- Lấy mẫu:
+ Lấy 2,5 ml máu ở tĩnh mạch chi sau tại thời điểm sau 5 giờ uống thuốc cho vào ống nghiệm có sẩn EDTA.
+ Lắc nhẹ, máu được để lạnh ngay và ly tâm 3500 vòng/phút trong 15 phút. + Hút 500 Ịil huyết tương cho vào ống nghiệm có nút xoáy, đậy kín và bảo quản ở -30°c trước khi phân tích.
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng propranolol trong huyết tươngchó chó
2.2.1.1. Điều kiện sắc ký
* Tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký như sau: + Cột sắc ký: Dùng các cột C8, C18, CN.
+ Pha động: Khảo sát trên 3 hệ dung môi là:
^ MeCN: KH2P 04 0,05M pH 6,5 ±0,1 (35: 65) (1)
Dung dịch 0,5g SDS trong 18 ml H3P 04 0,15M. Thêm 90 ml MeCN, 90 ml MeOH, bổ sung nước vừa đủ 250 ml (2)
^ CH3COONa 0,03M pH 5,5±0,1: MeOH (35: 65) (3)
+ Bước sóng: Khảo sát tại 2 khoảng bước sóng: 220-230 nm và 290 nm. + Lưu lượng dòng: 1 ml/phút.
+ Thể tích mẫu tiêm: 50 ỊLil. * Kết quả cho thấy:
- Cột sắc ký: cột C18 (Hypersil ODS) là phù hợp, có khả năng tách chọn lọc
PRO ra khỏi mẫu phân tích. - Pha động:
Khi chạy hệ dung môi (1) thì pic propranolol tách không hoàn toàn, vẫn còn lẫn pic của dung môi.
Hệ dung môi (2) được sử dụng trong sắc ký cặp ion, nhằm tách pic propranolol hoàn toàn khỏi dung môi. Tuy nhiên, theo kết quả thu được chúng tôi thấy pic đã tách khỏi dung môi nhưng pic doãng.
Khi chúng tôi chạy hệ dung môi (3) thì kết quả cho thấy pic propranolol tách hoàn toàn khỏi pic dung môi, pic sắc nét, thời gian phân tích hợp lý. Do đó, chúng tôi chọn hệ dung môi (3).
- Bước sóng: Chúng tôi chạy sắc ký tại 2 bước sóng và kết quả cho thấy tại 2 bước sóng pic propranolol đều tách khỏi dung môi nhưng tại bước sóng 290 nm ảnh hưởng của pic dung môi, pic protein huyết tương đến pic PRO được loại trừ gần như hoàn toàn đồng thời CpR 0 trong mẫu thử vẫn đáp ứng được yêu cầu phân tích. Do vậy, chúng tôi chọn bước sóng 290 nm.
Dựa trên các kết quả thu được, chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc ký như đã trình bày ở mục 2.1.2.1.
■Cột sắc ký: Hypersil ODS (4,0 X 150mm; 5 jam)
■Pha động: MeOH- dung dịch CH3COONa 0,03M pH 5,50 ± 0,10 (65:35).
■ Bước sóng: 290nm.
■Lưu lượng dòng: 1 , 0 ml/phút. ■Thể tích mẫu tiêm: 50|il.
2.2.1.2. Xử lý mẫu phân tích
Sau khi thực hiện hai phương pháp xử lý mẫu, chúng tôi nhận thấy:
- Khi chiết bằng dichloromethan thì kết quả thu được khá tốt pic PRO cân đối, sắc nét,loại được hầu hết tạp. Tuy nhiên, thời gian chiết tương đối dài, quy trình chiết phải qua nhiều giai đoạn, có thể dẫn đến sai số.
- Tiến hành khảo sát xử lý mẫu theo cách kết tủa protein bằng MeCN như sau: Cho MeCN vào mẫu huyết tương 500 Ị-il. Lắc (1 phút). Ly tâm, lọc qua màng lọc 0 , 2 Ị^tti .
Thông thường, tỷ lệ huyết tương- MeCN là 1: 4.
Ban đầu, chúng tôi sử dụng tỷ lệ này và ly tâm với tốc độ 3500 vòng/ phút, trong 15 phút. Kết quả sắc ký đồ cho thấy: pic PRO đã tách khỏi tạp nhưng mẫu bị pha loãng nên khả năng phát hiện bị hạn chế.
Để khảo sát lượng MeCN cần cho vào, chúng tôi đã làm như sau:
Cho 0,5 ml MeCN vào 0,5 ml huyết tương đã có propranolol chuẩn. Lắc 1 phút, ly tâm với tốc độ 3500 vòng/phút rồi hút dịch trong. Sau đó, chúng tôi lấy tiếp 0,5 ml MeCN nhỏ từ từ từng giọt vào dịch trong đó và thu được kết quả như sau: Lúc đầu, dịch trong chuyển sang trắng đục do MeCN kết tủa hết protein còn dư. Nhưng sau đó, dịch trở lại trong ngay dù vẫn cho tiếp MeCN và ở dưới đáy ống nghiệm có các tủa lắng xuống. Nếu cũng lượng MeCN như vậy, chúng tôi tiến hành ly tâm bằng máy siêu ly tâm tốc độ 1 0 0 0 0 vòng/phút thì khi cho tiếp MeCN vào thì dịch vẫn trong. Do vậy, qua quá trình khảo sát trên chúng tôi đã chọn được phương pháp xử lý mẫu như sau:
Huyết tương 0,5 ml MeCN. ▼ Hốn hợp chiết Lắc 1 phút, ly tâm 10 000 vòng/phút. Ỵ Dịch trong Lọc qua màng lọc 0,2 MJTL. y Dịch lọc
Hình 2.2: Sơ đồ xử lý mẫu có PRO trong huyết tương
Nhận xét:
Với quy trình xử lý mẫu đã chọn, kết quả sắc ký đồ cho thấy: pic PRO riêng biệt, có tính lặp lại cao, pic sắc nét, khả năng phát hiện PRO đáp ứng được yêu cầu.
MeCN vừa được sử dụng để hoà tan hết lượng propranolol đã có trong huyết tương, vừa được dùng để kết tủa hết protein. Do vậy, khi hút dung dịch trong rất đơn giản. So với quy trình chiết bằng dichloromethan thì quy trình chiết này tiết kiệm hơn nhiều về thời gian cũng như về dung môi đồng thời cách tiến hành lại rất đơn giản, dễ thực hiện.
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát lượng MeCN cho vào với mục đích: dùng lượng dung môi ít nhất mà vẫn kết tủa hết propranolol, như vậy mẫu đỡ bị pha loãng nhiều lần, đồng thời lại tiết kiệm được dung môi. Do vậy, chúng tôi sử dụng 0,5 ml MeCN để xử lý mẫu.
Cả hai phương pháp chiết và kết tủa protein đều cho kết quả là pic PRO riêng biệt, có độ lặp lại cao. Tuy nhiên, so với phương pháp kết tủa protein thì phương pháp chiết quy trình phức tạp hơn, phải dùng nhiều hoá chất hơn với lượng nhiều hơn do đó chi phí tốn kém hơn. Đồng thời, dùng phương pháp kết
tủa protein tốn ít thời gian hơn rất nhiều xử lý mỗi mẫu chỉ mất khoảng 15 phút trong khi chiết bằng dichloromethan phải mất khoảng 4- 5 tiếng.
Do đó, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp kết tủa protein để xử lý mẫu huyết tương.
2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng propranolol trong huyết tương chó
2.2.2.1. Khảo sát tính phù hợp của hệ thông HPLC
Sắc kí 6 lần liên tiếp một dung dịch chuẩn bị từ huyết tương trắng cho thêm propranolol chuẩn tại nồng độ 0,5 Ịig/m l. Kết quả thu được ở bảng 3.4 sau:
Lần Thời gian lưu (phút) Diện tích pic PRO
(mAUxgiây) 1 4,377 411825 2 4,317 412309 3 % ậ 4,323 414522 4 4,320 409345 5 4,280 405429 6 4,301 426509 Trung bình 4,319 413323,16 RSD% 0,748 1,105
Bảng 2.4: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống HPLC
Nhận xét: Với kết quả thu được ở bảng 2.4 trên cho thấy: các giá trị
RSD% đều nhỏ hơn 2%, chứng tỏ hệ thống sắc ký đã chọn có tính thích hợp cao, có thể ứng dụng để phân tích mẫu trong thực tế.
2.2.2.2. Khảo sát tính chọn lọc
Chuẩn bị 3 mẫu huyết tương trắng không thêm propranolol chuẩn, và 3 mẫu huyết tương trắng thêm propranolol chuẩn có nồng độ là 1 , 0 0 0 Ịig/ml.
Xử lý mẫu theo sơ đổ 2.2.
Tiến hành sắc ký theo điều kiện ở mục 2.2.1.1.
Kết quả cho thấy: Tại vị trí ứng với pic của PRO (tR=4,280 phút) của mẫu huyết tương cho thêm propranolol chuẩn trên sắc ký đổ của mẫu trắng không thấy xuất hiện pic. Như vậy, phương pháp đã chọn có tính chọn lọc cao.
2.2.23. Độ tuyến tính
Chuẩn bị một thang chuẩn trong huyết tương chó với nồng độ propranolol từ 0,05 Hh 5 |ig /m l.
Xử lý mẫu theo sơ đồ 2.2.
Tiến hành sắc ký theo điều kiện ở mục 2.2.1.1.
Kết quả thu được biểu thị bằng diện tích pic (A) của propranolol.
CpRO Og/ml) Apro (mAƯxgiây)
5,000 4265963 2,000 2006655 1,000 889936 0,500 411825 0,250 221276 0,100 138864 0,050 92964 Kết quả thống kê
Phương trình hồi quy: y= 857030x+ 59499.
Hệ sô tương quan: r=0,9975.
y : Là diện tích pic của propranolol.
X : Là nồng độ ( ỊXg/m) của propranolol.
Bảng 2.5: Bảng kết quả biểu thị sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ PRO 5000000 1 § 4000000 - ♦ W 3000000 - Ề 2000000 - < 1000000 - 1 ** ' C(ug/ml) 0 2 4 6
Hình 2.3 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ propranolol
Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy đường hồi qui thu được có dạng đường
thẳng và hệ số tương quan r=0 , 9 9 7 5 chứng tỏ đáp ứng phân tích (A) và nồng độ chất phân tích có quan hệ tuyến tính chặt chẽ trong khoảng nồng độ khảo sát và đường hồi qui có thể sử dụng để tính toán kết quả định lượng với độ tin cậy cao.
2.2.2.4. Giới hạn định lượng
Chuẩn bị các mẫu huyết tương trắng, mỗi mẫu thêm propranolol chuẩn để được các mẫu thử có nồng độ thấp dần.
Xử lý mẫu theo hình 2.2.
Tiến hành sắc ký theo điều kiện ở mục 2.2.1.1. Tại nồng độ 15 ng/ml, tỷ số S/N= 15,2. Từ đó, chúng tôi ngoại suy xác định LOQ là: 10 ng/ml, khi đó tỷ số S/N=10,l.
Hình 2.4: Sắc ký đồ tại tại nồng độ 15 ng/ml 22.2.5. Độ đúng
- Mẫu chụẩn; Lấy 10|il dung dịch propranolol pha trong pha động để được
*
nồng độ 0 , 1 0 0 Mg/m, 6 mẫu.
- Mẫu thử. Các mẫu huyết tương trắng được thêm ỈOịil dung dịch
propranolol để được mẫu thử có nồng độ 0,100 Ịig/ml, 6 mẫu.
Xử lý mẫu theo sơ đồ 2 .2 .
Tiến hành sắc ký theo điều kiện ở mục 2.2.1.1. Kết quả được trình bày trong bảng 2.6 sau:
SỐ thứ tự Apro trong huyết tương Apro trong pha động
1 131565 148663
3 141912 141940 4 135846 140941 5 142634 140928 6 142902 145623 Trung bình 137296,5 143387,6 % tìm lại 95,75%
Bảng 2.6: Xác định độ tìm lại (n=6) tại nồng độ khảo sát
Nhận xét: Độ tìm lại là 95,75% như vậy chứng tỏ phương pháp này có độ
đúng khá cao.
22.2.6. Độ chính xác
Các mẫu huyết tương trắng được thêm lOịil dung dịch propranolol để được mẫu thử có nồng độ 0 , 1 0 0 Ị-ig/ml, 6 mẫu.
Tiến hành phân tích theo điều kiện quy định. Kết quả được trình bày ở bảng sau: Số thự tự Diện tích pic 1 131565 2 128920 3 141912 4 135846 5 142634 6 142902 Trung bình 137296.5 RSD% 4,05%
Bảng 2.7: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp.
Nhận xét: kết quả phân tích cho thấy RSD% dưới 5%. Với phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học có RSD%< 5 được coi là rất chính xác. Vì vậy, chương trình sắc ký đã chọn có độ chính xác khá cao.
Với tính đúng đảm bảo, độ chính xác tốt, mối tương quan chặt chẽ đáp ứng phân tích (diện tích pic) và nồng độ propranolol trong khoảng khảo sát, LOQ thấp, độ chọn lọc cao, phương pháp này hoàn toàn có thể sử dụng để định lượng propranolol trong huyết tương chó.
2.2.3. Phân tích nồng độ PRO trong huyết tương chó sau khi uống viên Hémipralon LP 80 mg
Để chứng minh quy trình phân tích trên có thể ứng dụng vào thực tế phân tích PRO trong huyết tương của cá thể sống sau khi uống thuốc, chúng tôi đã cho chó uống 1 viên Hémipralon LP 80 mg và lấy mẫu tại thời điểm sau khi uống thuốc là 5 giờ, 3 mẫu. Các mẫu huyết tương chó cũng được xử lý theo sơ đồ 2 . 2 và tiến hành sắc ký như điều kiện ở mục 2 .2 .1.1.
Kết quả thu được là diện tích pic của propranolol trong mẫu thực, dựa theo đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích chúng tôi tính được nồng độ propranolol tại thời điểm đó.
SỐ thứ tự Diện tích pic thu được 1 1333176 2 1309467 3 1328663 Trung bình 1323768.6 Nồng độ PRO ( |!g/m l) 1,358
Bảng 2.8 : Nồng độ PRO trong huyết tương chó sau khi chó uống thuốc 5 giờ.
Nhận xét: Với kết quả thu được khi phân tích mẫu huyết tương chó uống viên nang Hémipralon LP 80 mg cho thấy phương pháp đã xây dựng có khả năng định lượng PRO trong các mẫu phân tích thực.
2.3. BÀN LUẬN
2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng PRO trong huyết tương chó- Đối tượng nghiên cứu: Chúng tôi tiến hành định lượng propranolol trên nền - Đối tượng nghiên cứu: Chúng tôi tiến hành định lượng propranolol trên nền huyết tương chó. Trong số các loài động vật thí nghiệm thì chó là lý tưởng nhất cho nghiên cứu sinh khả dụng của thuốc vì hệ tiêu hoá của chó khá giống người, còn ở thỏ do cấu tạo hệ tiêu hoá khác xa của người cho nên sử dụng để nghiên cứu SKD là không thích hợp lắm. So với phương pháp cũ [8], chúng tôi đã thay đổi chủ thể nghiên cứu cho phù hợp hơn trong việc ứng dụng vào nghiên cứu sinh khả dụng của thuốc chứa propranolol tác dụng kéo dài.
- Điều kiện phân tích: Dựa trên các kết quả nghiên cứu trước đó và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, chúng tôi đã khảo sát điều kiện sắc ký và chọn được điều kiện phù hợp để định lượng propranolol trong huyết tương chó.
-Xử lý mẫu: Theo tài liệu [8], quy trình xử lý mẫu đã xây dựng theo phương pháp chiết lỏng- lỏng. Tuy nhiên, phương pháp đó phải tiến hành qua nhiều giai
đoạn. Để đơn giản hóa quy trình xử lý mẫu đồng thời tiết kiệm dung môi, hoá chất và thời gian, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp kết tủa protein bằng MeCN.
Để thấy được ưu điểm của phương pháp xử lý mẫu đã chọn, chúng tôi lập bảng so sánh sau:
Phương pháp Thời gian Hoá chất sử dụng Giá thành Độ phức tạp của qui trình Chiết bằng dichloromethan Khá lâu (khoảng 4- 5 tiếng) Dichloromethan (5 ml/mẫu) MeCN (dùng nhiều do là thành phần của pha động) MeOH (6,5 ml để pha chuẩn gốc) KH2P 04 (dùng nhiều) 660 0 0 0 / 1 320 000/1 +++ Kết tủa protein theo tỉ lệ HT: MeCN=l: 4, ly tâm 3500 vòng/phút. Ngắn (15 phút) MeCN (2 ml/mẫu) MeOH (6,5 ml để pha chuẩn gốc) Rẻ, MeCN đắt nhưng lại dùng ít) + Kết tủa protein bằng MeCN nhưng theo tỉ lệ 1: 1, ly tâm 1 0 0 0 0 vòng/phút.
Giống phương pháp trên nhưng lượng MeCN dùng chỉ bằng
1 / 4 -> chi phí giảm đi đồng thời tỉ lệ pha loãng giảm đi“> khả năng phát hiện tốt hơn.
Và kết quả thu được cho thấy, phương pháp đã chọn là hợp lý.
Dựa vào những thay đổi so với phương pháp cũ [8], chúng tôi tiến hành thẩm định một phần với các tiêu chí sau: LOQ, độ chọn lọc, độ chính xác, độ đúng, độ phù hợp của hệ thống, độ tuyến tính. Kết quả thu được chứng tỏ phương pháp đã chọn có độ chọn lọc cao, độ chính xác và độ đúng tốt, khoảng tuyến tính rộng (0,050- 5,000) với hệ số tương quan r=0,9965. Vì vậy, có thể dùng phương trình hồi quy để tính toán kết quả định lượng với độ tin cậy cao.
Do thời gian và kinh phí hạn hẹp nên chúng tôi vẫn còn thiếu sót là chưa làm đầy đủ tại 3 khoảng nồng độ (từ 10- 30% của thang đường chuẩn, 40- 60% nồng độ ULOQ, 70- 90% nồng độ ULOQ) khi thẩm định độ đúng và độ chính xác. Tuy độ đúng và độ chính xác chúng tôi chỉ tiến hành tại một nồng độ nhưng lại là khoảng nồng độ thấp nhất (chiếm từ 10-30% đường chuẩn) là khoảng nồng độ có thể gây sai số lớn nhất mà vẫn đạt yêu cầu: RSD%= 4,05%. Do vậy, tại hai khoảng nồng độ còn lại (40- 60% nồng độ ULOQ, 70- 90% nồng độ ULOQ) khả năng đáp ứng theo quy định là hoàn toàn khả thi.
2.3.2. Phân tích nồng độ PRO trong mẫu thực.
Để chứng tỏ rằng phương pháp định lượng đã chọn hoàn toàn có thể ứng dụng để phân tích nồng độ propranolol trong mẫu thực. Chúng tôi đã cho chó uống một viên chứa propranolol 80 mg tác dụng kéo dài và lấy mẫu nghiên cứu theo quy trình đã xây dựng ở mục 2 .1.2 .3 .
Với diện tích pic thu được dựa theo đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích chúng tôi xác định được nồng độ propranolol tại thời điểm lấy máu là
1,358 - đây có thể là thòi điểm sát gần Tmax.
Để kết quả có độ tin cậy hơn và có thể ứng dụng trong nghiên cứu sinh khả dụng thì cần phải lấy mẫu tại nhiều thời điểm và thử nghiệm trên nhiều cá