetin bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1

nước dừa + 1% sacarozơ

Công thức ĐC: Môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1

nước dừa + 1% sacarozơ

Thí nghiệm 2: Xác định ảnh hưởng của kinetin kết hợp với 2, 4-D bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 1% sacarozơ + 100 ml.L-1

nước dừa Thí nghiệm 2 bố trí với 3 công thức

Công thức 1: 1,5 mg.L-1

kinetin + 0,5 mg.L-1 2, 4-D bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1

nước dừa + 1% sacarozơ

Công thức 2: 1,0 mg.L-1

kinetin + 0,5 mg.L-1 2, 4-D bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1

nước dừa + 1% sacarozơ

Công thức 3: 0,5 mg.L-1

kinetin + 0,5 mg.L-1 2, 4-D bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1

nước dừa + 1% sacarozơ

Các thí nghiệm sử dụng chồi của lan kim tuyến in vitro 30 ngày tuổi đã loại bỏ mô phân

sinh đỉnh được sử dụng làm nguyên liệu để cảm ứng tạo PLBs Các bình được nuôi cấy trong môi trường Knudson C lỏng và lắc trên máy (80 vòng/phút) Điều kiện nuôi: nhiệt độ 220

C, ánh sáng đèn huỳnh quang với chu kì sáng 16 giờ sáng/8 giờ tối

Phương pháp xác định chỉ tiêu nghiên cứu

Các chỉ tiêu theo d i: thời điểm cảm ứng tạo PLBs; tỉ lệ hình thành PLBs được tính bằng

tỉ số giữa số mẫu hình thành PLBs trên tổng số mẫu nuôi cấy; khối lượng tươi cụm PLBs hình thành; hình thái, màu sắc PLBs trong 30 ngày nuôi cấy

2.2 Kết quả và thảo luận

2.2.1 Ảnh hưởng của kinetin đến sự hình thành protocorm-like bodies từ chồi của lan kim tuyến

Protocorm-like bodies ở cây hoa lan được cảm ứng hình thành từ nhiều nguồn vật liệu ban đầu khác nhau, phụ thuộc vào từng loài, nguồn mẫu và chất điều hòa được sử dụng Theo nhiều nghiên cứu như Chen J.T và Chang W.C (2001, 2003) [7], [8], Gow W.P và CS (2008, 2009) [9], [10] cho rằng đa số các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có tác dụng cảm ứng hình thành protocorm-like bodies Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kinetin, một chất điều hòa sinh trưởng có hoạt tính mạnh thuộc nhóm cytokinin để nghiên cứu cảm ứng hình thành protocorm-like bodies từ chồi của cây lan kim tuyến Kết quả được thể hiện ở bảng 1 và hình 1

Bảng 1: Ảnh hưởng của kinetin đến sự hình thành protocorm-like bodies từ chồi của lan

kim tuyến

Công

thức

Thời điểm hình thành PLBs (ngày)

Tỉ lệ (%) hình thành PLBs

Khối lượng tươi của cụm PLBs (g/cụm)

ình th i màu s c cụm

PLBs

CT 1

Cụm PLB s khỏe, nhiều PLB s nhỏ/cụm PLB s , màu trắng xanh

màu trắng xanh

nhỏ, màu thâm nâu

Phân tích kết quả bảng 1 cho thấy kinetin có ảnh hưởng tới sự hình thành PLBs từ chồi của cây lan kim tuyến Ở công thức đối chứng, sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường Knudson C có bổ sung saccarozơ, nước dừa, không thấy hình thành PLBs, thay vào đó là tạo

từ 1 - 2 chồi mới (hình 1A) Trong khi nồng độ kinetin bổ sung vào môi trường làm xuất hiện PLBs Ở CT 3 với nồng độ kinetin là 1,5mg.L-1, thời gian cảm ứng hình thành PLBs là 10 ngày, sớm hơn so với CT 1 (0,5 mg.L-1) và CT 2 (1,0 mg.L-1) là 12 ngày Tuy nhiên, sau 30 ngày nuôi cấy, kinetin ảnh hưởng tốt nhất ở CT 1 (bổ sung kinetin 0,5mg.L-1) với tỉ lệ hình thành PLBs là 86,25%, khối lượng cụm PLBs là 0,23 g/cụm PLBs, từ chồi xuất hiện nhiều PLBs, cụm PLBs khỏe Ở CT 2 (bổ sung kinetin 1,0 mg.L-1), có tỉ lệ hình thành PLBs khá cao (83,20%), nhưng khối lượng của cụm PLBs giảm xuống thấp nhất trong các công thức nghiên cứu chỉ đạt 0,18 g/cụm PLBs, số PLBs hình thành không nhiều, còn ở CT 3, khi nồng

độ kinetin bổ sung là 1,5 mg.L-1, làm giảm tỉ lệ hình thành PLBs chỉ đạt 48,34%, cụm PLB

bị teo nhỏ, hóa nâu Như vậy, CT 1 là tốt nhất cho việc cảm ứng hình thành và phát triển của cụm PLBs, trong khi đó ở CT 3 cókinetin nồng độ cao 1,5 mg.L-1chỉ thích hợp cho cảm ứng ban đầu để hình thành sớm PLBs, không phù hợp với việc nhân nuôi PLBs Quá trình hình thành PLBs ở CT 1 (có bổ sung kinetin với nồng độ 0,5 mg.L-1) có thể được tóm tắt theo sơ

đồ hình 1B, C, D, E, F, G, H

Hình 1: Quá trình hình thành protocorm-like bodies của cây lan kim tuyến từ chồi trên môi trường bổ sung kinetin 0,5 mg.L -1 A: mẫu chồi, B, C, D, E, F, G, H: hình thành cụm

PLBs trong 30 ngày, Thanh kẻ ngang màu trắng: tương ứng 1 mm

2.2.2 Ảnh hưởng của 2, 4-D kết hợp kinetin đến sự hình thành protocorm-like bodies từ chồi của lan kim tuyến

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin và sự phối hợp giữa kinetin và 2, 4-D để cảm ứng tạo PLBs từ chồi lan kim tuyến, kết quả được thể hiện ở bảng 2

và hình 2

Bảng 2: Ảnh hưởng của kinetin kết hợp 2, 4-D đến sự hình thành protocorm-like bodies từ

chồi của lan kim tuyến

Công

thức

Thời điểm hình thành PLBs (ngày)

Tỉ lệ (%) hình thành PLBs

Khối lượng tươi của cụm PLBs (g/cụm)

ình th i màu s c cụm

PLBs

trắng

trắng

trắng

Phân tích kết quả bảng 2 cho thấy, việc nuôi cấy bổ sung đồng thời 2 loại chất điều hòa sinh trưởng (0,5 mg.L-1

2, 4-D và kinetin ở các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5 mg/L) sau 7 ngày mẫu cấy bắt đầu cảm ứng hình thành PLBs Tỉ lệ hình thành PLBs cao nhất ở CT 3 (84,25%), thấp nhất ở CT 1 (73,20%) Tuy nhiên, cụm PLBs sau 30 ngày ở cả 3 công thức có màu trắng sáng, phồng to, các PLBs có xu hướng kết dính với nhau và gần như không sinh trưởng thêm (hình 2A, B, C) Kết quả này cho thấy việc sử dụng kết hợp một auxin ngoại sinh là 2, 4-D ở nồng độ 0,5 mg.L-1

với một cytokinin ngoại sinh là kinetin không đem lại hiệu quả cảm ứng hình thành protocorm-like bodies mong muốn Kết quả này cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu khác cho rằng auxin ngoại sinh (2, 4-D, NAA, IAA và IBA) ức chế cảm

ứng hình thành PLBs trên một số đối tượng thuộc chi Onchidium [7], [15]

Hình 2: Protocorm-like bodies của cây lan kim tuyếntừ chồi trên môi trường

bổ sung kinetin kết hợp 2, 4-D sau 30 ngày nuôi cấy

3 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Khi sử dụng chồi của cây lan kim tuyến in vitro 30 ngày tuổi làm nguồn vật liệu khởi đầu

cho cảm ứng hình thành protocorm-like bodies Môi trường trường thích hợp nhất để cảm ứng hình thành PLBs là Knudson C + kinetin 0,5 mg.L-l + saccarozơ 1% + nước dừa 100 ml.L-1 Tỉ lệ cảm ứng hình thành PLBs đạt 86, 25%, khối lượng trung bình của cụm PLBs sau

30 ngày nuôi cấy là 0,23 gam/cụm Sự kết hợp giữa kinetin ở các nồng độ 0,5; 1,0, 1,5 mg.L-1

với 2, 4-D 0,5 mg.L-1

không có hiệu quả đối với quá trình cảm ứng tạo protocorm-like bodies

từ chồi ở cây lan kim tuyến

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Nguyễn Tiến Bân (chủ biên), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Tập III, Nxb Nông

nghiệp, H, 2005

2 Bộ Khoa học & Công nghệ, Sách đỏ Việt Nam (Phần II Thực vật - 320 tr), Nxb Khoa

học Tự nhiên và Công nghệ, H., 2007

3 Chính phủ nước CHXHCN Việt Nam, Nghị định số 32/2006/NĐ-CP, 2006

4 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, Công nghệ sinh học, Tập 2, Nxb Giáo

dục, H., 2010

5 Arditti J, Ernst R., Micropropagation of orchids, John Wiley, New York, USA 1993

6 Chen J T, Chang C, Chang W C., Direct somatic embryogenesis on leaf explants of Oncidium ‘Gower Ramsey’ and subsequent plant regeneration, Plant Cell Reports,

19:pp.143-149, 1999

7 Chen J T, Chang W C., Effects of auxins and cytokinins on direct somatic embryogenesis on leaf explants of Oncidium ‘Gower Ramsey’, Plant Growth Regul, 34:

pp.229-232, 2001

8 Chen J T, Chang W.C., Effect ofGA3, ancymidol, cycocel and paclobutrazol on direct somatic embryogenesis of Oncidium in vitro, Plant Cell Tissue Org Cult 72,

pp.105-108, 2003

9 Gow W P, Chen J T, Chang W C., Influence of growth regulators on direct embryo formation from leaf explants of Phalaenopsis orchids, Acta Physiol Plant,

30:pp.507-512 2008

10 Gow W P, Chen J T, Chang W C., Effects ofgenotype, light regime, explant position and orientation on direct somatic embryogenesis from leafexplants of Phalaenopsis orchids, Acta Physiol Plant, 31:pp.363-369 2009

11 Huan L V T, Takamura T, Tanaka M., Callus formation and plant regeneration from callus through somatic embryo structures in Cymbidium orchid, Plant Science,

166:pp.1443-1449, 2004

12 Ichihashi S., Micropropagation of Phalaenopsis through the culture of lateral buds from young flower stalks, Lindleyana, 7:pp.208-215, 1992

13 Ihhii Y, Takamura T, Goi M, Tanaka M., Callus induction and somatic embryogenesis of Phalaenopsis, Plant Cell Reports, 17:pp.446-450, 1998

14 Jheng F Y, Do Y Y, Liauh Y.W, Chung J P, Huang P L., Enhancement of growth and regeneration efficiency from embryogenic callus cultures of Oncidium ‘Gower Ramsey’ by adjusting carbohydrate sources, Plant Science, 170:pp.1133-1140 2006

15 Mayer J L S, Stancato G C, Appezzato-Da-Glória B., Direct regeneration of protocorm-like bodies (PLBs) from leaf apices of Oncidium flexuosum Sims (Orchidaceae), Plant Cell Tiss Organ Cult, 103(3):pp.411-416, 2010

16 Mprel G M., Producing virus-free cymbidiums, American Orchid Society Bulletin 29:

pp.495-497, 1960

17 Park S Y, Murthy R H, Paek K Y., Protocorm-like body induction and subsequent plant regeneration from root tip cultures of Doritaenopsis, Plant Science,

164:pp.919-923, 2003

18 Park S Y, Yeung E C, Chakrabarty D, Paek K Y., An efficient direct induction of protocorm-like bodies from leaf subepidermal cells of Doritaenopsis hybrid using thin section culture, Plant Cell Reports, 21:pp.46-51, 2002

19 Tanaka M, Senda Y, Hasegawa A., Plantlet formation by root-tip culture in Phalaenopsis, American Orchid Society Bulletin, 46:pp.1022-1024, 1976

20 Tokuhara K, Mii M., Micropropagation of Phalaenopsis and Doritaenopsis by shoot tips of flower stalk buds, Plant Cell Reports, 13:pp.7-11, 1993

21 Tokuhara K, Mii M., Induction of embryogenic callus and cell suspension culture from shoot tips excised from flower stalk buds in Phalaenopsis (Orchidaceae), In Vitro

Cellular & Developmental Biology Plant, 37: pp.457-461, 2001

22 Tokuhara K, Mii M., Highly efficient somatic embryogenesis from cell suspension cultures of Phalaenopsis orchids by adjusting carbohydrate sources, In Vitro Cellular &

Developmental Biology Plant, 39:pp.635-639, 2003

23 Zhao P, Wu F, Feng FS, Wang W.J., Protocorm-like body (PLB) formation and plant regeneration from the callus culture of Dendrodbium candidum Wall ex Lindl, In Vitro

Cellular & Developmental Biology Plant, 44:pp.178-185, 2008

EFFECT OF KINETIN AND KINETIN COMBINED 2, 4-D ON PROTOCORM-LIKE

BODIES FORMATION OF Anoectochilus setaceus Blume Tran Thi Hong Thuy, La Viet Hong, Pham Bich Ngoc, Chu Hoang Ha

Abstract

Anoectochilus setaceus Blume belongs to Ochid genus and is one of rare medicinal plants in Vietnam The generation of protocorm-like bodies (PLBs) plays an important role in micropropagating orchid process In this study, shoots of Anoectochilus setaceus Blume were used explants to induced PLBs formation on liquid Knudson C media which was added 100 ml.L -1 coconut water and kinetin or kinetin combinated 2, 4-D The results shown that PLBs were the highest induced in liquid cultured Knudson C contains 100 ml.L -1 coconut water, 1% saccharose and 0,5 mg.L -1- kinetin, frequency of explants regenerated PLBs was 86.25%, PLBs were strongly growth The combination of 0.5 mg.l -1 2, 4-D with some different concentrations of kinetin has not affected PLBs formation of Anoectochilus setaceus Blume This is the first report on inducing PLBs from shoots of Anoectochilus setaceus Blume Th ese results provides great potential for research and production of Anoectochilus setaceus Blume

in industrial scale via PLBs formation

Keywords: Anoectochilus setaceus Blume, protocorm-like bodies, in vitro, kinetin,

micropropagation