Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư

Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư Đánh giá độ ổn định của nguyên liệu altretamin ( hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại bộ môn hoá hữu cơ trường đại học dược hà nội thuốc điều trị ung thư

BO Y TE TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NOI

PHAN THỊ UYÊN

DANH GIA ĐỘ ÔN ĐỊNH CỦA

NGUYEN LIEU ALTRETAMIN

(HEXAMETHYLMELAMIN) LAM

THUOC DIEU TRI UNG THU DUOC

TONG HOP TAI BO MON HOA HUU

CO TRUONG DAI HOC DUOC HA NOI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2012

BỘ Y TE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ UYÊN

DANH GIA ĐỘ ÔN ĐỊNH CỦA

NGUYÊN LIỆU ALTRETAMIN

(HEXAMETHYLMELAMIN) LÀM THUOC DIEU TRI UNG THU DUOC TONG HOP TAI BO MON HOA HUU

CƠ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĩĨ

Người hướng dẫn:

1 ThS Trần Thị Bích Vân

2 PGS TS Đỉnh Thị Thanh Hải

Nơi thực hiện:

1 Khoa Vật lý đo lường — Viện kiểm nghiệm thuốc TW

2 Bộ môn Hóa hữu cơ — Trường đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2012

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu, các thầy cô giáo và các

anh chị kỹ thuật viên thuộc Bộ môn Hoá hữu cơ, các phòng ban, thư viện

Trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Vật lý đo lường — Viện Kiểm nghiệm

thuốc Trung Ương - Bộ Y Tế đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em

hoàn thiện đề tài

Cuối cùng, em xin được gửi lời biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và

bạn bè đã luôn luôn ở bên khích lệ, động viên, giúp đỡ em trong học tập cũng như trong cuộc sống

Hà Nội, Ngày 12 tháng 05 năm 2012

Sinh viên

Phan Thị Uyên

MUC LUC

DANH MUC CAC KY HIEU, CHU VIET TAT

DANH MUC CAC BANG

DANH MUC CAC HINH VE, DO THI

1.2.1 Phương pháp tổng hợp của Donald W Kaiser

1.2.2 Phương pháp tổng hợp altretamin của Kapil Arya và Anshu Diana

bằng kỹ thuật vi sóng sử dụng xúc tác Zeolit

1.2.3 Phương pháp tổng hợp altretamin của Peter Dornan và cộng sự

1.2 Tổng quan về độ on định của thuốc

1.2.1 Các kiểu phân hủy của nguyên liệu và biện pháp khắc phục

1.2.2 Các yêu tô ảnh hưởng đến tốc độ phân hủy được chất

1.2.3 Các kiểu thử nghiệm đánh giá độ ổn định

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Hóa chất và phương tiện sử dụng

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp kiểm nghiệm 20 2.3.3 — Nghiên cứu độ ôn định của altretamin 24

CHUONG 3: KET QUA THUC NGHIEM VA BAN LUẬN 26

3.1.1 Rà soát tính thích hợp của phương pháp 26

3.1.2 Kiểm nghiệm nguyên liệu trước khi tiễn hành theo dõi độ ổn định 26 3.143 Kết quả theo dõi độ ôn định của thuốc trong thời gian 15tháng 27

3.14 Kiểm nghiệm nguyên liệu sau khi tiến hành theo dõi độ ổn định 36

KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CHU GIAI CAC CHU VIET TAT

'DNA Deoxyribo nucleic acid

FDA | Food and drug administration (Cuc quan ly Dugc va thực phâm Mỹ) HPLC High-performance liquid chromatography (Sic ky long hiéu nang

DANH MUC CAC BANG

DAT VAN DE

Hiện nay, ung thư là một trong những căn bệnh gây tử vong cao nhất thé giới Theo công bố của WHO, trên toàn thế giới có hơn 12,6 triệu người mắc bệnh ung thư và hơn 7,6 triệu người bị tử vong vì căn bệnh này (chiếm

khoảng 13% số ca tử vong) trong năm 2008 Trong đó có hơn 70% số tử vong

xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình Một số loại ung thư gây tử vong phổ biến bao gồm: ung thư phổi (1,37 triệu ca tử vong), ung thư dạ dày

(736.000 ca tử vong), ung thư gan (695.000 ca tử vong), ung thư đại trực tràng (608.000 ca tử vong), ung thư vú (458.000 ca tử vong) và ung thư cô tử cung (275.000 ca tử vong) Mỗi năm số bệnh nhân mắc ung thư tiếp tục gia

tăng và được dự báo đến năm 2030 sẽ có hơn 13,1 triệu người tử vong vì căn bệnh ung thư này [28]

Tại Việt Nam, theo thông tin tại hội thảo quốc gia phòng chống ung thư tô chức tại Hà Nội vào ngày 07/10/2010 ước tính năm 2010 có ít nhất 126.300

ca ung thư mới mắc Bên cạnh việc tăng tỷ lệ mới mắc, tỷ lệ chết do ung thư cũng chiếm tới 12% trong số các nguyên nhân gây tử vong ở người [3] Các bệnh ung thư thường gặp có tỷ lệ tử vong cao ở Việt Nam là ung thư gan, ung

thư phổi, ung thư buôn trứng, ung thư vú Hầu hết các thuốc điều trị ung thư đều phải nhập ngoại nên giá thành và chi phí điều trị cao không phù hợp với điều kiện kinh tế của người bệnh Do vậy hiện nay việc sản xuất nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thư là một trong những nhiệm vụ trọng tâm của ngành

công nghiệp dược

Altretamin (hexamethylmelamin) là một trong những thuốc chống ung thư

đã được nghiên cứu, thử nghiệm lâm sàng thành công và đưa vào sử dụng

hiệu quả trong điều trị ung thư phổi, ung thư buông trứng, ung thư vú trên thế giới Altretamin hiện đang được sử dụng trong điều trị ung thư với các biệt

dược Altretamin (Mỹ), Hexalen (Mỹ), Hexastat (Pháp), Hexinawas (Tây Ban Nha), v.v

Từ những vấn đề trình bày trên cho thấy việc nghiên cứu tổng hợp altretamin đạt tiêu chuẩn được điển Mỹ USP 32 để từ đó hướng tới ứng dụng

sản xuất thuốc này ở nước ta là một việc làm cần thiết và cấp bách

Việc nghiên cứu quy trình tong hợp altretamin đã được thực hiện tại Bộ môn Hóa hữu cơ, Trường đại học Dược Hà Nội bởi nhóm tác giả Đình Thị Thanh Hải và cộng sự Sản phẩm tổng hợp được đã được kiểm nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương - Bộ Y Tế Kết quả cho thấy altretamin được tổng hợp tại Bộ môn Hóa hữu cơ, Trường đại học Dược Hà Nội đạt tiêu

chuẩn Dược Điển Mỹ USP 32

Nhằm góp phần hoàn thiện nghiên cứu tổng hợp altretamin đảm bảo chất

lượng làm thuốc tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá

độ ổn định của nguyên liệu altretamin (hexamethylmelamin) làm thuốc điều trị ung thư được tổng hợp tại Bộ môn Hóa hữu cơ — Trường Đại học

Dược Hà Nội” với mục tiêu như sau:

- _ Đánh giá độ ôn định của nguyên liệu altretamin tổng hợp được tại Bộ môn Hóa hữu cơ — Trường Đại học Dược Hà Nội ở điều kiện thường

(nhiệt độ 30°C + 2°C và độ âm 70% + 5%) theo tiêu chuẩn Dược Điền

Mỹ USP 32 trong thời gian 15 tháng

Công thức phan tir: CoH;3N6 HạC Í TT CH,

Nhiệt độ nóng chảy: 172 °C - 173”C "

Biét dugc: Hexastat (Phap), Hexinawas

(Tây Ban Nha), Altretamin (Mỹ), Hexalen

(Mỹ) v.v Công thức câu tạo Tác dụng điều trị ung thư

Năm 1951 Donald W.Kaiser và cộng sự đã công bố quy trình tổng hợp

altretamin lần đầu tiên [14] Sau đó vào năm 1976, tác dụng sinh học của altretamin được nghiên cứu bởi Sewa và cộng sự, trong đó tác dụng chủ yếu

là điều trị ung thư buồng trứng, ung thư vú và ung thư phổi [25] Đặc biệt

altretamin được sử dụng điều trị ung thư buồng trứng tiến triển sau khi

phương pháp trị liệu đầu tiên thất bại [13, 15, 22, 24]

Vào ngày 26 tháng 12 năm 1990, cục quản lý Dược và thực phẩm Mỹ

(FDA) đã cấp phép lưu hành và đưa vào sử dụng trong điều trị ung thư

altretamin với tên biệt dược là Hexalen (US Bioscience) Hexalen cũng đã

được cấp phép lưu hành tại Châu Âu từ ngày 05 tháng 07 năm 1995

Chu trình tế bào và tác động của Hexamethylmelamin

Theo tài liệu “ Bách khoa ung thư học” [8] các tế bảo ung thư cũng như các tế bào bình thường đều phải đi qua 4 pha của chu trình tế bào, bao gồm:

- Pha G1 là pha hoạt động cơ năng của tế bào, tế bảo trao đổi chất chuẩn

bị cho quá trình tổng hợp DNA Ở pha G1, tế bào có 2n NST.

- _ Pha S là pha của quá trình tổng hợp DNA

- _ Pha G2 là pha chuẩn bị phân bào, còn gọi là tiền nguyên phân trong đó

tế bào có 4n NST

- _ Pha M là pha phân bào (nguyên phân)

Ngoài ra, tế bào còn có pha G0, tử pha G1(chủ yếu) hoặc G2 Các tế bào

được coi là “nằm ngoài chu trình” và không bị tác động bởi hóa chất Tùy

theo cơ chế tác động của từng loại hóa chất ung thư mà thời điểm tác động

của nó vào chu trình tế bào khác nhau Altretamin là một thuốc trong nhóm

tác nhân chống ung thư alkyl hóa [13], altretamin tác động vào pha G1 sớm

của chu trình tế bào [5,12,13, 15, 161 Altretamin

altretamin là thuốc điều trị ung thư kìm hãm tế bào nhóm alkyl hóa Một số

tài liệu đã công bố cho rằng cơ chế tác dụng chống ung thư của atretamin liên quan tới sự oxy hóa bởi enzym cytocrom P- 450 cụ thê là cyt P450 - 3A4 [9,

10, 12, 15, 16]

Cơ chế quá trình hoạt hóa atretamin và tác dụng alkyl hóa DNA tế bào ung

thư [9, 16, 21] có thể được mô tả như sau:

- - Bước T: một nhóm methyl -CHạ / -N(CHạ); bị oxy hoá thành alcol bậc

nhất - CH;OH bởi enzym cytocrom P450 3A4.

- _ Bước 2: dehydrat hoá tạo ra ion methyleniminium, m6t tac nhan ái điện

tử lon mefhyleniminium mang điện tích đương là tác nhân rất hoạt động có nhiệm vụ alkyl hoá DNA

Theo Garcia và cộng sự, ion methyleniminium tạo thành là chất trung gian

có ái lực electrophil lớn đối với các trung tâm giàu điện tử trên phân tử DNA [151

Tác dụng trị liệu và gây độc tế bào của các tác nhân alkyl hoá chống ung thư liên quan trực tiếp và mật thiết tới việc alkyl hoá DNA Nguyên tử Nitơ ở

vị trí số 1 và vị trí số 3 của hợp phần adenin, nguyên tử N ở vị trí số 3 của hợp phần cytosin, nguyên tử N ở vị trí số 7 và nguyên tử O của hợp phần guanin

déu dé dang tạo liên kết với tác nhân electrophil (ion methyleniminium)

Tương tự như vậy, các nhóm -CH; sẽ tiếp tục được hoạt hoá Cơ chế tác dụng của altretamin có thể được mô tả như sơ đồ 1.2 (trang 6)

Nghiên cứu của Jackson, Hopkins và cộng sự lại chỉ ra rằng cơ chế tác dụng của altretamin là do sự tạo thành liên kết cầu nối (cross-linking) liên kết cầu nối tạo thành bởi tác dụng của formaldehyd được tạo ra bởi quá trình

deformyl hoá của altretamin với các nguyên tử nitơ ở vị trí số 6 (N-6) của

vòng purin trong hợp phần deoxydenosin như sơ đồ 1.3 (trang 7) [15, 19]

Ay

So dé 1.2 So d6 co ché hoat héa altretamin va bién doi DNA

HC _—(€

Sơ đồ 1.3 Cơ chế deformyl hóa và tạo liên kết cầu nối giữa 2 phân tứ DNA

1.1.2 Dược động học

Altretamin hấp thu tốt qua đường uống, đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương trong vòng 0.5 — 1 h và thức ăn làm giảm hấp thu Thuốc phân bố vào các mô có thành phần lipid cao Nồng độ thuốc trong khối u nguyên phát cao

bằng nồng độ trong huyết tương và nông độ trong di căn cao hơn so với khối

u ban đầu Atretamin chuyển hóa trong gan tạo thành các chất chuyển hóa có hoạt tính là các dẫn chất của hydroxymethyl chủ yếu là pentamethylmelamine

và tetramethylmelamine và bài tiết qua nước tiêu đưới dạng chất chuyển hóa

có hoạt tính [15, 16, 21, 23]

1.1.2 Dạng bào chế, chỉ định, liều dùng và đường dùng

Dạng bào chế: viên nang 50mg, 100mg

Chỉ định: atretamin chỉ định cho điều trị các u ở phổi, buồng trứng và

vú [4, 15]

Liều dùng: liều hàng ngày, chia 3 — 5 lần, uống xa bữa ăn

U phổi: 150 - 250 mg/m”/ngày, đợt 5 ngày, nghỉ năm ngày lại dùng đợt khác, phối hợp với thuốc kìm tế bào khác

U buông trứng: 150 - 250 mg/m’/ngay, trong 21 ngay/thang

U vii: 150 - 250 mg/m’/ngay, trong 15 ngày/tháng

1.2 MOT SO PHUONG PHAP TONG HOP ALTRETAMIN

1.2.1 Phương pháp tông hợp cia Donald W Kaiser

So dé phan ứng:

Quy trình téng hop atretamin dugc Donald W Kaiser và cộng sự công bố

lần đầu tiên năm 1951 [14] và gồm 2 bước:

- Bước 1: Hoa tan 1 mol cyanuric clorid vao trong 800 ml dung mdi

aceton, thém 3,3 mol dimethylamin, rồi thêm vào 1 mol natri hydroxyd, đun

hồi lưu ở 50C trong 1 giờ Cất loại dung môi Phần cắn thô thu được thêm

xylen, lắc đều rồi cất đẳng phí để loại hoàn toàn nước

- Bước 2: Thêm vào hỗn hợp phản ứng 2 mol bột natri hydroxyd khan rồi

đun nóng 3 giờ ở 100°C Xử lý hỗn hợp phản ứng, thu được sản phẩm thô

Kết tinh lại bằng methanol, thu được sản phẩm kết tỉnh màu trắng Hiệu suất

37%

TS Đinh Thị Thanh Hải và cộng sự đã nghiên cứu cải tiến qui trình tổng

hợp của Donal W Kaiser để phù hợp với điều kiện thực tiễn ở Việt Nam và

đạt hiệu suất cao (71% sau cải tiến) [6]

1.2.2 Phương pháp tổng hợp altretamin của Kapil Arya va Anshu Diana bằng kỹ thuật vỉ sóng sử dụng xúc tác Zeolit

Sơ đồ phản ứng:

Quy trình tổng hợp có một giai đoạn: Đặt cyanuric chlorid, đimethylamin,

HY Zeolit vào lò vi sóng, sau đó xử lý hỗn hợp phản ứng thu được

Altretamin [4] TS Đinh Thị Thanh Hải và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp

thành công altretamin sử dụng kỹ thuật vi sóng — 1 kỹ thuật được sử dụng khá rộng rãi trong tông hợp hữu cơ hiện nay vì tính ứng dụng cao do kỹ thuật tiễn hành đơn giản, rút ngắn đáng kể thời gian tiến hành phản ứng, ít phản ứng phụ và hiệu suất phản ứng cao [7]

1.2.3 Phương pháp tổng hợp altretamin của Peter Dornan và cộng sự

Sơ đồ phản ứng:

1.3 TONG QUAN VE DO ON DINH CUA THUOC

Khái niệm: Độ ôn định của thuốc là khả năng của thuốc (nguyên liệu hoặc thành phẩm) bảo quán trong điều kiện xác định giữ được những đặc tính vốn

có về vật lý, hóa học, vi sinh, tác dụng dược lý và độc tính trong giới hạn qui định của tiêu chuẩn chất lượng thuốc [1]

Tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định

Có 5 tiêu chuẩn đánh giá độ ôn định của thuốc:

Độ ổn định hóa học: Các tính chất hóa học (thành phần định tính và định

lượng) của (các) hoạt chất có mặt trong chế phẩm nằm trong một giới hạn cho

phép theo tiêu chuẩn chất lượng

Độ ổn định vật lý: Các đặc điểm vật lý của nguyên liệu làm thuốc như: màu

sắc, trạng thái tinh thể, độ tan, điểm chảy không thay đôi Các đặc điểm của chế phẩm như màu sắc, độ cứng, độ rã, độ hòa tan dao động trong khoảng

giới hạn cho phép của tiêu chuẩn chất lượng

Độ ổn định vi sinh: Độ vô trùng hoặc giới hạn nhiễm khuẩn của chế phâm

phải đáp ứng yêu cầu của tiêu chuẩn Nếu chế phẩm có chứa chất kháng

khuẩn thì hàm lượng của nó không vượt quá giới hạn cho phép

Độ ẩn định điêu trị: Tác dụng điều trị của chế phẩm không thay đổi.

11

Độ ổn định độc tính: Độc tính của chế phẩm không được tăng lên trong suốt quá trình bảo quản và lưu hành trên thị trường [2]

Sự liên quan giữa tuổi thọ của nguyên liệu và thành phẩm thuốc

Độ ổn định, tuổi thọ của nguyên liệu được chất có liên quan, ảnh hưởng đến độ ôn định, tuổi thọ của thành phẩm bào chế Đi từ nguyên liệu dược chất

có độ ôn định cao cùng với một quy trình sản xuất chắc chắn thu được thành

phẩm bào chế có độ ôn định cao hơn khi sử dụng nguyên liệu có độ ổn định

thấp Tuy nhiên, tuổi thọ của nguyên liệu và thành phẩm bào chế là các dữ liệu độc lập thu được từ các nghiên cứu cụ thể [1]

1.3.1 Các kiểu phân hủy của nguyên liệu và biện pháp khắc phục

1.3.1.1 Phân hủúy hóa học

a Thuy phan

Dược chất có các nhóm chức như: Este, amid, vòng lacton, lactam, imid,

malonyl ure dễ bị thủy phân Sự thủy phân thường được xúc tác bởi các ion

H’, các tác nhân acid và ion OH ˆ cũng như các tác nhân base Da số các dược

chất đễ bị phân hủy trong môi trường kiềm, bền vững trong môi trường pH

hơi acid Sự có mặt của nước trong dung dịch hoặc trong không khí ầm tham gia tich cực vào phản ứng thuỷ phân

Để hạn chế sự thủy phân có thể áp dụng một số phương pháp như: chọn

pH tối ưu, sử dụng chất điều chỉnh pH, thay đổi hằng số điện môi, tạo phức, dùng chất diện hoạt làm tăng độ tan

b Oxy héa

Dược chất có các nhóm chức như: phenol, catechol, ether, thiol, nitrit dé

bị oxy hóa Sự oxy hóa là quá trình lẫy đi các nguyên tử tích điện âm Nhiều

quá trình oxy hóa dược chất là các phản ứng chuỗi, dây chuyền, xảy ra dưới

tác động của oxy, đôi khi là phản ứng tự oxy hóa được khởi động bằng một

lượng rất nhỏ của các tạp chất, vết ion kim loại Các tác nhân thúc đây quá

12

trình oxy hóa là oxy không khí, nhiệt, ánh sáng, vết kim loại, tạp chất Các

gốc tự do đóng vai trò chuỗi các phản ứng phân hủy

Một số biện pháp cơ bản có thê áp dụng đề hạn chế sự oxy hóa, nâng cao

độ ôn định của thuốc như: Tránh tác động của oxy trong quá trình pha chế, đóng gói, dùng các chất chống oxy hóa

c Chuyển hóa đẳng phân

Nhiều được chất có thể bị chuyển hóa đồng phân quang học hoặc đồng phân hình học Sự chuyển hóa đồng phân có thê làm thay đổi tác dụng dược

lý, gây ra các tác dụng không mong muốn hoặc làm giảm tác dụng điều trị

Do đó sự chuyển hóa đồng phân được cơi là sự phân hủy thuốc Các acid và base thường làm xúc tác cho hầu hết các phản ứng chuyển hóa đồng phân

epimer

d Phan húy do ánh sáng

Nhiều dược chất có nhân phenoth1azin, các hydrocarbon có nhân thơm, có

đị vòng aldehyd, ceton nhạy cảm với ánh sáng, bị phân huỷ nhanh khi có tác

động của ánh sáng

c Sự loại nước trong cầu trúc hoá học và sự mất nước kết tinh trong tinh thé

Quá trình loại đi phân tử nước trong phân tử được chất thường tạo dây nối

đôi liên hợp tham gia vào sự cộng hưởng điện tử với các nhóm chức liền kề trong phân tử, là quá trình phân huỷ hoá học, như trường hợp phân huỷ đối véi prostaglandin, tetracyclin

Hiện tượng mất nước kết tỉnh trong tính thể của một số dược chất như theophylin hydrat hoặc ampicillin trihydrat, không tạo ra liên kết hoá học mới nhưng thường làm thay đôi cấu trúc tỉnh thể của thuốc Dược chất ở dang khan nước và dạng kết tỉnh ngậm nước có độ tan rất khác nhau, thường ở

dạng khan nước có độ hoà tan tốt hơn Khi chuyển dạng khan nước sang dạng

ngậm nước sẽ ảnh hưởng lớn đến tốc độ hấp thu được chất từ dạng bào chế

13

Sự biến đổi làm cho thuốc không đạt chỉ tiêu độ hoà tan đã quy định theo tiêu

chuẩn được cơi như thuốc bị phân huỷ

ƒ Các tương tác hóa học, tạo phức chất, polyme hoá

Các tương tác hóa học giữa hai hay nhiều được chất cùng có trong chế phẩm thuốc hoặc tương tác giữa dược chất với tá dược, các chất phụ trợ khác

thường xảy ra và làm thay đổi tác dụng điều trị của thuốc

Sự polyme hoá là quá trình kết hợp hai hay nhiều phân tử được chất tạo ra một phân tử phức hợp Đã có công trình nghiên cứu cho thấy có sự polyme

hoá xảy ra trong dung dich natri ampicillin đậm đặc Một phân tử mở vòng |[Ì-

lactam để kết hợp với mạch nhánh của một phân tử khác tạo ra một dimer

Quá trình này có thê tiếp tục tạo ra polyme lớn hơn Các polyme được tạo ra

do quá trình phân huỷ là một trong những tác nhân dẫn đến phản ứng mẫn cảm của penmicillin trên người

1.3.1.2 Phân hủy vật lý

a Chuyển thể đa hình

Đa hình là hiện tượng cùng một hợp chất nhưng có thẻ tồn tại đưới nhiều

dạng tinh thể do quá trình kết tinh sử dụng dung môi, pH, nhiệt độ khác nhau

Các thê đa hình này có độ tan, tốc độ tan và hoạt tính sinh học mạnh yếu khác

nhau Như vậy, sự chuyển thể đa hình tuy không làm thay đổi cấu trúc hoá

học của được chất nhưng làm thay đôi các đặc tính vật lý quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu lực điều trị của thuốc

Các thể đa hình của được chất khác nhau về năng lượng kết tinh, do đó

cũng khác nhau về độ ôn định Ví dụ insulin và cyclophosphamid ở dạng kết

tinh bền vững hơn nhiều so với dạng vô định hình

Trong quá trình sản xuất và bảo quản thuốc, các yếu tố nhiệt độ, dung môi, lực nén có thê tác động làm cho chất chuyển thể đa hình

14

b Bay hoi

Một số được chất đễ bay hơi ở nhiệt độ phòng có thé bay hoi ra ngoai qua

dé bao gói làm giảm hàm lượng thuốc Đó là các tỉnh dầu, este, ceton, alcol

phân tử lượng nhỏ

c Thay đổi các tính chất cơ lý, cấu trúc hoá lý của dạng bào chế

Đối với thành phẩm bào chế, ngoài các chỉ tiêu chất lượng về hoá học như

định tính, định lượng được chất, giới hạn sản phẩm phân huỷ còn có quy

định về các chỉ tiêu vật lý, hoá lý của dạng thuốc: độ rã, độ hoà tan đối với

viên nén, nang thuốc; độ tan chảy đối với thuốc đặt; độ trong đối với dung dịch thuốc, kích thước tiêu phân phân tán trong hỗn dịch, nhũ tương, thuốc

phun mù Trong quá trình bảo quản, lưu thông, phân phối, theo thời gian,

một số tính chất vật lý, hoá lý của dạng thuốc có thê bị biến đổi, không đạt các chỉ tiêu quy định theo tiêu chuẩn chất lượng

d Phân huỷ do vi khuẩn, nắm mốc

Sự phát triển của vi khuẩn, nắm mốc trong chế phẩm có thể làm cho thuốc không đạt các chỉ tiêu về độ vô khuẩn, nội độc tố, chí nhiệt tố, đồng thời cũng

là nguyên nhân phân huỷ được chất, làm giám hàm lượng, thay đổi hình thức

thúc đây nhanh tốc độ phân hủy, rút ngắn thời gian theo dõi, đánh giá để dự

báo tuổi thọ của thuốc Phải đảm bảo nguyên tắc là nhiệt độ lão hóa cấp tốc

không làm thay đổi cơ chế phân hủy thuốc

Dựa vào phương trình Arhenius, bằng thực nghiệm lão hóa cấp tốc người

ta có thê dự đoán chính xác hơn về tuôi thọ của thuốc trên cơ sở xác định mức

độ suy giảm hàm lượng được chất

1.3.2.2 pH

pH cua dung dich thuốc ảnh hưởng lớn đến độ ôn định của thuốc, sự thay

đổi pH có thê làm tăng hay giảm tốc độ phân hủy được chất, đôi khi làm thay

đối cơ chế phân hủy được chất

1.3.2.3 Lực ion trong dung dịch

Tốc độ phản ứng có thể chịu ánh hưởng của lực ion theo phương trình sau:

logK =logK, + ˆ 02Z,Zz„V

Trong đó: a, Zp là điện tích các ion

L: là lực 1on (một nửa của tong bình phương điện tích các 1on có mặt trong dung dịch.)

K là hằng số tốc độ phân huỷ

Kạ là hằng số tốc độ ở độ pha loãng vô cùng

1.3.2.4 Ảnh sáng, độ ẩm và đồ bao gói

Sự có mặt của nước trong hàm âm của thuốc cũng như trong không khí

thúc đây quá trình thủy phân, tương tác giữa được chất và tá được trong dạng

thuốc rắn và là tác nhân chính gây phân hủy thuốc Ánh sáng có tác động đến

thuốc trong điều kiện có tác động cao hơn mức độ bình thường ở điều kiện

thực Mục đích của lão hóa cấp tốc là xác định các thông số động hóa học của

quá trình phân hủy, từ đó tính toán, dự báo tuổi thọ của thuốc

1.3.3.2 Phương pháp thử dài hạn

Phương pháp thử dài hạn là thử nghiệm bảo quản thuốc trong điều kiện

thực, toàn bộ các chỉ tiêu chất lượng theo tiêu chuẩn đều được đánh giá kéo

dài theo thời gian đến khi thuốc không còn đáp ứng chất lượng đề ra Thử nghiệm dài hạn có ý nghĩa xác định chính xác tuổi thọ, thời hạn sử dụng của

thuốc

Để có thể tiến hành thử nghiệm dài hạn phù hợp với điều kiện khí hậu

thực, thuận lợi cho việc lập kế hoạch nghiên cứu độ ôn định, chọn điều kiện bảo quản, đồ bao gói, người ta chia khí hậu của các nước làm bốn vùng:

- Ving khí hậu I: Vùng ôn đới (ôn hda) 21°C, 45% RH

- _ Vùng khí hậu II: Vùng cận nhiệt đới, lục địa (tương đối âm) 25°C, 60%

RH

- Ving khi hau III : Vùng sa mạc (nóng và khô) 30°C, 35% RH

- Ving khi hau IV : Vùng nhiệt đới (nóng và âm) 30°C, 70% RH

Loại thử ` Thời gian| „ „

Điêu kiện bảo quản „ „ So 16 tôi thiêu

nghiệm tôi thiêu

Với các nước châu Au,

Nhat, My: 25°C + 2°C, 60% | 12 thang | 3 lô

Dai han | + 5% RH

(trong diéu Thuốc có dược chất | kiện thực) | Với các nước Đông Nam Á: bền vững : 2 lô

12 tháng , , 30°C + 2°C, 70% + 5% RH Thuộc có được chất

kém bền vững : 3 lô Qui định chung với các

Theo quy định trên, Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu IV [2]

Chúng tôi đã tham khảo các hướng dẫn chỉ tiết của WHO [27] ICH [17,18], ASEAN [11] và của một số nước trong quá trình xây dựng nội dung nghiên cứu độ ôn định của nguyên liệu altretamin tổng hợp tại bộ môn Hóa hữu cơ trường đại học Dược Hà Nội

18

CHUONG II ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYEN VAT LIEU, THIET B]

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

« Mẫu thử: Nguyên liệu altretamin (hexamethylmelamin) được tong

2.1.2 Nguyên vật liệu

hợp tại Bộ môn Hóa Hữu cơ — Trường Đại Học Dược Hà Nội

Số lô 25052010 Ngày sản xuất: 25/05/2010

Chat chuẩn: Altretamin(hexamethylmelamin) cua hang Aldrich (USA)

Bang 2.1 Mot số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Hóa chất Nguồn gic STT | Héa chit Nguồn gúc

1 Natri Tatrat Merck- Đức | § I, Merck — Duc

3 HCl Merck- Đức | 10 ' (NH¿);CO; Merck — Đức

4 HNO; Merck—Duc | 11 |Thioacetamid | Merck — Dic

5 CH;COOH Merck- Đức | 12 | Glycerin | Merck—Dic

6 CHạCOONa | Merck—Dtc| 13 | Pyridin Merck- Đức

7 SƠ; Merck—- Đức | 14 Methanol Merck — Đức

2.1.3 Thiết bị

chuẩn dùng cho phòng thí nghiệm phân tích

- May sac ky long hiéu nang cao Agilent 1200

- Máy chuẩn độ đo thế 751 GPD titrino Metrohm

(VKN/VL/12.05)

- Can phan tich Mettler AB 204

- Lo nung

- May lac siéu 4m

- Bình định mức, pipet, chén str va dụng cụ thủy tinh đạt tiêu

19

2.2 NOI DUNG NGHIEN CUU

- Kiểm nghiệm nguyên liệu altretamin tông hợp được tại Bộ môn Hóa hữu cơ —- Trường Đại Học Dược Hà Nội

- Theo dõi và đánh giá độ ôn định của nguyên liệu altretamin ở điều kiện thử nghiệm dài hạn: nhiệt độ 30°C + 2°C và độ âm 70% + 5% trong thời gian

15 tháng

2.3 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.3.1 Các chỉ tiêu kiếm nghiệm altretamin

Phương pháp kiểm nghiệm các chỉ tiêu chất lượng được thực hiện theo

USP 32 [26] Các chỉ tiêu đánh giá gồm tính chất (thử bằng cảm quan), định tính (dùng phô hồng ngoại, HPLC), xác định hàm lượng nước (phương pháp

Karl Fisher), tro sulfat, kim loại nặng và định lượng (phương pháp HPLC)

Bang 2.2 Chi tiêu chất lượng của altetamin theo Dược điển Mỹ USP 32 Chỉ tiêu Yêu cầu chit lượng

Tính chất Bột kết tỉnh màu trắng

Phi IR: Pho hông ngoại của chẻ phim phải phù

hợp với phố hồng ngoại của altretamin chuẩn

Định tính Phương pháp HPLC : Trong phản định lượng, trên

sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic có thời gian

lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ dung dịch altretamin chuẩn

Nước Không được quá 1,0%

Tro sulfat Không được quá 0,1 %

Kim loại nặng | Không được quá 0,004 % (40ug/g)

Định lượng Hàm lượng altretamin phải đạt từ 98,0% đến 102,0

(phương pháp HPLC) %, tính theo chế phẩm khan.

20

2.3.2 Phuong phap nghién ciru

a Tinh chat:

Kiểm tra bằng cảm quan: Lấy một lượng bột trải trên một tờ giấy trắng,

dàn đều thành lớp mỏng Quan sát bằng mắt dưới ánh sáng thường

b Định tính:

Phương pháp phố hấp thụ hồng ngoại: Tiên hành theo chỉ dẫn của USP

32 So sánh phô của altretamin thử với altretamin chất đối chiếu

- Chuẩn bị mẫu: Nghiền trộn 1 - 2 mg mẫu thử/ mẫu chuẩn với 0,3 — 0,4

ø bột mịn kali bromid (đã được sấy khô trước đó) Nghiền hỗn hợp thật

mịn và rải đều trong một khuôn thích hợp Nén khuôn có hỗn hợp trên

thành viên trong suốt bằng dụng cụ thích hợp

- _ Ghi phô mẫu thử và mẫu chuẩn đã chuẩn bị ở trên từ 2000 — 400 cm

với điều kiện đo như nhau

- Yêu cầu: Phố IR thu được của mẫu thử và mẫu chuẩn trùng nhau với

cực đại hấp thụ trong phổ của mẫu thử hoàn toàn tương ứng về vị trí tương đối như phố của chuẩn

Phương pháp HPLC: Tiến hành theo chỉ dẫn của USP 32 So sánh thời gian lưu của nguyên liệu altretamin trong dung dịch thử với thời gian lưu của

chất chuẩn trong dung dịch chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký

- _ Yêu cầu: Trong sắc ký đồ của phần định lượng, dung dịch thử cho pic

có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ

dung dịch altrettamin chuẩn

c Kừn loại nặng

Tiến hành: theo chỉ dẫn của USP 32

# Chuẩn bị mẫu thử

Cân khoảng 0,5 ø chế phẩm trong chén sứ, làm âm bằng H;SO¿ và đun nhẹ

cho đến khi chảy hoàn toàn Thêm 2ml HNO¿, 5 giọt H;SO¿ va đun nóng cho

21

đến khi không còn khói trắng bay ra Nung ở 600°C cho đến khi không còn

carbon —› làm nguội —> thêm 4ml HCl 6N — đun cách thủy 15 phút —› bốc

hơi đến cắn Làm âm cắn với 1 giọt HCI, thêm 10ml nước nóng —› để yên 2

phút —› thêm từng giọt NH; 6N cho đến khi có phản ứng kiềm với giấy quỳ

—> pha loãng với nước đến 25ml Điều chỉnh pH 4,0 bang acid acetic IN >

lọc —› rửa chén sứ và giấy lọc với 10 ml nước Kết hợp dịch lọc và pha loãng

với nước thành 40 ml.:

Ong thử: 2ml đệm acetat pH 3,5 + 1,2 ml thioacetamid glycerin + 40 ml

dung dịch thử trên —> pha loãng với nước thành 50 ml, trộn đều và để yên 2

phút

e Ong chimg: 2ml dém acetat pH 3,5 + 1,2 ml thioacetamid glycerin + 40 ml

dung dịch chì 10 10ppm —› pha loãng với nước thành 50 mi, trộn đều và đề

yên 2 phút

Yêu cầu: Mẫu của ông thử nhạt hơn màu của ống chứng

d Tro sulfat

Tiến hành: theo chỉ dẫn của USP 32

Cân khoảng 2g chế phẩm trong chén sứ (đã được nung 600°C trong 30

phút), làm âm bằng 1ml H;SO¿ và đun nhẹ cho đến khi cháy thành than Thêm

1 ml H,SO, và dun cho đến khi hết khói Nung ở 600°C cho đến khi cháy

thành tro Để nguội trong bình hút âm và cân

e Nước

Tiến hành: Thử bằng phương pháp Karl Fisher theo chỉ dẫn của USP 32

Nguyên tắc: Phương pháp đựa trên tác dụng của iot với lưu huỳnh dioxit (SO;) khi có mặt của nước ở môi trường metanol và ptridm trong quá trình

chuẩn độ mẫu thử với thuốc thử Karl Fischer

Xác định đương lượng nước của thuốc thử:

* Neuyén tac: Ding một hóa chất có hàm lượng nước kết tỉnh xác định, sau

22

khi đã sấy ở nhiệt độ qui định đến khối lượng không đổi để loại hết âm, cho

tác dụng với thuốc thử rồi tính ra đương lượng Hóa chất sử dụng là natri

tartrat dihydrat (CaH¿Na;O¿;.2H;O)

ø Tiến hành: Cho một lượng methanol khan (TT) vào cốc chuẩn độ đủ ngập

điện cực platin rồi chuẩn độ bằng thuốc thử Karl Fisher đến điểm dừng Cho nhanh khoảng từ 250 mg đến 350 mg natri tartrat dihydrat đã cân chính xác

vào cốc và chuẩn độ bằng thuốc thử Karl Fisher đến điểm dừng, tính hệ số đương lượng FE (tính bằng mg nước/ml thuốc thử) của thuốc thử theo công thức:

F=2 x(15,02/230,08) x (W/V)

Trong đó:

18,02 và 230,08 là khối lượng phân tử của nước và của natri

tartrat dihydrat;

W là khối lượng natri tartrat dihydrat (tinh bang mg);

V là thê tích của thuốc thử Karl Fishern đã dùng (tính bằng

khoảng 1 phút rồi tiếp tục chuẩn độ bằng thuốc thử Karl Fisher đến điểm

dừng Tính hàm lượng nước X (tính bằng mg) của chế phẩm theo công thức:

X=NxF

Trong đó:

N là thể tích thuốc thử Karl Fisher đã dùng cho lần chuẩn độ sau khi cho chế pham (tinh bang ml);

23

F là hệ số đương lượng nước của thuốc thử Karl Fisher (tinh bang mg/ml)

ƒ Định lượng

Tiến hành: theo chỉ dẫn của USP 32

Nguyên tắc: Định lượng theo phương pháp chuẩn ngoại bằng HPLC So

sánh diện tích pic của mẫu thử với diện tích pic của mẫu chuẩn, từ đó tính được nồng độ các chất trong mẫu thử

Pha mẫu: Dung môi pha mẫu: hỗn hợp methanol — nước (65 : 35)

- _ Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn altretamin trong dung môi pha

mẫu có nồng độ altretamin khoáng 0,025 mg/ml

Chuẩn altretamin (khoa vật lý đo lường — Viện Kiểm nghiệm thuốc TW:

96%): 25 mg pha trong 50 ml dung môi —› lấy 1 ml pha trong 20 ml dung môi

—> dung dịch chuẩn

- Dung dịch mẫu: Hòa tan một lượng chế phẩm trong dung môi pha mẫu

để thu được dung dịch có nồng độ altretamin khoảng 0,025 mg/ml

Thử altretamin: 25 mg pha trong 50 mi dung môi —› lấy 1 ml pha trong 20 ml dung môi —> dung dịch thử

Kết quả: Hàm lương altretamin trong chế phẩm, tính theo chế phẩm khan,

được tính theo công thức:

C,: Néng d6 dung dich tht: (mg/ml);

a: Độ âm (%)

2.3.3 Nghiên cứu độ ỗn định của altretamin

a Điều kiện bảo quản:

Điều kiện thường (nhiệt độ 30°C + 2°C và độ âm tương đối 70% + 5%)

b Thời điểm lấy mẫu:

Mẫu được đánh giá tại các thời điểm 0, 3, 6, 9, 12, 15 tháng kế tử ngày sản

Các chỉ tiêu cần đánh giá: tương tự các chỉ tiêu kiêm nghiệm thành phẩm

tổng hợp và được trình bày trong báng sau: