Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó

Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó Xây dựng phương pháp định lượng propranolon trong huyết tương chó

BỌ Y T E TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI = s o C ữ e # LÊ THỊ LA XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROPRANOLOL TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ. (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHÓA 2002-2007) Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Kieu Anh Th.s Nguyễn Thị Tlutnh Duyên. Nơi thực hiện : Phòng thí nghiệm trung tâm Trường đại học dược hà nội Thời gian thực hiện : T3/2007- T5/2007 HÀ NỘI, THÁNG 5- 2007. LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài này, em đã luôn nhận được sự quan tâm hướng dẫn tận tình của các thầy cô, sự động viên, giúp đõ của bạn bè và người thân. Để bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc của mình, em vô cùng cảm ơn: TS. NGUYEN th ị KIỀư a n h . THS. NGUYỄN THỊ THANH DUYÊN. Những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình, giúp đỡ em hoàn thành tốt khoá luận này. Em xin chân thành cảm ơn các cô làm việc tại Phồng thí nghiêm trung tâm- nơi em thực hiện đề tài của mình đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khoá luận này. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn phân tích- độc chất đã tạo điều kiện cho em trong quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới: - Bộ môn dược lý. - Bộ môn công nghiệp Dược đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới bố mẹ, những người thân trong gia đình và bạn bè đã hết lòng quan tâm, động viên em trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2007 Sinh viên Lê Thị La DANH MỤC CHỮ VIÊT TẮT HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography). LOQ: Giới hạn định lượng MeCN: Acetonitril MeOH: Methanol PRO: Propranolol RSD: Độ lệch chuẩn tương đối Apro: Diện tích pic của propranolol CpRO: Nồng độ propranolol. SK: Sắc ký USP : Dược điển Mỹ (The United States of Pharmacopoiea) THF: Tetrahydrofuran PTSH: Phân tích sinh học MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮVIÊT TẮT MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan vê Propranolol 2 1.1.1. Đặc điểm hoá lý của Propranolol 2 1.1.2. Tính chất dược lý 2 1.1.3. Dược động học 3 1.1.4. Liều lượng và cách dùng 4 1.1.5. Các dạng bào chế của Propranolol 4 1.1.6. Các phương pháp định lượng propranolol 4 1.2. Đại cương về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 7 1.2.1. Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 7 i 1.2.2. Phương pháp sắc ký phân bố pha đảo 8 1.2.3. Một số thông số đặc trưng 9 1.2.4. Các phương pháp định lượng bằng HPLC 11 1.3. Vài nét về thẩm định phương pháp phân tích sinh học 12 1.3.1. Khái niệm 12 1.3.2. Các mức độ thẩm định phương pháp phân tích sinh học(PTSH) 12 CHƯƠNG 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP THựC HIỆN 15 2.1.1. Nguyên vật liệu 15 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 16 2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VẦ NHẬN XÉT 20 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chó 20 2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chÓ24 2.2.3. Phân tích nồng độ PRO trong huyết tương chó sau khi uống viên Hémipralon LP 80 m g . 29 2.3. BẦN LUẬN 30 2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng PRO trong huyết tương chó 30 2.3.2. Phân tích nồng độ PRO trong mẫu thực 32 KẾT LUẬN 34 3.1. Kết luận 34 3.2. Đê xuất 35 PHỤ LỤC 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỂ Hiện nay ở Việt Nam, bệnh tim mạch đang là một trong bốn bệnh không lây nhiễm nguy hiểm ngày càng có xu thế gia tăng. Bệnh thường xảy ra với những người già đó là những đối tượng rất dễ quên uống thuốc. Để hạn chế những nhược điểm này người ta đã thay thế dạng bào chế thông thường bằng các dạng bào chế tác dụng kéo dài và mang lại hiệu quả điều trị vượt trội. Các dạng thuốc này còn có những ưu điểm như: có khả năng kiểm soát được quá trình giải phóng dược chất, giảm tác dụng phụ và nâng cao hiệu quả điều trị. Propranolol là hoạt chất thuộc nhóm chẹn /3 -adrenergic, được dùng để điều trị tăng huyết áp, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, loạn nhịp tim Trên thế giới, các dạng bào chế tác dụng kéo dài của propranolol đã được nghiên cứu đưa vào sử dụng. Ở nước ta, dạng bào chế này vẫn đang được nghiên cứu và thử nghiệm. Nghiên cứu sinh khả dụng ra đời vào những năm 1960 nhằm đánh giá chính xác chất lượng thuốc trên cơ thể sống. Trong nghiên cứu sinh khả dụng, việc phận tích nồng độ thuốc trong dịch sinh học là chìa khoá để tính toán các thông số dược động học, sinh khả dụng. Tuy nhiên, để khẳng định phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học là chính xác và tin cậy thì cần phải tiến hành thẩm định. Để góp một phần nhỏ vào sự nghiệp phát triển chung của ngành Dược, chúng tôi chọn đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chó Với 2 mục tiêu chính : 1. Xây dựng phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chó. 2. Thăm dò định lượng propranolol trong huyết tương chó sau khi uống viên nang propranolol 80 mg tác dụng kéo dài. 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Propranolol. 1.1.1. Đặc đỉểm hoá lí của Propranolol [5] a) Cấu trúc hoá học của Propranolol • Công thức: • Công thức phân tử : C16H21 N 02 . • Phân tử lượng : 259. • Tên khoa học : 1 - isopropylamiĩio- 3( 1 -Naphthyl-loxy) propan-2 -ol. ¥ b) Tính chất hoá lý • Propranolol hydrochlorid: Là bột kết tinh trắng, hoặc trắng ngà, không mùi, vị đắng. Tan trong nước, alcol, không tan trong ether, benzen, ethyl acetat. Nóng chảy 163°c -166°c. Phát huỳnh quang ở pH 4-5. • Propranolol hydrochloric! ổn định nhất ở pH =3 và phân huỷ nhanh ở pH kiềm. 1.1.2. Tính chất dược lý [3], [4], [9] 1.1.2.1. Cơ chế tác dụng của propranolol 2 Propranolol ức chế tác dụng của các chất dẫn truyền thần kinh giao cảm bằng cơ chế cạnh tranh ở các vị trí gắn thụ thể p . Propranolol chẹn cả thụ thể /? I và (ĩ 2 nên được coi là một thuốc chẹn p -adrenergic không chọn lọc. Tác dụng chẹn /? gây co thắt phế quản do tác dụng ngăn cản giãn mạch của p -adrenergic do vậy cần thận trọng với bệnh nhân hen phế quản. 1.1.2.2. Chỉ định Tăng huyết áp, đau nửa đầu, giật rung vô căn. Đau thắt ngực (trừ đau thắt ngực thể Prinzmetal). Điều trị dài ngày sau nhồi máu cơ tim. Loạn nhịp tim, phòng và điều trị các rối loạn nhịp nhanh có thể xảy ra khi gây mê. 1.1.2.3. Chông chỉ định ■ Hen, suy tim kèm xuất huyết, block nhĩ thất độ II và III, mạch chậm (dưới 50 nhịp/phút), mẫn cảm với thuốc, giảm huyết áp, u tuỷ thượng thận, rối loạn tuần hoàn ngoại vi, sốc tim. ■ Bệnh Raynaud, phối hợp với amiodaron. 9 1.1.3. Dược động học [9] 1.1.3.L Hấp thu Propranolol được hấp thu gần như hoàn toàn ở đường tiêu hoá. Sau khi uống 30 phút, đã xuất hiện trong huyết tương và sau 60-90 phút đạt nồng độ tối đa trong máu. Với dạng bào chế tác dụng kéo dài, sau khi uống khoảng 6 giờ thì đạt nồng độ tối đa trong máu và giữ nồng độ ổn định trong khoảng 24giờ. 1.1.3.2. Phân bô Propranolol được phân bố rộng rãi vào các mô trong cơ thể kể cả phổi, gan, thận, tim, Thuốc dễ dàng qua hàng rào máu não, nhau thai và sữa mẹ. Trên 90% propranolol liên kết với protein huyết tương. 1.1.3.3. Chuyên hoá và thải trừ 3 Propranolol được chuyển hoá gần như hoàn toàn ở gan, có ít nhất 8 chất chuyển hoá được tìm thấy trong nước tiểu. Chỉ có 1-4% liều được thải qua phân dưới dạng không chuyển hoá và dạng chuyển hoá. ở những bệnh nhân suy thận nặng, có sự tăng đào thải bù trừ qua phân. 1.1.4. Liều lượng và cách dùng [9] > Tăng huyết áp: Dựa trên đáp ứng của mỗi cơ thể. Khởi đầu là 20-40 mg/lần. Tăng dần liều cho đến khi huyết áp ổn định ở mức độ yêu cầu. Thông thường có hiệu quả khi dùng 160-240 mg/ngày. > Đau thắt ngực: 80-320 mg/ngày. Nên phối hợp với nitroglycerin. > Loạn nhịp tim: 10-30 mg/lần, 3-4 lần /ngày. Uống trước khi ăn và trước khi ngủ. > Nhồi máu cơ tim: 180-240 mg/ngày chia làm nhiều lần. > Run vô căn: Khởi đầu 40 mg/lần, 2 lần/ngày. Thường đạt hiệu quả điều trị tốt với liều 1 2 0 mg/ngày. 1.1.5. Các dạng bào chế của Propranolol [3], [7] - Viên nén: Inderal 40 mg, propranolol 80 mg, - Thuốc tiêm, dung dịch: Syprol 50 mg/5 ml, Inderal 1 mg/ml-,.;. - Viên nang tác dụng kéo dài: Hémipralon 80 mg, Inderal LA 160 mg, 1.1.6. Các phương pháp định lượng propranolol Có 3 phương pháp định lượng cơ bản là: - Phương pháp hoá học. - Phương pháp quang phổ uv. - Phương pháp HPLC. * Phương pháp hoá học: Định lượng PRO trong nguyên liệu [10], [11], [17], [18] - Dùng HCIO4 0,1M, chỉ thị là 1 - naphtholbenzenin. 4 1 ml HCIO4 0,1M tương đương với 0,02958g propranolol hydrochlorid. - Hoà tan 0,250 g propranolol hydrochloric! trong 25 ml alcol. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1M, xác định điểm tương đương bằng đo thế. * Phương pháp quang phổ ƯV: Định lượng PRO trong chế phẩm bào chế [10] - Chuẩn bị dung dịch propranolol trong methanol có nồng độ 2 0 |ig/ml. - Đo độ hấp thụ ở bước sóng 290 nm. * Phương pháp HPLC: Đây là phương pháp được dùng phổ biến nhất hiện nay để định lượng hoạt chất không chỉ trong nguyên liệu, trong các dạng bào chế mà còn cả trong dịch sinh học. - Định lượng PRO trong nguyên liệu ĩ20 ỉ + Cột sắc ký: C18 (4,6X 250 mm; 5um). + Pha động: Hoà tan 0,5g sodium dodecyl sulfat trong 18 ml H3PO4 0,15M, thêm 90 ml acetonitril và 90 ml methanol, pha loãng với nước tới 250 ml. + Bước sóng: 290 nm. - Định lượng PRO trong chế phẩm bào chế [20]. + Cột sắc ký: C18 (4,6 X 150 mm; 5|0,m). + Pha động: KH2P04 0,05M- MeCN (65:35) + Bước sóng: 220 nm. - Định lượng PRO trong dịch sinh học: Để định lượng propranolol có thể dùng 2 loại detector là detector hấp thụ u v và detector huỳnh quang. + Dùng detector hấp thụ UV: Có thể định lượng theo một số điều kiện sắc ký sau: Tài liệu Cột sắc ký Pha động Xử lý mẫu Bước sóng [19] Hypersil BDS C18 Na2H P0450mM pH Kết tủa protein bằng 2 1 0 (4,6x250mm ; 5- MeCN (62:38). MeCN. Ly tâm tốc độ nm 5|j,m). 1 0 0 0 0 vòng/ phút. 5 [...]... Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký: - Phương pháp chuẩn ngoại - Phương pháp chuẩn nội - Phương pháp thêm chuẩn - Phương pháp chuẩn hoá diện tích 11 Trongnghiên cứu này, chúng tôi dùng phươngpháp chuẩn ngoại để định lượng propranolol trong dịch sinh học Do vậy,chúng tôi tậptrung giới thiệu phương pháp định lượng này Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản trong. .. PRO trong huyết tương chó sau khi chó uống thuốc 5 giờ Nhận xét: Với kết quả thu được khi phân tích mẫu huyết tương chó uống viên nang Hémipralon LP 80 mg cho thấy phương pháp đã xây dựng có khả năng định lượng PRO trong các mẫu phân tích thực 2.3 BÀN LUẬN 2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng PRO trong huyết tương chó - Đối tượng nghiên cứu: Chúng tôi tiến hành định lượng propranolol trên nền huyết tương. .. 2.I.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích định lượng Propranolol trong huyết tương [2] Phương pháp phân tích propranolol trong dịch sinh học cụ thể là trong huyết tương thỏ đã được thẩm định [8 ] Theo quy định [2], khi thay đổi: chủ thể thử nghiệm (từ thỏ sang chó) , thay đổi trong quá trình xử lý mẫu chúng tôi tiến hành thẩm định một phần phương pháp phân tích Với các tiêu chí cần thẩm định là: tính... mối tương quan chặt chẽ đáp ứng phân tích (diện tích pic) và nồng độ propranolol trong khoảng khảo sát, LOQ thấp, độ chọn lọc cao, phương pháp này hoàn toàn có thể sử dụng để định lượng propranolol trong huyết tương chó 2.2.3 Phân tích nồng độ PRO trong huyết tương chó sau khi uống viên Hémipralon LP 80 mg Để chứng minh quy trình phân tích trên có thể ứng dụng vào thực tế phân tích PRO trong huyết tương. .. đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế 1.3.2 Các mức độ thẩm định phương pháp phân tích sinh học(PTSH) 12 Có 3 mức độ thẩm định là: - Thẩm định đầy đủ: rất quan trọng đối với: + Xây dựng và triển khai phương pháp PTSH lần đầu + Thuốc mới - Thẩm định chéo: Là so sánh các thông số thẩm định khi hai hay nhiều phương pháp phân tích được... hợp để định lượng propranolol trong huyết tương chó -Xử lý mẫu: Theo tài liệu [8 ], quy trình xử lý mẫu đã xây dựng theo phương pháp chiết lỏng- lỏng Tuy nhiên, phương pháp đó phải tiến hành qua nhiều giai 30 đoạn Để đơn giản hóa quy trình xử lý mẫu đồng thời tiết kiệm dung môi, hoá chất và thời gian, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp kết tủa protein bằng MeCN Để thấy được ưu điểm của phương pháp xử... khi chiết bằng dichloromethan phải mất khoảng 4- 5 tiếng Do đó, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp kết tủa protein để xử lý mẫu huyết tương 2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chó 2.2.2.1 Khảo sát tính phù hợp của hệ thông HPLC Sắc kí 6 lần liên tiếp một dung dịch chuẩn bị từ huyết tương trắng cho thêm propranolol chuẩn tại nồng độ 0,5 Ịig/m l Kết quả thu được ở bảng... sản xuất: Beaufour Ipsen Pharma (Pháp) - Động yật thí nghiệm: Chó đực, nặng 12 kg, đạt tiêu chuẩn động vật thí nghiệm 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 2.1.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương - Chuẩn bị mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc propranolol Cân chính xác 56,7 mg propranolol hydrochlorid tương ứng với 50 mg propranolol Hoà tan vừa đủ trong 10 ml hỗn hợp methanol- nước... Thẩm định một phần: Được sử dụng khi có những thay đổi trong phương pháp PTSH đã được thẩm định Trong đó có một số trường hợp cần phải tiến hành thẩm định một phần là: + Thay đổi chất chống đông khi lấy dịch sinh học + Thay đổi loại mẫu sinh học (ví dụ thay huyết tương bằng nước tiểu) + Thay đổi trong quá trình xử lý mẫu + Thay đổi chủ thể thử nghiệm (ví dụ: huyết tương chuột cống thay bằng huyết tương. .. cho vào ống nghiệm có sẩn EDTA + Lắc nhẹ, máu được để lạnh ngay và ly tâm 3500 vòng/phút trong 15 phút + Hút 500 Ịil huyết tương cho vào ống nghiệm có nút xoáy, đậy kín và bảo quản ở -30°c trước khi phân tích 2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chó 2.2.1.1 Điều kiện sắc ký * Tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký như sau: + Cột sắc . 20 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chó 20 2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chÓ24 2.2.3. Phân tích nồng độ PRO trong huyết tương. đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chó Với 2 mục tiêu chính : 1. Xây dựng phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chó. 2. Thăm dò định lượng propranolol. Các phương pháp định lượng propranolol Có 3 phương pháp định lượng cơ bản là: - Phương pháp hoá học. - Phương pháp quang phổ uv. - Phương pháp HPLC. * Phương pháp hoá học: Định lượng PRO trong