Đánh giá độ ổn định về thành phần hóa học của vaccin viêm gan b và vaccin viêm não nhật bản sản xuất tại công ty vaccin và sinh phẩm số i (viện vệ sinh dich tễ) Đánh giá độ ổn định về thành phần hóa học của vaccin viêm gan b và vaccin viêm não nhật bản sản xuất tại công ty vaccin và sinh phẩm số i (viện vệ sinh dich tễ) Đánh giá độ ổn định về thành phần hóa học của vaccin viêm gan b và vaccin viêm não nhật bản sản xuất tại công ty vaccin và sinh phẩm số i (viện vệ sinh dich tễ) Đánh giá độ ổn định về thành phần hóa học của vaccin viêm gan b và vaccin viêm não nhật bản sản xuất tại công ty vaccin và sinh phẩm số i (viện vệ sinh dich tễ) Đánh giá độ ổn định về thành phần hóa học của vaccin viêm gan b và vaccin viêm não nhật bản sản xuất tại công ty vaccin và sinh phẩm số i (viện vệ sinh dich tễ) Đánh giá độ ổn định về thành phần hóa học của vaccin viêm gan b và vaccin viêm não nhật bản sản xuất tại công ty vaccin và sinh phẩm số i (viện vệ sinh dich tễ) Đánh giá độ ổn định về thành phần hóa học của vaccin viêm gan b và vaccin viêm não nhật bản sản xuất tại công ty vaccin và sinh phẩm số i (viện vệ sinh dich tễ) Đánh giá độ ổn định về thành phần hóa học của vaccin viêm gan b và vaccin viêm não nhật bản sản xuất tại công ty vaccin và sinh phẩm số i (viện vệ sinh dich tễ) Đánh giá độ ổn định về thành phần hóa học của vaccin viêm gan b và vaccin viêm não nhật bản sản xuất tại công ty vaccin và sinh phẩm số i (viện vệ sinh dich tễ) Đánh giá độ ổn định về thành phần hóa học của vaccin viêm gan b và vaccin viêm não nhật bản sản xuất tại công ty vaccin và sinh phẩm số i (viện vệ sinh dich tễ) Đánh giá độ ổn định về thành phần hóa học của vaccin viêm gan b và vaccin viêm não nhật bản sản xuất tại công ty vaccin và sinh phẩm số i (viện vệ sinh dich tễ) Đánh giá độ ổn định về thành phần hóa học của vaccin viêm gan b và vaccin viêm não nhật bản sản xuất tại công ty vaccin và sinh phẩm số i (viện vệ sinh dich tễ)
Trang 1BO GIAO DUC VA DAO TAO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYÊN THỊ THU HẰNG
ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH VỀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC
CUA VACCIN VIEM GAN B VA VACCIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN SAN XUAT TAI CONG TY VACCIN VA SINH PHAM SO 1,
VIEN VE SINH DICH TE TRUNG UONG
CHUYEN NGANH: KIEM NGHIEM THUOC - DOC CHAT Mã số: 60 73 15
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Tử An TS Đồ Thủy Ngân
Trang 2Loi eam on
Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến:
Trường Đại học Dược Hà nội Phịng Đào tạo Sau Đại học đã giúp đỡ tạo điều
kiện và hồn tất các thủ tục cho tơi hồn thành và bảo vệ luận văn
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Cơng ty Vaccin và Sinh phẩm số 1, phịng Kiểm tra chất lượng sản phẩm đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tơi trong suốt quá
trình học tập, thực tập và hồn thành luận văn
Trong quá trình học tập và hồn thành luận văn, tơi đã nhận được sự dạy dơ và giúp đỡ rất nhiệt tình của các thầy cơ giáo, bạn bè và đồng nghiệp Cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:
PGS TS Trần Tử An, Chủ nhiệm bộ mơn Hĩa phân tích - độc chất, trường Đại
học Dược Hà nội, người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và giúp đỡ tơi trong suốt quá trình học tập và hồn thành luận văn
TS Đỗ Thủy Ngán, Trưởng phịng Kiểm tra chất lượng sản phẩm, Cơng ty
Vaccin và Sinh phẩm số 1, người thây đã hướng dẫn cho tơi các kỹ thuật kiểm dinh vaccin và tạo mọi điều kiện cho tơi trong suốt quá trình học tập, cơng tác và
hồn thành luận văn
GS TSKH Nguyên Thu Vân, Giám đốc Cơng ty Vaccin và Sinh phẩm số l da
tạo mọi điều kiện cho tơi trong quá trình học tập và hồn thành luận văn
Trang 3- _ Các đồng nghiệp của tơi ở Phịng Kiểm tra chất lượng sản phẩm, Cơng ty Vaccin
và Sinh phẩm số 1, đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn tốt nghiệp
Tơi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới bố, mẹ, chồng và các con đã động viên và tạo những điều kiện tốt nhất cho tơi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa
học
Trang 4MUC LUC
; / Trang
ee I eee eeeeeseeeeereraroensgoetrerosnntrhoaotinoseshsfeote i
DANH MUC BANG 0 .cccccceccccceeececeeeeusevececsuseueeesseseeneceseeseeeeseeen ti
ISU anecnvoei BC t0000(0 I2S00AG95438020008830015088G0800 2/4 iid
es see eens I
ChiWÏl TYNGGIXẾ «.esessenieeeisiennnenniosdieoroududiramisiniodhsee 3 1.1 Dịch tễ học viêm gan B và VYNNB 3 1.1.1, K01 R0G/4I0TN PHI ceudebikviioGobsCDLEA4C444/006/01/40536410606n 3 Lda) Diet NO v1 LÃ nung ungntu uc u Ai Giá d Gì g00100898081400k):48126 4 1 2 Tổng quan về vaccin viêm gan B 7 1.2.1 Vaccin viêm gan B điều chế từ huyết tương người 8 12.2 Vacca viet gan Brat t6 ROG wii scccccscecauecsseckswowmmersecmens 10 1.3 Tone quan vé vacein VINNIE cis cicsseisinscssunccwensreneenens — 12
LẠ, V¿6ip VỆ (HN 6L Hồi lŨ lo CỔ geeenaeesesexsusean 12 1.3.2 Vaccin VNNB bấf hoạt từ tế bào thận chuột đất tiền phát 13
1.3.3 Vaden VNB sone giáff:đƠG ÍWG::.c ccccccacaokicgcokssasaeuasees 14 lu L 6s Yneoin:HUHVHEETH ducosvaedoipobiiidiosecbis66)504451666686 686 14 1.4 Kiểm tra chất lượng vaccin 15 1A), WE GA GUNS ceo ses ees 0L 0V A KG G0 SESidsssweesg 15 lai, Erfg Đ s0 vất DEN saeatddgtoodeoitoiveti00i841042160033001040 006 15 1.4.3 Kiểm tra lý hĩa học < s2 16 1.5 Ý nghĩa và cơng dụng của các thành phần hố học trong
vaccin viêm gan B và vaccin VYNNB l6
FO ngu nnoan21002500000000080881800 08806 16
125 PID sự nay va niosoisebici6ã01.L94i06.o63043/0à186106ã 04601 4a r810103608640-33s4/108 8GB 16
Trang 5Chuong 2
Chuong 3
1.5.4 Formaldehyd .- -<.<Ă cà sằ
TT Lái rioeilieiie@Ằitiessae
1.6 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng vaccin viêm gan B và vaccin YNNH về thành phần hãa NH€ sec co co ooocŸo
1.7 Phương pháp nghiên cứu đánh giá độ ổn định về thành phan
bí Hữc c0 TT acc cưa inch ïgh S6SkceGslsisaiziE4g018-xxze 1.7.1 Phương pháp thử độ ổn định cấp tốc của thuốc 1.7.2 Phương pháp nghiên cứu độ ổn định thực của thuốc
VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
LE ee an bong hanh} Giàn GtVua4GbdvA
mi Vt HOt BH II TH TU toaadoidddo dd dttigutaSGacNGlbebiseiGadaqgsuesss ids Men ance Inna Dee Tere Lie TEP l¬H¬— ca ecddedeessckioliSioeiavauueÁ
2i5::E HUHE BH“—U EHW CỮU tiiu566ci1áx11221000005604Á45k64200á66e
2.5.1, Phone phap pha che duiie đỊCH cáccccccvciivce621406661016601Ä6610A 2.3.2 Phương pháp kiểm tra các thành phần hod hoc trong vaccin su nho ẤT EKÃ can ggu ngàn g0 t02N00 S802010106480G3X0G000884GU-8gg tgiSt00/0Đ063380058 Piste SDE HH DO NGHE VD ae eikesvesdsadseeacacessee 2.3.3.3 Định lượng chất bão quan thiinerosal : -:- : ‹:
2.3.4.4 Dob liens Jorma dehy 100 GU «sis cccvsserinananrowicawsseenecass
Fede Fh, Le eer ii ru ca or tt ky rtrya
KET QUA NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN . -scc sec
3.1 Xác định chỉ tiêu chất lượng về thành phần hĩa học của các lỗ vaccin viêm gan D và VN co ieeeea
3.1.1 Xác định chỉ tiêu chất lượng về thành phần hố học của các lơ
REE I 0: Bố hố ốc
Trang 6“ ee a 2 x ` 2 + > = ea
3.2 Đánh giá độ ơn định về thành phan hĩa hoc cua vaccin viém gan B và vaccin VNNB trong thời hạn sử dụng 39 3.2.1 Đánh giá độ ổn định về thành phân hĩa học của vaccin viêm gan B trong thời hạn sử dụng -.-. . <«- 39
3.2.2 Đánh giá độ ốn định về thành phần hĩa học của vaccin VNNB
CA Chie Enh.ED UNỖ saeseg chaob1401zepebo5iEptieaG0DGEE0669224686350606300:6084 52 DI ÊH HaaeeeeseroaresaresrrrearreneernaronrsatorsroArotoeggerePitesgrra „ 64 3.3.1 Về phương pháp kiểm định các thành phần hố học trong HT huugdbxgtsotiidiaiGi021200010042488010/6001000018039301gNGEL1AG0)/20020606100084000/ã036ã 64 1.9 TH: (fy Pi0 HT gu ndueioecoitibcsosbsdoegiloapsuoottansisuaa 65
Chuong 4 KẾT LUẬN 22S2 66
Trang 7aa ADN CHO CTTCMR D ELISA FDA GMP HBV HBsAg HBeAg HPLC Na,EDTA kD PEG PHK
CAC CHU VIET TAT TRONG LUAN VAN
Amino acid (axit amin)
Acid desoxyribonucleic (axít ribơnuclêIc)
Chinese hamster ovary
(tế bào trứng chuột đất vàng Trung quốc) Chương trình tiêm chủng mở rộng
Dalton
Enzyme-linked immunosorbant assay (thử nghiệm miễn dich gan men) Food and Drug Administration
(cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm) Good manufaturing practice
(thực hành sản xuất tốt) Hepatitis B Virus
(virút viêm gan B)
Hepatitis B surface antigen
(Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B) Hepatitis B e antigen
(Kháng nguyên e virút viêm gan B)
High performance liquid chromatography (sắc ký lỏng hiéu nang cao)
Muối dinatr1 của acid ethylendiamin tetracetic kiloDalton
Polyethylene glycol Primary hamster kydney
Trang 8QC SD SDS PAGE TCA TC TCYTIG TIKDQGVX&SPYH VABIOTECH VNNB VVSDTTU Quality Control
(kiểm sốt chất lượng) !
Standard deviation
(độ lệch chuẩn)
Sodium-dodecyl-sulfat
Polyacrylamide gel electrophoresis
(dién di trén gel polyacrylamide)
Trichloacetic acid Tiêu chuẩn cơ sở
Tổ chức y tế thế giới
Trung tâm kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y học Vaccine and biological N°] company
Cơng ty Vaccin và Sinh phẩm số 1
Viêm não Nhật bản
Trang 9Bang 1.1 Bang 1.2 Bang 3.3 Bang 3.4 Bang 3.5 Bang 3.6 Bang 3.7 Bang 3.8 Bang 3.9 Bang 3.10 Bang 3.11
DANH MUC BANG '
Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng vaccin viêm gan B về thành phần hĩa GIG cv vs hái Du 5i: ERGEGQGNGGGIGGGNRHiNG: TNGRRGRUGESRSEIENLGSQSN(GitisĂEB Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng vaccin VNNB về thành phân hĩa Kết quả kiểm tra về thành phần hố học của 21 lơ vaccin viêm gan B Kết quả kiểm tra về thành phần hố học của 30 lơ vaccin VNNB Kết quả kiểm tra hàm lượng protein của 4 lơ vaccin viêm gan B ở các thời điểm khác nhau: sau sản xuất, sau 6-12-18-24-30-36 tháng Kết quả kiểm tra hàm lượng formaldehyd của 4 lơ vaccin viêm gan B
ở các thời điểm khác nhau: sau sản xuất, sau 6-12-1§-24-30-36 CN HỮ bu auugdicgitiiLaxt01020ii80640ag3680án673.616065301106642-414618)1908141196G1400864
Kết quả kiểm tra hàm lượng thimerosal của 4 lơ vaccin viêm gan B ở
các thời điểm khác nhau: sau sản xuất, sau 6-12-18-24-30-3ĩ6
Kết quả kiểm tra hàm lượng nhơm của 4 lơ vaccin viêm gan B ở các thời điểm khác nhau: sau sản xuất, sau 6-12-18-24-30-36
Kết quả kiểm tra hàm lượng nhơm của 4 lơ vaccin viêm gan B ở các
thoi điểm khác nhau: sau sản xuất, sau 6-12-18-24-30-36
tháng a se cer ee aa a aaa Ne irs eae eisai
Kết quả kiểm tra hàm lượng protein của 5 lơ vaccin VNNB ở các thời điểm khác nhau: sau san xuat, sau 6-12-18-24 tháng sau sản xuất Kết quả kiểm tra hàm lượng formaldehyd của 5 lơ vaccin VNNB ở các thời điểm khác nhau: sau sản xuất, sau 6-12-18-24 tháng sau sản
Trang 10Bang 3.12
Bang 3.13 Bang 3.14
Kết quả kiểm tra hàm lượng thimerosal của 5 lơ vaccin VNNB ở các
thời điểm khác nhau: sau sản xuất, sau 6-12-18-24 thang sau sản
MUL cscs cu Gia Sư AGAR
Kết quả kiểm tra pH của 5 lơ vaccin VNNB ở các thời điểm khác nhau: sau sản xuất, sau 6-I2-I§-24 tháng sau sản xuất Quy định của DĐVN TII về phương pháp xác định các chỉ tiêu thành Bhs hos HOC TONE VHC ance cn wena meres
58
61
Trang 11Hinh 1.1 Hinh 1.2 Hinh 1.3 Hinh 3.4 Hinh 3.5 Hinh 3.6 Hinh 3.7 Hinh 3.8 Hinh 3.9 Hinh 3.10 Hinh 3.11 Hinh 3.12 Hinh 3.13 Hinh 3.14 Li
DANH MUC HINH -
Trang Sơ đơ chu trình truyền bệnh VNNB trong tự nhiên 6 Quy trình sản xuất vaccin viêm gan B làm từ huyết tương người của cơng ty VABIOTECH, Viện VSDTTU - - - 9 Sơ đồ BẾP phù kháng Hgưyên lÊU EElicdcccsi ii G06 002946469096695:308204ã4 19
Sơ đồ kiểm sốt chất lượng biểu diễn kết quả kiểm tra pH của 21 lơ
ACEI VIC PEO say ngnkihnnoetitE10010008084000003109000014/4080n830 040031 06gu8— 22T Sơ đồ kiểm sốt chất lượng biểu diễn kết quả kiểm tra hàm lượng bfotein của 21 lồ vacem viêm EẠH D coeoaaindoaaeiasedrvsaanas — 32 Sơ đồ kiểm sốt chất lượng biểu diễn kết quả kiểm tra hàm lượng thimerosal eta 21 lĩ:vnecpin/viƯm: HHH: l kceceaeeceescbosedanbeeaiedooi 0
Sơ đồ kiểm sốt chất lượng biểu diễn kết quả kiểm tra hàm lượng 33
phi g8 71 1ð vi Ecit( ViAH1T BH goi tpi0060054610010008y95⁄66662951448 Sơ đồ kiểm sốt chất lượng biểu diễn kết quả kiểm tra hàm lượng 34 formaldehyd của 2L lơ vaccin viêm gan B
Sơ đồ kiểm sốt chất lượng biểu diễn kết quả kiểm tra hàm lượng protein trons che IB vácoiml VN ccceeadiivsisvkG2)06ã560ã 088 a} Sơ đồ kiểm sốt chất lượng biểu diễn kết quả kiểm tra pH của các lơ
nao eeeoetdatoeoo 0034161600100 60036400104003206)95/3/0)099080040068460 37
Trang 12Hinh 3.15 Hinh 3.16 Hinh 3.17 Hinh 3.18 Hinh 3.19 Hinh 3.20 Hinh 3.21 Hinh 3.22 Hinh 3,23 Hinh 3.24 Hinh 3.25 Hinh 3.26 Hinh 3.27 Hinh 3.28 Hinh 3.29
Hàm lượng protein của vaccin viêm gan B lơ 031002R trong thời hạn KÍP QƯỚỮ on secibetdabeioatoi4G218068002 |
Hàm lượng protein của vaccin viêm gan B lơ 041202R trong thời han
Hàm lượng formaldehyd của vaccin viêm gan B 16 010102R trong
KHƠI hạ SƯ Ế cá seeoccuaciraoiogdicaeiisncbcAgiigSAtai8gi8g0tg010i61640di68480801016u30u63 Hàm lượng formaldehyd của vaccin viêm gan B lơ 020902R trong
BE PN DÐ LH iu rao ra ro Ong se
Hàm lượng formaldehyd của vaccin viêm gan B lơ 031002R trong
(HƠI Ha:SÚ HƯN vsescvsebeecbobx6xs4ss6 6646 i64406696409650066631600050/264Á6006 Hàm lượng formaldehyd của vaccIn viêm gan B lơ 041202R trong thời hạn sử dụng - - Hàm lượng thimerosal của vaccin viêm gan B lơ 010102R trong thời HAH SH dan hang Hbci400144AS950/2EGEGEASNGEGEGXSS.4.VVEXLSS-)BPB E3 Ham lượng thimerosal của vaccin viêm gan B lơ 020902R trong thời hạn sử dụng c c n2 TH ng SH HH kh cv sáu Hàm lượng thimerosal của vaccin viêm gan B lơ 031002R trong thời PAN STOWE scscarss emcee
Hàm luong thimerosal cla vaccin viêm gan B lơ 041202R trong thời hạn sử dụng -
Hàm lượng nhơm của vaccin viêm gan B lơ 010102R trong thời han Hàm lượng nhơm của vaccin viêm gan B lơ 020902R trong thời hạn Hàm lượng nhơm của vaccin viêm gan B lơ 031002R trong thời hạn BE no srddtrixaealiedestaeoatkrdee
Hàm lượng nhơm cua vaccin viém gan B 16 041202R trong thoi han Độ pH của vaccin viêm gan B lơ 010102R trong thời hạn sử dụng
Trang 13Hinh 3.30 Hinh 3.31 Hinh 3.32 Hinh 3.33 Hinh 3.34 Hinh 3.35 Hinh 3.36 Hinh 3.37 Hinh 3.38 Hinh 3.39 Hinh 3.40 Hinh 3.41 Hinh 3.42 Hinh 3.43 Hinh 3.44 Hinh 3.45 LH
Độ pH của vaccin viêm gan B lơ 020902R trong thời hạn sử dụng Độ pH của vaccin viêm gan B lơ 031002R trong thời hạn sử dụng
Độ pH của vaccin viêm gan B lơ 041202R trong thời hạn sử dụng
Hàm lượng protein của vaccin VINNB lơ 2330603A trong thời hạn sử Hàm lượng protein của vaccin VNNB lơ 2340803A trong thời hạn sử
1050 =ỐƠƠ
Hàm lượng protein của vaccin VINNB lơ 2350903A trong thời hạn sử
Hàm lượng protein của vaccinn VNNB lơ 2370903 trong thời hạn sử NƯỚ tusavpaicazsn
Hàm lượng formaldehyd của vaccin VNNB lơ 2330603A trong thời hồn ii 6 TT canaesouebeieaaensisi6S00009005000020000J00001105/000000003006000006184
Hàm lượng formaldehyd của vaccin VNNB lơ 2340803A trong thời
Hữïi ST HE phdag tot GU0G0UIGEGVNNGIEXSMHSGOIIGGGMGXGGEPlSlzyRgisalasst
Hàm lượng formaldehyd của vaccin VNNB lơ 2350903A trong thời
hạn sử dụng .-. co Ằ Ăn nhe key Ham luong formaldehyd cua vaccin VNNB 16 2360803 trong thời 1 SUE CR ee esc ccowere corp eREr ERNE Ham lượng formaldehyd của vaccin VNNE lơ 2370903 trong thoi
NA SO i deeb arecenee me ein eS
Ham luong thimerosal cla vaccin VWNNB 16 2330603A trong thời
hạn sử dụng - :‹‹ ‹‹ - cc c¿ t
Hàm lượng thimerosal của vaccnn VNNB lơ 2340803A trong thời H10 GI Š coga ta go tt G1 A144606864 xa 6senaSiEA80xã0144SVKSSSEGRRESSEB Ham luong thimerosal cua vaccin VNNB 16 2350903A trong thời PO SO oo asicccaaxsneeceanrennnsena nomena innmeanmmnemmeeemnseenapees
Trang 14Hinh 3.46 Hinh 3.47 Hinh 3.48 Hinh 3.49 Hinh 3.50 Hình 3.5] Hình 3.52
Hàm lượng thimerosal cla vaccin VNNB lơ 2360803 trong thời hạn Hàm lượng thimerosal của vaccin VNNB lơ 2370903 trong thời hạn
Độ pH của vaccin VNNB lơ 2330603A trong thời hạn sử dụng
Độ pH của vaccin VNNB lơ 2340803A trong thời hạn sử dụng
Dé pH cua vaccin VNNB 16 2350903A trong thoi han st dung
Dé pH cua vaccin VNNB 16 2360803 trong thời hạn sử dụng
Trang 15DAT VAN DE
Viêm gan virút B (HBV) và viêm não Nhật bản (VNNB) là những căn bệnh
hiểm nghèo, gây hậu quả xấu như tử vong hoặc để lại di chứng khơng ít đối với cộng
đồng dân chúng trên thế giới nĩi chung và nhiều nước thuộc Đơng Nam Á, trong đĩ cĩ Việt nam nĩi riêng Hiện nay chưa cĩ một phương pháp điêu trị hữu hiệu nào ngồi việc dự phịng bằng vaccin
Được sự chuyển nhượng kỹ thuật của Nhật bản, cơng ty Vaccin và Sinh phẩm
số I (VABIOTECH) đã sản xuất thành cơng và hiệu quả vaccin viêm gan B làm từ
huyết tương người và vaccin VNNB bất hoạt, tinh khiết từ não chuột theo phương pháp hĩa lý của Takaku Năm 1997, ca hai vaccin này đã được đưa vào Chương
trình Tiêm chủng mở rộng (CTTCMR), đáp ứng phịng bệnh tích cực cho trẻ em Từ năm 2000 đến nay, vaccin viêm gan B tái tổ hợp cũng đang được tiến hành nghiên cứu sản xuất thử nghiệm Việc sản xuất thành cơng vaccin viêm gan B tái tổ hợp sẽ đáp ứng được nhu cầu sử dụng vaccin phịng bệnh ngày càng lớn trong nhân dân
Bên cạnh nghiên cứu sự ổn định của quy trình sản xuất, việc nghiên cứu đánh
giá chất lượng của vaccin cũng được tiến hành một cách thường xuyên Ngồi việc
kiểm tra tính vơ khuẩn, chất gây sốt, an tồn, cơng hiệu thì việc kiểm tra các thành
phan hĩa học được phếp cĩ trong vaccin cũng hết sức quan trọng nhằm khẳng định việc thực hành quy trình sản xuất tốt (GMP) trong sản xuất, xác định được các chỉ số hĩa học cĩ trong vaccin đạt tiêu chuẩn cho phép của TCYTTG và TIKDGGVX&SPYH để đưa vào sử dụng những lơ vaccin đâm bảo chất lượng
Trong quá trình sản xuất cũng như trong bảo quản vaccin, nhà sản xuất phải
dùng tới một số hĩa chất như thimerosal để bảo quản vaccin, formaldehyd dé bat
hoạt, nhơm hydroxyd để hấp phụ kháng nguyên, Một thành phần hĩa học quan
trọng nữa cần xác định là protein tồn phần, nhằm đánh giá độ tinh sạch của quá trình tinh chế kháng nguyên Đây là những kháng nguyên tinh khiết, đặc hiệu gây
đáp ứng miễn dịch bảo vệ cho những đối tượng được tiêm vaccin viêm gan B và
Trang 16Tuy nhiên, thành phần protein trong vaccin cĩ cấu trúc phân tử phức tạp, dễ bị biến tính do các tác nhân lý, hĩa như nhiệt độ, thời gian, và cho đến nay chưa
cĩ một nghiên cứu đánh giá độ ổn định về thành phần hĩa học trong vaccin viêm
gan B và VNNB để đánh giá chất lượng về mặt hĩa học của hai loại vaccin này Vì vậy, việc nghiên cứu đề tài: “Đánh giá độ ổn định về thành phần hĩa
học của vaccin viêm gan B và vaccin VNNB sản xuát tại Cơng ty Vaccin và Sinh
phẩm số I, Viện Vệ sinh địch tế trung ương” là cần thiết, cĩ tính thực tiễn cao Mục tiêu của đề tài là:
1 Xác định thành phần hĩa học của các lơ vaccin viêm gan B và vaccin VNNB
được sản xuất tại cơng ty VABIOTECH từ năm 2001 đến 2005 theo tiêu chuẩn của
TTKĐQGVX&SPYH
Trang 17Chuong 1
TONG QUAN 1.1 DICH TE HOC VIEM GAN B VA VNNB
1.1.1 Dịch tê học viêm gan B
Theo thống kê dich té hoc thì trên thế giới cĩ khoảng 2 tỷ người bị nhiễm
virút viêm gan B và khoảng 2 triệu trong số 350 triệu người mang virút mạn tính bị chết hàng năm do xơ gan và ung thư gan nguyên phát gây ra bởi virút viêm gan B
Việt nam là nước nằm trong vùng cĩ nguy cơ cao về nhiễm HBV Theo các
tác giả khác nhau [4],[5].[9],[13] thì tỷ lệ dân chúng mang HBsAg trong cộng đồng chiếm 15-26% Đặc biệt là phương thức lây truyền viêm gan B cĩ hên quan đến sự
lây truyền qua mau, lay truyền qua dường tình dục, lây truyền từ mẹ sang con trong quá trình mang thai và sinh đẻ là những yếu tố nguy cơ rất quan trong gay xo gan, ung thư gan, viêm gan mạn tính ở Việt nam
* Cơ chế và đường lây truyền:
Nguy cơ lây truyền viêm gan quan trọng nhất cĩ liên quan đến sự lây truyền qua đường máu Vào đầu những năm 1930, người ta thấy cĩ sự liên quan giữa viêm gan với việc sử dụng hỗn hợp huyết thanh người trong giai đoạn phục hồi để dự phịng các bệnh như sởi, quat bị Năm 1940, hơn 45000 lính Mỹ bị nhiễm viêm gan B sau khi tiêm vaccin bệnh sốt vàng sống giảm độc lực cĩ chứa huyết thanh người
thường làm chất ổn định Trong chiến tranh thế giới lần thứ II, do gia tăng việc sử dụng máu và các sản phẩm của mấu trong điều trị và dự phịng đã dẫn đến tần số
nhiễm HBV cao [12]
Các loại dụng cụ y tế, phẫu thuật, nha khoa, bơm kim tiêm, kim chích cũng
là những yếu tố lây truyền viêm gan B Rất nguy hiểm nếu sử dụng những dụng cụ
Trang 18dụng cụ xăm mình, xỏ lõ tai, châm cứu, dao cạo râu, bàn chải đánh răng, dụng cu
tiêm chích ma tuý mà cịn dính máu bị nhiễm
Một yếu tố nguy cơ nữa cũng được nghiên cứu rất nhiều là khả năng lây nhiễm qua đường tình dục Cơ sở của nĩ là sự cĩ mặt cua HBsAg trong nước bọt,
tỉnh dịch, dịch tiết âm dạo, máu hành kinh của những người mang HBV Cĩ một tỷ
lệ cao người cảm thụ khi cĩ quan hệ tình dục với những người bị nhiễm HBV cấp tính hoặc người mang HBsAg mạn tính Cĩ sự lây truyền HBV ở những người đồng
tính luyến ái và khác giới song con đường và cơ chế lây truyền thì chưa được xác định một cách rõ ràng
Sư lây truyền từ mẹ sang con cĩ thể xảy ra trong quá trình mang thai và sinh đẻ Những bà mẹ mang HBV nhất là mang đồng thời cả hai loại kháng nguyên
HBsAg và HBeAg hoặc người mẹ bị nhiễm HBV cấp tính trong giai đoạn cuối của
thời kỳ mang thai là nguy cơ rất lớn của sự lây truyền dọc Những trẻ em được sinh ra từ những bà mẹ này đều cĩ khả năng trở thành người mang HBV mạn tính tồn tại trong nhiều năm thậm chí suốt đời Sự lây truyền cĩ thể xảy ra qua nhau thai, qua các sang chấn trong quá trình chuyển da, qua phơi nhiễm của trẻ với dịch tiết của mẹ trong ống sinh Sự lây nhiễm trong tử cung trước khi sinh khơng phải là chủ yếu, chỉ cĩ khoảng 5% những đứa trẻ cĩ nguy cơ cao bị nhiễm theo con đường này
Hiện nay chưa cĩ một phương pháp điều trị hữu hiệu nào ngồi việc dự phịng bằng vaccin Trên thế giới cĩ 2 loại vaccin đang được sử dụng rộng rãi là vaccin viêm gan B làm từ huyết tương người mang một lượng lớn HBsAg và vaccIn
viêm gan B tái tổ hợp ADN [12],[14] 1.1.2 Dịch tế học VNNB
VNNB là một bệnh virút truyền qua động vật Virút này được phân lập đầu tiên vào năm 1935 ở Tokyo, Nhật bản với dịng nguyên mẫu là Nakayama Virút
VNNB là một thành viên của chi Flavivirus thudc ho Flaviviridae va duoc truyén nhờ muỗi giữa các vật chủ cĩ xương sống, trong đĩ cĩ người [26]
Virút VNNB gây ra bệnh viêm não cấp tính, với biểu hiện nhiễm độc ở hệ
Trang 19thường gặp ở trẻ em dudi 15 tudi, tỷ lệ tử vong cao Bệnh nhi sống được thường bị di
chứng nặng nề như liệt, rối loạn ý thức
Cĩ khoảng 50.000 trường hợp VNNB lâm sàng mỗi năm trong đĩ đa số là
trẻ em dưới 10 tuổi Tỷ lệ tử vong là 15-25% và cĩ tới 70% số bệnh nhân sống mang
những di chứng nặng nề về thần kinh [8] Việt nam là vùng lưu hành bệnh VNNB cao do khí hậu nhiệt đới với nền nơng nghiệp lúa nước Việc thâm canh lúa hỗ trợ bởi mưa, tưới tiêu và nuơi lợn là những điều kiện phát triển mối liên quan giữa vectơ và ổ chứa, tạo chu kỳ truyền bệnh trong thiên nhiên và truyền bệnh cho người một cách đễ dàng Những kết quả giám sát dịch tễ học cho thấy sự lan truyền của VNNB
ở phía Bắc là nghiêm trọng nhất với tỷ lệ tử vong cao 14% và tỷ lệ di chứng là
31,2% [6]
* Cơ chế và dường lây truyền
+ Nguồn truyền bệnh:
Kiểu truyền bệnh qua muỗi của virút VNNB đã được làm sáng tỏ với việc
phan lap virit VNNB tt mudi Culex tritaeniorhynchus nam 1938, và trong các
nghiên cứu thực địa sau đĩ xác định vai trị của chim nước (chủ yếu là cị, diệc, vẹt, ) và lợn trong chu kỳ động vật của virút Bệnh chỉ xuất hiện ở người khi cĩ điều
kiện sinh thái thích hợp cho sự lây truyền Vịng tuần hồn bệnh VNNB trong tự
nhiên được biểu diễn ở hình 1.1
+ Mudi vecto:
Người ta đã phân lập virút VNNB từ 30 lồi muơi khác nhau và thấy vecto
chính là muỗi Cex triftaeniorhynchus Ngồi ra cịn cĩ các lồi muỗi khác như Culex vishnui, Culex gelidus, CHlex pseudovishnui cũng cĩ thể truyền bệnh [35].(38] Muỗi hút máu động vật trong thời kỳ nhiễm virút huyết như chim, lợn rồi truyền qua người khi đốt Ao hồ và đặc biệt là các đồng lúa ngập nước là nơi sinh sống của các ấu trùng Ở các vùng ơn đới, muỗi nở vào tháng 5, cĩ mật độ dày đặc
vào tháng 6, tháng 7 và tỷ lệ nhiễm virút ở động vật cũng như ở người cao nhất vào
tháng 8-9
Trang 20(31],[35],[38] Virút phát triển ở nhiệt độ 27°C-30°C trong cơ thể muỗi, dưới 20°C thì sự phát triển dừng lại Điều này giải thích tại sao bệnh VNNB thường xảy ra vào
mùa nĩng và lồi muỗi truyền bệnh thường ở vùng nhiệt đới Theo Trần Văn Tiến và cộng sự [11] thì bệnh VNNB thường xảy ra ở miền Bắc từ tháng 4 đến tháng 9 và cao điểm là tháng 6, tháng 7 vì thời điểm nay chi sé mat do mudi Culex
tritaeniorhynchus tang cao
ite RE
Muỗi Người Muỗi
lÀ_ | xà Lợựn ==—————> Muỗi =———>- Chim
}V
Muỗi Người Muỗi
Hình 1.1 Sơ đồ chư trình truyền bệnh VNNB trong tự nhiên
+ Vật chủ của virúi VNNB:
Lợn là vật chủ chính cho khuyếch đại virút Chim thuỷ cư lớn cĩ thể giữ vai trị này ở những vùng khơng cĩ lợn|25] Ở bị, ngưa, la, dê, cừu đều phát hiện thấy
kháng thể kháng virút VNNB, song chúng khơng phát triển đủ mức độ virút huyết cho sự khuyếch đại virút Lợn sau vài ngày bị nhiễm virút huyết thường khơng cĩ
Trang 21nơi cĩ dịch 100% số lợn đều cĩ kháng thể kháng virút VNNB Miễn dịch cho lợn
ngăn chặn được hiện tượng sảy và chết yếu, đồng thời cĩ thể giảm sự truyền của virút bằng cách hạn chế hay ngăn ngừa nhiềm virút VNNB ở lợn Chim là lồi vật mang virút từ vùng này sang vùng khác, chúng đĩng vai trị ổ chứa trong tự nhiên
[31],[35]
Do mức độ nghiêm trọng của bệnh, những cố gắng để phát triển vaccin sống bị hạn chế và nhìn chung khơng thành cơng Ngược lại một số vaccIn bất hoạt đã được phát triển và tỏ ra gây được miễn dịch bảo vệ [40] Trên thế giới hiện nay đã cĩ vaccin VNNB bất hoạt và tinh khiết từ não chuột, vaccnn VNNB bất hoạt từ tế bào chuột đất vàng non, vaccin sống giảm độc lực được điều chế từ tế bào chuột đất
vang so sinh [15]
1.2 TONG QUAN VE VACCIN VIEM GAN B
Bốn năm sau khi phân lap duoc HBV (1967), vaccin prototype đã được dua
vao nghién ctfu phat triển ở Mỹ và vào đầu những năm 1980 một vaccin được điều
ché tir khang nguyén bé mat HBsAg tim thấy trong huyết tương của những người mang mạn tính đã được sản xuất ở Pháp và Mỹ [20] Vaccin HEPTAVAX B của Merck - Sharp & Dohme đã được cấp bằng sáng chế và được sử dụng thường xuyên
ở Mỹ vào năm 1981 Từ đĩ cĩ tới 13 hãng sản xuất vaccIn làm từ huyết tương người
Tuy vậy, vaccm viêm gan B làm từ huyết tương người được chấp nhận rất chậm, thêm vào đố số người cho máu cĩ HBsAs đủ chất lượng hiện cĩ đã làm hạn chế việc sản xuất vaccin sử dụng trên tồn thế giới
Vaccin viêm gan B thế hệ thứ hai đã ra đời, bắt đầu vào năm 1986 với vaccin tái tổ hợp ADN Doan gen S của HBV mã hĩa kháng nguyên bề mặt HBsAg được biểu thị ở nấm men hoặc tế bào động vật như các hat HBsAg 22nm Ca hai loai vaccin tái tổ hợp làm từ nấm men và tế bào động vật (tế bào trứng chuột đất vàng
Trang 22ADN tén du trong vaccin-nấm men hơn so với vaccm làm từ tế bào động vật [L2],
mặc dù ADN phải hồn tồn khơng được cĩ trong cả hai quy trình
Các loại vaccin khác cũng đang được nghiên cứu như vaccin tổng hợp các chuỗi peptit cũng đã được thử nghiệm thành cơng trên tinh tỉnh và một virút vaccinia dựa trên cơ sở vaccin sống song cịn hạn chế vì cĩ nhiều phản ứng phụ
1.2.1 Vaccin viêm gan B điều chế từ huyết tương người
Với nguồn nguyên liệu sinh học là huyết tương nhiễm virút viêm gan B hiệu giá cao, với quy trình cơng nghệ sản xuất tiên tiến, vaccin đã cĩ hiệu lực và an tồn với hàng triệu người được tiêm trên tồn thế giới Vaccin huyết tương cĩ rất ít phản ứng phụ, cĩ tính miễn dịch cao, cĩ thể phịng được ung thư gan do HBV gây ra, khơng gây ảnh hưởng gì đến các kháng thể của mẹ truyền sang con hoặc các vaccin khac trong CTTCMR [34],[41]
Cĩ nhiều quy trình khác nhau được sử đụng để sản xuất vaccin viêm gan B làm từ huyết tương người Quy trình thương mại hĩa đầu tiên dựa trên cơ sở quy
trình ly tâm của Gerin Cịn Merck sử dụng quy trình chuyển huyết tương thành
huyết thanh, tủa với ammoni sulfat và siêu lọc để giảm thể tích, sau đĩ loại bỏ các
tạp chất thứ yếu như albumin, formaldehyd, xử lý với urea và siêu lọc Quy trình do viện Pasteur phát triển cũng dựa trên cơ sở ly tâm nhưng dùng PEG để tủa, mỗi bước ly tâm được thực hiện hai lần, cơ đặc bằng siêu lọc giữa các lần ly tâm Theo Trung
tâm Máu New York, Hà lan và Green Cross (Hàn Quốc) thì trong quy trình đã thay bất hoạt nhiệt bằng bất hoạt enzym và hĩa chất, ngồi việc dùng các bước tiền ly tâm để giảm thể tích và tủa với PEG cịn thêm bước hydroxyapatit Tiếp thu chuyển
nhượng kỹ thuật của Nhật bản và cố những cải tiến trong quy trình sản xuất cho phù hợp với điều kiện Việt nam, các bước trong quy trình sản xuất vaccin viêm gan B
Trang 23Huyết tương người (hiệu giá HbsAg = 10° bang ELISA)
}
Tua với (NH„)SO, 30%
+
Ly tam 4500v/p — 30 phut — Can Tua với nhoso 40%
Ly tâm 4500v/p — 30 phút > Nước nổi
Hồ cặn 5 KBr
Ly tam oo — 30 phút > Can Rửa cặn bằng phéu loc chan khéng
Chay siéu _ tam trong dung dich gradient KBr (3 lan)
25000 v/p -24 giờ — 20°C
Chạy aor tâm (2 lần)
25000 WP 19 gid — 10°C
Bat hoat nhiét 6 60°C
Ỷ
Bat hoat bang formaldehyd 1/4000 —37°C — 96 gid +
Cơ đặc + thẩm tích bằng pellicon cassefie +
Kiểm tra độ tỉnh khiết bằng SDS-PAGE và hình ảnh vi điện tử *
Lọc vơ trùng va pha vaccin cĩ hàm lượng HBsAg = 2Ĩ ug/ml
Hấp phụ với Al(OH),
Hinh 1.2 Quy trình sản xuất vaccin viêm gan B làm từ huyết tương người
Trang 2410
1.1.2 Vaecin viêm gan B tái tổ họp
1.1.2.1 Vacein viêm gan B tái tổ hợp từ nấm men:
Sau khi biến nạp các tế bào nấm men với plasmid biểu thị HBsAg, các tế bào
biéu thi HBsAg được xác định và nhân lên Hệ nấm men điển hình, hay được dùng
để biểu thị cho HBsAg là S.cerevisrae Những tế bào này sau đĩ được cho qua một hay hai vịng clon đơn bào và một clon với sự kết hợp tốt nhất giữa các mức biểu thị
HBsAø và sự vững bền của việc biểu thị đĩ trong nồi lên men sẽ được lựa chọn để
phát triển sản xuất
Tế bào nấm men được cấy lên đĩa thạch hoặc các bình lắc nhỏ, sau đĩ được
chuyển sang các bình lắc lớn, nồi lên men nhỏ và cuối cùng là nồi lên men lớn Mơi
trường nuơi cĩ thể là các phức hợp hĩa học, cĩ bản chất hĩa học hoặc bán hĩa học
Quá trình lên men cĩ thể kéo dài vài ngày đến 1-2 tuần, tuỳ thuộc vào quy mơ và kích cỡ lượng tế bào cấy để cĩ thể được sản lượng HBsAg tối đa Sau đĩ gặt để tách
tế bào nấm men ra khỏi mơi trường bằng cách lọc hay ly tâm rồi rửa Các tế bào sau đĩ được bảo quản đơng bảng hay ly giải ngay để tỉnh khiết HBsÀz
Cĩ nhiều phương pháp đã được sử dụng dé diéu ché va tinh khiét HBsAg Dựa vào các tính chất sinh hĩa cơ bản của HBsAg da duoc xác định bao gồm tính bền vững với nhiệt độ, kích thước và tỷ trọng, ái lực hấp phụ mà áp dụng cho việc tỉnh khiết HBsAg từ nguồn nguyên liệu tái tổ hợp Chẳng hạn như nhờ tính bền vững
với nhiệt độ mà cĩ thể bất hoạt virút bằng nhiệt độ, hay tận dụng kích thước khơng
bình thường và tỷ trọng của hạt HBsAg để phát triển quy trình tỉnh khiết dựa trên cơ sở ly tâm cân bằng trong các dung dịch gradient Pilot và cs, Duinul va Krijnen [23]
đã dùng aerosil để hấp phụ các lipoprotein HBsAg và phản hấp với dung dịch đệm
borat ở pH tăng dần Một nghiên cứu khác thì phản hấp bằng cách thay đổi bề mặt silica tao thanh bang lực đẩy ion [36] Phương pháp sắc ký (sắc ký màng lọc, sắc ký trao đổi ion, sắc ký miễn dịch ái lực) rất phổ biến trong sơ đồ tính khiết sinh hố học
[411.142]
Trang 25H
(PMSF) vao hỗn dịch tế bào trước khi đem ly giải để bảo vệ các protein trong các
hạt kháng nguyên khỏi bị hố giáng và dùng triton X- 100 để hồ tan khấng nguyên
Dung dịch ly giải thơ được làm sạch bằng vi lọc với màng lọc 0,2um Việc sử dụng
kỹ thuật cặp chả vi lọc và siêu lọc cho chúng ta một bước tinh khiết cĩ hiệu quả Triton X- 100 tên dư được loại bỏ bằng cách hấp thụ vào các viên bị polystyren (XAD- 4) Kháng nguyên được tách ra khỏi dung dịch ly giải bằng cách hấp thụ vào aerosil Sau khi rửa, kháng nguyên được phản hấp khỏi silica bằng dung dịch đệm borat ấm Kháng nguyên là các hạt liporotein 22nm cĩ chứa các chuỗi polypeptit S Kháng nguyên S được biểu thị trong nấm men là một polypeptit khơng glycosyl hoa
24- kD Độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng được kiểm tra bằng phân tích SDS- PAGE cũng như SDS- HPLC để xem cịn các protein nấm men tơn dư khơng Cả 2
phương pháp đều cho độ tinh khiết > 99% Thử nghiệm nhận dạng cũng được tiến
hành bằng phương pháp SDS - PAGE Hàm lượng kháng nguyên cho các liều được
xác định bằng phương pháp Lowry và kiểm tra cơng hiệu trên chuột, chuẩn độ hiệu giá kháng thể bằng phương pháp ELISA Thành phẩm cuối cùng được kiểm tra pH,
vơ khuẩn, an tồn, cơng hiệu
1.1.2.2 Vaccin viém gan B tái tổ hợp từ tế bào động vật:
Hệ biểu thị HBsAg ở động vật [33] cũng tương tự như mơ hình đã được sử dụng cho nấm men, nghĩa là hệ biểu thị sử dụng các plasmid cĩ chứa các trình tự để khuyếch đại các bản sao, thường là 100-200 bản sao cho một tế bào Những plasmid
này sẽ xâm nhập ngẫu nhiên vào thể nhiễm sắc của tế bào động vật chủ, ở đĩ sẽ
được khuyếch đại lên để nhân các bản sao, trong trường hợp này men dihydro folat reductase (DHFR) sẽ khuyếch đại trong tế bào CHO dhFr (-) với sự cĩ mặt của
methotrexat [30] Tuy nhiên, hệ biểu thị này cĩ khác với hệ biểu thị ở nấm men ở
chỗ cassette biểu thị cĩ chứa một đoạn gen khởi động sao chép mạnh cĩ được từ tế
bào động vật, gen S của HBV (r-HBvaccine) hoặc gen S + tiền S2 (Genhevac B) và
trình tự kết thúc sao chép ở động vật Với HBsAg được các tế bào động vật tái tổ
hợp tiết ra thì lơ mơi trường nuơi cấy cuối cùng được tách ra khỏi tế bào, đồng thời
Trang 2612
Đối với vaccin Genhevac B, qui trình tinh khiết chưa được cơng bố, mặc dù
trước đây cũng đã cố một qui trình tinh khiết ở qui mơ phịng thí nghiệm đã được mơ tả
Một qui trình sản xuất của hãng Biotechnology AB-Pharmacia LKB và của trung tâm Phát triển cơng nghệ sinh học Quốc gia của Trung Quốc đã được cơng bố,
bao gồm 3 bước sắc ký cột butyl Sepharose và trao đổi ion Kết quả phải đưa đến sản
phẩm cuối cùng khơng cĩ AND va protein của huyết thanh bào thai bê Protein S biểu thị trong tế bào động vật là một hỗn chất 24kD khơng glycosyl hố và 27kD glycosyl hoa (tỷ lệ 4:1) với một cầu nối N-đơn glÌycan ở vị trí aa I46 trong chuỗi
polypeptit 226 aa Protein tiền S2+S biểu thị trong tế bào CHO là hỗn chất của 36- kD diglycosyl hố (aa thứ 4 và 201), các chuỗi polypeptit tiền S2+§ và các chuỗi
polypeptit S27-kD va 24-kD
1.3 TONG QUAN VỀ VACCIN VNNB
Trên thế giới hiện nay cĩ 3 vaccin VNNB đang được sản xuất và sử dụng ở
quy mơ lớn; tuy nhiên, chỉ cĩ vaccin VINNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột được
phân bố trên thị trường và cĩ mặt trên tồn cầu Vaccin VNNB bất hoạt và vaccin VNNB sống giảm độc lực, đều nuơi trong tế bào thận chuột đất tiên phát (PHK), chỉ
được sản xuất và phân bố riêng ở Trung Quốc 1.3.1 Vaccin VNNB bất hoạt từ não chuột
Vaccin VNNB bất hoạt từ não chuột được sản xuất ở Nga và Nhật trong thập
kỷ 1930, và cĩ hiệu lực với viêm não mùa thu Nga (cũng là VNNB) Trong Thế
Chiến II, một dung dịch đơn giản khơng ly tâm 10% não chuột được gây nhiễm, bất hoạt với formalin, được sản xuất ở Mỹ như một vaccin cho quân đội Vaccin cĩ tính
gây miễn dịch đa dạng, nhưng đánh giá thực địa vẻ hiệu lực khơng thể thực hiện
được
Một vaccin bất hoạt bền vững hơn từ phơi gà cũng được phát triển bởi quân đội Mỹ, và hiệu lực 80% thấy ở trễ em được tiêm vaccin phối hợp từ não chuột và
Trang 2713
phân cơng tới châu Á từ năm 1948 đến năm 1951 Việc sử dụng bị đình chỉ năm 952 khi thấy các số liệu khơng cho chứng cứ thuyết phục về khả năng gây miễn
dich và hiệu lực
Qui trình tinh chế thành cơng vaccin VNNB bat hoat từ não chuột được cơng bố bởi các viện nghiên cứu Nhật bản đưa tới vaccin tinh khiết hiện nay Vaccin từ não chuột được sản xuất ở Nhật và các nơi khác đều theo trình tự: ly tâm, siêu ly tâm, tủa protamin sulfat, bất hoạt formalin ở nhiệt độ lạnh, và theo sau bởi siêu ly tâm, tủa amoni sulfat, ly tâm phân vùng liên tục trên sacharose gradient tuong tự Tiêu chuẩn quốc gia của Nhật bản qui định khả năng gây miễn dịch tối thiểu và hiệu
lực ở chuột (so với một vaccin chuẩn), tổng hàm lượng protein tối đa (80Hg/m]) và
protein co ban myelin (2ng/ml) trong số các qui định khác Vaccin hộn được pha lỗng với mơi trường 199 và đệm phosphat để đạt tiêu chuẩn về hiệu lực Vaccin được ổn định với gelatin, natri glutamat và được bảo quản với thimerosal Ở Nhật
bản, vaccin được lưu hành chủ yếu dưới đạng dung dịch Để xuất khẩu, vaccin được
đơng khơ, rồi được hồn nguyên bằng nước cất vơ trùng
BIKEN, nhà sản xuất vaccin VNNB chính ở Nhật Bản, đã sử dụng dịng Bắc
Kinh - I (Beijing) từ năm 1989 cho vaccin tiêu dùng nội địa Trong tương lai, dong Bắc Kinh cĩ thể sẽ thay thế virút Nakayama trong tồn bộ vaccin VNNB sản xuất
bởi BIKEN
Ở Việt Nam, tiếp nhận chuyển nhượng cơng nghệ sản xuất vaccin VNNB của Viện BIKEN thuộc Trường Đại Học Osaka - Nhật Bản từ năm 1989, Viện
VSDTTƯ đã sản xuất thành cơng vaccin VNNB bất hoạt, tỉnh khiết từ não chuột
theo phương pháp hố lý của Takaku với dong virit Nakayama, NIH, Nhat Ban 1.3.2 Vaccin VNNB bát hoại từ tế bao than chuột đá! tién phát
Vaccin VNNB bất hoạt điều chế từ tế bào thận chuột đất tiên phát (PHK) chi
được sản xuất ở Trung Quốc Đĩ là Vaccin VNNB chủ yếu của cả nước từ năm 1968, khi thay thế vaccin từ phơi gà cĩ khả năng gây miễn dịch kém hơn Nỗ lực sản xuất vaccin từ nuơi cấy tế bào xuất phát từ mong muốn tránh các kháng nguyên não
và các phản ứng dị ứng liên quan đến vaccin thé, nang cao khả năng miễn dịch và
Trang 2814
trong một vài nuơi cấy tế bào tiên phát và thường trực làm cơ chất cho sự phát triển
VITÚI
Vaccin được điều chế từ nuơi cấy tế bào tiên phát của thận chuột đất vàng Xiri Tế bào một lớp được rửa khỏi mơi trường nuơi cấy và gây nhiễm với virút
VNNB Sau một ngày, tế bào một lớp đã gây nhiêm được rửa và nuơi lại Dịch nước
nổi của nuơi cấy tế bào được bất hoạt với formalin 0,5%, ổn định với 0,1% albumin
người, và thử độ gây nhiễm cịn lại và hiệu lực Vaccin dung dịch giữ được hiệu lực
trong hon 2 nam o 4-8°C
Vaccin VNNB bất hoạt tăng cường, sản xuất trong tế bào thận chuột đất tiên
phát: Vaccin bất hoạt thử nghiệm cĩ hiệu lực cao hơn được tao ra bằng cách cơ đặc vaccin bất hoạt chuẩn từ tế bào PHK qua siêu lọc (vaccin cơ đặc 10 lần), theo sau là siêu ly tâm (vaccin vulon tỉnh khiết) Trong một thử nghiệm thực địa, một liều
I,0ml vaccin tăng cường hiệu lực tiêm dưới da tạo được chuyển đổi huyết thanh
đồng đều đối với kháng nguyên P3 đồng dạng và mức kháng thể chếo với virút Nakayama, két qua đạt được tương tự như với 2 liều vaccin chuẩn Chưa vaccin nào
được cấp giấy phép sử dụng cho người 1.3.3 Vaccin VNNB sống giảm độc lực
Các dịng virút VNNB giảm độc lực được tìm bằng cách cấy chuyển dịng
hoang dã nhiều lần trên những hệ nuơi cấy tế bào khác nhau, bao gồm PHK, phơi gà, và tế bào biểu bì chuột phơi Mất độc tính thân kinh ở chuột, chuột đất, và/hoặc
lợn bước đầu cho thấy khả năng sử dụng an tồn trên người
Vaccin phải đảm bảo tiêu chuẩn khơng cĩ các tác nhân độc hại, khơng cĩ
độc tính thần kinh trên chuột trưởng thành, và ổn định khơng trở lại độc tính thần
kinh sau khi gây nhiễm trong não chuột đang bú 1.3.4 Các vaccin thứ nghiêm
Một số vaccin VNNB thử nghiệm phát triển với kỹ thuật sinh học phân tử
đang được xem xét Các hệ thống chuyển vaccin nâng cao đã được xem xét để đơn
Trang 2915
lúc Sự phân huỷ sinh học cách quãng từng mảnh xác định của vi cầu sau một lần
tiêm duy nhất được làm theo đúng khoảng cách của lịch tiềm đang sử dụng
1.4, KIEM TRA CHAT LUONG VACCIN
1.4.1 Yéu cau chung
Trong sản xuất vaccin và sinh phẩm, chất lượng vaccin là rất quan trọng bởi
vì vaccin là sản phẩm cĩ nguồn gốc từ vi sinh vật sống cĩ cấu trúc phân tử phức tạp,
dễ bị biến tính do nhiệt độ, thời gian Và cùng một lúc nĩ được dùng cho nhiều người khoẻ mạnh nên nếu vaccin khơng đạt yêu câu về chất lượng sẽ ảnh hưởng thậm chí để lại những hậu quả vơ cùng tai hại cho hàng triệu con người
Việc kiểm tra đánh giá chất lượng vaccin địi hỏi tính khách quan và chính
xác với đội ngũ cán bộ trung thực, cĩ tay nghề trình độ chuyên mơn Phải tuân thủ chặt chẽ các quy trình các kỹ thuật phương pháp của TCYTTG va
TTKĐQGVX&SPYH quy định, nhằm đảm bảo độ chính xác cao
Chất lượng vaccin được đánh giá ở 3 khâu: Đánh giá phịng thí nghiệm,
đánh giá lâm sàng và đánh giá thực địa Đánh giá phịng thí nghiệm bao gồm: kiểm tra nguyên liệu đầu, bán thành phẩm và thành phẩm được thực hiện đối với từng lơ
vaccin vé các mặt sinh vật học và hố học Đánh giá lâm sang là yêu cầu bắt buộc
đối với vaccin mới được thực hiện với hai nội dung chính là hiệu quả và an tồn
Đánh giá thực địa là xác định hiệu quả của vaccin thể hiện bằng khả năng bảo vệ của cơ thể đối với bệnh nhiễm trùng tương ứng [1]
1.4.2 Kiểm tra sinh vật học
Yêu cầu phải kiểm tra các mặt sau đây:
* Vộ khuẩn: Kiểm tra vơ trùng là để xác định sự vơ khuẩn của vaccin
Vaccin phải khơng cĩ tạp khuẩn hoặc nấm phát triển trên mơi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi
* An tồn: Kiểm tra an tồn được thực hiện với vaccin trước khi được phép xuất xưởng và sau xuất xưởng đang được sử dụng Kiểm tra an tồn chung được tiến
hành trên chuột nhắt trắng và chuột lang Thử nghiệm đạt yêu cầu là qua thời gian
Trang 3016
* Cơng hiệu: Mục đích kiểm tra cơng hiệu là xác định khả năng gây miễn
dịch của vaccin Tuỳ từng loại vaccin mà phương pháp xác định khác nhau
Vidu: - Cơng hiệu vaccin viêm gan B được xác định bằng cách kiểm tra
kháng thé anti-HBs trên chuột nhất thuần chủng BALB/C được tiêm vaccin, cĩ so sánh với vaccin chuẩn
- Cơng hiệu của vaccin VNNB lại được xác định bằng thử nghiệm trung hồ giảm đám hoại tử
* Chất gây sốt: Kiểm tra để cĩ thể biết vaccin cố khả năng gây sốt cho
người được sử dụng vaccIn hay khơng Chất gây sốt của vaccin được xác định gián
tiếp qua thí nghiệm đo nhiệt độ động vật (thỏ) trước và sau khi tiêm vacem
1.4.3 Kiểm tra lý hố học
Tuỳ theo yêu cầu của từng loại vacein mà kiểm tra các thành phần lý hố
Nhưng nhìn chung đều phải kiểm tra các mặt sau đây:
- _ Trạng thái bên ngồi: Màu sắc, độ đục, thể tích đĩng ống
- DépH
- Ham luong protein tồn phần
- Các thành phần hố học cĩ trong vaccin như: Thimerosal, formaldehyd,
nhơm
1.5 Ý NGHĨA VÀ CƠNG DỤNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN HĨA HỌC
TRONG VACCIN VIEM GAN B VA VACCIN VNNB 1.5.1 Độ pH
Vaccin viêm gan B và VNNBE là dạng thuốc tiềm, vì vậy cần cĩ pH giống
như của máu [1] Tuy nhiên, do những lý do ổn định của các thành phần kháng nguyên cĩ trong vaccin, pH cĩ thể được điều chỉnh cho phù hợp
1.5.2 Protein
Protein trong vaccin chính là kháng nguyên đặc hiệu để kích thích đáp ứng miễn dịch Các protein này thường cĩ nguồn gốc là vị sinh vật gây bệnh vì thế nĩ phải được làm mất hoặc giảm hoạt tính Một yêu cầu nữa là protein đặc hiệu này
Trang 3117
và thời gian Vì vậy vaccin phải được kiểm tra chất lượng một cách nghiêm túc theo
từng lơ, từng cơng đoạn và phải chú ý vấn đề bảo quản
Sau khi kiểm tra đạt yêu cầu về tính an tồn và cơng hiệu cao thì lượng protein hay hàm lượng kháng nguyên phải đủ thấp để cĩ thể gây được mức độ đáp ứng kháng thể tối thiểu đủ để bảo vệ cơ thể Chảng hạn như đối với vaccin viêm gan
B, ham luong anti-HBs du kha nang bao vệ là > I0mlIU/ml Cồn đối với vaccin VNNB, theo Kanamitsu và cộng sự [26] thì hiệu giá kháng thể trung hồ chỉ cần > 1 là đủ để bảo vệ Vì thế đã cĩ rất nhiều nghiên cứu quan tâm đến hàm lượng kháng
nguyên và tính miễn dịch của nĩ
1.5.3 Thimerosal
Thimerosal là hợp chất hữu cơ cĩ chứa thuỷ ngân, thường được dùng làm chất bảo quản Với lượng nhỏ cĩ thể ngăn chặn vi khuẩn và những vi sinh vật khác
khỏi nhiễm vào vaccin, đặc biệt với lọ nhiều liều, phải mở nhiều lần
Thimerosal khơng phải là thành phần mới của vaccin, nĩ đã được dùng trên
60 năm nay trong sản xuất một số vaccm [21]
Khơng thấy cĩ tác dụng phụ do thimerosal trừ một số trường hợp dị ứng da TCYTTG giải thích rằng nguy cơ tử vong và biến chứng ở trẻ em khơng được tiêm
chủng do những bệnh cĩ thể tiêm phịng bằng vaccin là cĩ thật và rất lớn Nguy cơ
về tac dụng phụ của thimerosal chỉ cĩ trên lý thuyết và nếu cĩ thì rất nhỏ[ 16]
Luong thimerosal trong vaccin là thấp, nguy cơ tác dụng phụ chỉ cĩ trên lý thuyết Dạng thuỷ ngân trong thimerosal khơng phải loại gây nên ngộ độc vì đã tạo thành hợp chất trong phân tử thimerosal khơng cịn ở dạng tự do để phản ứng trong
cơ thể người Vaccin chứa thimerosal là an tồn với người sử dụng
1.5.4 Formaldehyd
Formaldehyd là hĩa chất cĩ tác dụng làm bất hoạt độc tố và làm bền tính kháng nguyên [39] Tác dụng kép của formaldehyd đã được xác định nhiều lần và trong nhiều hệ thống khác nhau trong hơn 70 năm qua, kể từ khi Ramon khám phá ra rằng formaldehyd cĩ thể được dùng để bất hoạt độc tố uốn ván, tồn bộ tế bào vi
khuẩn và virut Vào nhưng năm đầu thập niên 1920, Ramon dùng một chất làm bên
thơng thường là formaldehyd như là chất bảo quản nước nổi canh trùng độc SBI
(on 363
Trang 3218
khuẩn bạch cầu Trong thời gian giữ ở kho, nước nổi canh trùng khơng chỉ mất khả năng giết súc vật mà cịn làm cho súc vật cĩ khả năng kháng lại liều thử gây chết
tăng đần của nước nổi canh trùng độc tố Với sự phát triển các loại vaccin làm mnất độc tố bằng vận dụng tính đi truyền, thì formaldehyd cĩ một vai trị mới như là tác nhân làm bền của những kháng nguyên bị mất tính độc theo tính chất di truyền 1.5.5 Chất hấp phụ nhơm
Vaccin thường chứa kháng nguyên và chất hấp phụ để kích thích đáp ứng miễn dịch đối với kháng nguyên Tác dụng hấp phụ của các hợp chất chứa nhơm đã được thấy lần đầu vào năm 1926, Từ đĩ chất hấp phụ nhơm hydroxyd và nhơm phosphat đã được sử dụng rộng rãi trong cơng nghệ sản xuất vaccin như ho gà, bạch hầu, uốn ván, vaccmn viêm gan A, B, Đĩ là các chất hấp phụ duy nhất hiện nay được FDA của Mỹ cơng nhân
Một nghiên cứu gần đây [22] cho thấy chất hấp phụ nhơm hydroxyd là nhơm oxyhydroxyd kết tinh, AIOOH Nĩ cĩ đạng sợi và tan rất chậm trong dịch gian bào nhân tạo Chất hấp phụ nhơm phosphat là nhơm hydroxyphosphat kết tình Nĩ cĩ dạng phẳng và hịa tan nhanh hơn nhơm hydroxyd trong dịch gian bào nhân tạo Dịch gian bào chứa 3 acid hữu cơ trong đĩ cĩ một nhĩm acid œ-hydroxy carboxylic (các acid citric, lactic, malic), và cĩ khả năng tĩm bắt nhơm Một nghiên cttu in vitro gan day chi ra rang anion citrat c6 thé lam tan ca nhom hydroxyd va nhơm phosphat, mặc dù nhơm phosphat bi hoa tan mạnh hơn
Vaccin chứa chất hấp phụ nhơm thường được tiêm bắp FDA giới hạn lượng
hấp phụ khơng quá 0,85mg nhơm một liều Sự phân bố của chất hấp phụ chứa nhơm
sau khi tiêm bắp chưa được hiểu rõ Điều này chính do lượng nhơm thấp khơng gây
ra thay đổi nhận thấy gì trong hàm lượng bình thường của nhơm trong máu, nước tiểu hay mơ [321]
Thành phần nhơm đem lai tac dụng hấp phụ miễn dịch học, khơng chi bang
việc giải phĩng từ từ của tác nhân gây miễn dich mà cịn bằng việc tạo ra phản ứng viêm tấy nội bộ và kích thích giải phĩng cytokin Cĩ nhiều bằng chứng cho rằng các vaccin hấp phụ cĩ khả năng gây miễn dịch cao hơn khơng hấp phụ vì thế khả năng
Trang 3319
Trong hội thảo về tiêu chuẩn hố các vaccin hấp phụ nhơm, tổ chức vào ngày 21/6/1996 tại Bergen (Nauy), các tác giả đã đề nghị rằng độ tinh khiết và nồng độ chất hấp phụ phải được chứng nhận bởi cơ quan Kiểm định quốc gia [32] Cơng thức phải được pha sao cho khi lắc đều, vaccin duy trì đồng nhất trong một khoảng thời gian thích hợp Tính ổn định của vaccin phải được chứng nhận bởi cơ quan Kiểm định quốc gia
* Phương trình phan tmg san xuat gel Al(OH),
cr cr cr Œ AF Ar’ Œt
CAU TRUC CUA GEL
CHÍNH GIỮA LÀ NHÂN CỦA GEL
Hình 1.3 Sơ đồ hấp phụ kháng nguyên lên gel Sản xuất øel từ nhơm clorua và natri hydroxyd:
AI* + 3CI + 3OH-<> 3Na' + 3CI + Al(OH);‡
Trong dung dich, Al(OH), lu6n tồn tại ở dạng:
Al(OH)zỶ <> AI'*+ 30H
[ nAl(OH)? xAI* yCr ]
| nhan cua gel |
Trang 3420
x, y là những số lớn khơng xác định được
1.6 TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG VACCIN VIÊM GAN B VÀ
VACCIN VNNB VỀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC
Theo TTKĐQGVX&CSPYH, tiêu chuẩn đánh giá chất lượng vaccin viêm
gan B và vaccin VNNB về thành phần hĩa học được quy định như bảng 1.1 va 1.2 Bảng 1.1 Tiêu chuẩn đánh giá chát lượng vaccin viêm gan B về thành phần hĩa
học
Tên thử nghiệm Tiêu chuẩn chấp thuận
pH - _|5,4—74
Ham luong protein (ug/ml) < 50
Hàm lượng formaldehyd (g%) <0,02 (hoặc <200ug/m]) Ham lugng thimerosal (g%) <0/01 (hoặc <100ug/m])
Ham luong nhém (ug/ml) < 500
Bang 1.2 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng vaccin VNNB về thành phần hĩa học
| Tên thử nghiệm Tiêu chuẩn chấp thuận
pH 6,8 — 7,4
Ham lvong protein (ug/ml) < 80
Hàm lượng formaldehyd (g%) < 0,01 (hoac <100 jig/ml)
Ham luong thimerosal (g%) < 0,012 (hoặc <120 ug/m]l)
* Tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định về thành phân hố học của vaccin viêm gan B va VNNB:
- Các kết quả kiểm tra khơng được vượt quá tiêu chuẩn chấp thuận
- Sự sai lệch kết quả kiểm tra giữa các khoảng thời gian lặp lại của cùng một lơ
vaccin là khơng đáng kể
Trang 3521
1.7 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH VỀ THÀNH
PHAN HOA HOC CUA VACCIN
Theo quy định của TCYTTG, cĩ 2 phương pháp nghiên cứu đánh giá độ ổn định
cua thudc [2],[7],[10],[24],[28],[29]
1.7.1 Phương pháp thử độ ổn định cấp tốc của thuốc:
Thử độ ổn định cấp tốc là những nghiên cứu đã được bế trí để làm tăng tốc độ phân huỷ hĩa học và thay đổi lý học của thuốc bởi các điều kiện bảo quản khắc nghiệt, với mục đích theo dõi những phản ứng phân huỷ xây ra Từ đĩ đưa ra dự kiến tuổi thọ của thuốc ở điều kiện bảo quản bình thường
Phương pháp này được TCYTTG thừa nhận để thử độ on định, nhằm lựa chọn
cơng thức bào chế, qui trình sản xuất thích hợp và dự đốn tuổi thọ của thuốc, điều kiện bảo quản, phục vụ cho đăng ký sản phẩm và phát triển sản xuất
Mục đích của phương pháp này là:
+ Phát hiện nhanh mức độ phân huỷ của thuốc trong những cơng thức bào chế khác nhau, nhằm chọn được cơng thức bào chế thích hợp (trên quan điểm độ ổn
định)
+ Dự đốn được thời gian hữu hiệu của thuốc, đĩ là thời gian mà chế phẩm vẫn
giữ được chất lượng khi bảo quản ở điều kiện khác nhau Từ đĩ dự kiến được tuổi thọ của thuốc
+ Lựa chọn được điều kiện bảo quản để cĩ được thời gian hữu hiệu của thuốc
theo mong muốn
1.7.2 Phương pháp nghiên cứu độ ổn định thực của thuốc:
Phương pháp nghiên cứu độ ổn định thực của thuốc là đánh giá bằng những
thí nghiệm về lý, hĩa, sinh học, vi sinh học của thuốc trong và ngồi thời gian dự
kiến của tuổi thọ và bảo quản mẫu trong điểu kiện bão quản mong muốn Kết quả
này được sử dụng để thiết lập tuổi thọ, xác nhận tuổi thọ đã dự kiến và đưa ra điều
Trang 3622
Chuong 2
VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Các lơ vaccin viêm gan B và VNNB sản xuất tại cơng ty VABIOTECH từ năm
2000 đến 2005
- Kiểm tra 4 lơ vaccin viêm gan B ở các thời gian khác nhau: sau sản xuất, sau 6-]2- 18-24-30-36 tháng
- Kiểm tra 5 lơ vaccin VNNB ở các thời gian khác nhau: sau sản xuất, sau 6-12-I8- 24 tháng
Hạn sử dụng của vaccin viêm gan B là 3 năm Hạn sử dụng của vaccin VNNB là 2 năm
Tất cả các lơ vaccin đều được lấy mẫu theo đúng quy định và được bảo quản
ở điều kiện 2 — 8°C, tại kho lưu mẫu của phịng Kiểm tra chất lượng sản phẩm, cơng ty Vaccin và Sinh phẩm số l
2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU:
2.2.1 Hĩa chất:
- Albumin bị SIGMA
- Natri hydroxyd - NaOH BDH
- Natri cacbonat - Na,CO, LABOSI
- Đồng sulfat - CuSO,.5H,0 LABOSI
- Natri tactrat - Cs;H,KNaO,.4H,0 MERCK
- Acid tricloracetic - CC1,COOH LABOSI
- Thuốc thử Folin MERCK
- Thimerosal- CH;HgSC;,COONa LABOSI
- Dithizon - C¡;H,;N„Š MERCK
- Cacbon tetraclorid - CCl, LABOSI
- Ammoniac - NH, BDH
Trang 3723
- Acetylaceton - CH,COCH,COCH, LABOSI
- Amoni acetat - H,NOOCCH, LABOSI
- Acid acetic - CH;,COOH LABOSI
- Natri acetat - CH;COONa.3H;O MERCK
- Nhơm clorid ngậm 6 phân tử nước - A]C]H;.6H;O MERCK
- Stilbazo - C;zHisN;Ojo5%(NH,); DOJINDO
Tất cả các hĩa chất sử dụng phân tích, kiểm tra chất lượng đều đạt yêu cầu theo
DĐVN 3 va TCCS
2.2.2 Dung cu va trang thiét bi
- May đo pH HANNA (Bồ đào nha) với các dung dịch chuẩn pH 4,01 và pH 7,00
- Máy đo quang phổ Jasco Y-530 (Nhật)
- Máy ly tâm Firlabo (Pháp)
- Máy khuấy từ Cole - Parmer (Mỹ)
- Cân phân tích OHAUS (Mỹ) - Nồi dun cách thuỷ Grant (Anh)
- Hot hĩa
- Pipet thuỷ tinh các loại Iml, 2ml, 5ml, 10ml (Pyrex, Anh) - Bình định mức các cỡ (Đức)
- Ống đong, bình chiết, bình tam giác (Pyrex, Anh) - Ong nghiém thuy tinh
Các trang thiết bị đều được định kỳ kiểm tra, hiệu chuẩn theo đúng quy định
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sử dụng đồ thị kiểm sốt chất lượng để đánh giá kết quả Theo qui định của Tổ chức Y tế thế giới, để kết luận cĩ ý nghĩa thống kê thì số lượng thử nghiệm ít
nhất phải bằng 20 [37],[44]
Xử lý số liệu theo chương trình Excel
2.3.1 Phương pháp pha chế các thuốc thử và dung dịch chuẩn: 2.3.1.1 Dung dich déng alkalin
Trang 3824
Hoa tan 0,8 g NaOH trong nước cat, thém 4 g Na,CO,, lac cho tan đều Thêm nước
cất vừa đủ 100 mÌ
- Dung dịch B (pha ngay trước khi dùng):
+ Dung dịch CuSO,.5H;O 2%: Hồ tan 2 g CuSO¿.5H;O vào 100ml nước Giữ dung dịch trong chai ở nhiệt độ phịng, cĩ thể dùng được trong thời gian 2
tháng
+ Dung dịch natri tactrat 4%: Hồ tan 4g natri tactrat vào IƯOml nước Trộn lẫn Im] dung dịch CuSO,.5H;O 2% và Iml natri tactrat 4% được dung dịch B - Thêm 2ml dung dịch B vào 1ƠOml dung dịch A được dung dich Alkalin
2.3.1.2 Dung dịch TCA
- Dung dich TCA 50%: Hoa tan 50g acid tricloacetic trong 100ml nuéc cat - Dung dich TCA 10%: Pha lỗng dung dich TCA 50% 5 lan bang nước cất - Dung dich TCA 5%: Pha lỗng dung dịch TCA 50% 10 lần bằng nước cất 2.3.1.3 Dung dịch folin 1:1
Ngay trước khi dùng pha lỗng dung dịch folin 2 lần bằng nước cất
2.3.1.4 Dung dịch albumin chuẩn 1mgíml
- Dung dịch albumin chuẩn Img/mÌ: Cân 20mg albumin bồ đơng khơ, hồ tan trong vừa đủ 20ml nước cất Kiểm tra trên máy đo quang, dung dịch albumin bị Img/ml cĩ độ hấp thụ ở bước sĩng 280nm là 0,66 Dung dịch được bảo quản ở 4°C cĩ thể
dùng được trong thời hạn 4 tháng
- Pha các dung dịch albumin cĩ hàm lượng 50, 100, 150ug/ml từ dung dịch albumin
chuẩn Img/ml trước khi dùng
2.3.1.5 Dung dịch thimerosal chuẩn 1%
- Dung dich thimerosal chuẩn 1%: Cân chính xấc 1g thimerosal, hồ tan trong nước cất Rĩt vào bình định mức, thêm nước cất đến vừa đủ 100ml
- Pha các dung dich thimerosal cĩ hàm lượng 25, 50, 100, 150ug/ml từ dung dịch
thimerosal chuẩn 1% trước khi dùng 2.3.1.6 Dung dịch dithizon 0,02%
Hồ tan 20mg dithizon trong vừa đủ 100ml cacbon tetrac lorid
Trang 3925
2.3.1.7 Dung dich amoniac 60% (9N)
Pha dung dịch amoniac đậm đặc với nước cất theo tỷ lệ 3:2 2.3.1.8 Dung dich acid sulfuric 3%
Thêm từ từ 14,25 ml axit sulfuric đặc vào khoảng 200m] nước cất, để nguơi rồi thêm
nước cất đến vừa đủ 250ml]
2.3.1.9 Dung dịch formaldehyd chuẩn 0,04%
- Dung dịch formaldehyd chuẩn 0,04%: Can chính xác 311mg hexamethylenetramin hồ tan trong nước cất, thêm nước cất vừa đủ 1000m1
- Pha các dung dịch formaldehyd nồng độ 0,0002; 0,0004; 0,0008; 0,0012% trước
khi dùng
2.3.1.10 Dung dich acetylaceton
Hồ tan 150g amoni acetat trong một lượng nước cất thích hợp, thêm 3ml acitd acetic và 2ml acetylaceton rồi thêm nước cất vừa đủ 1000ml
Dung dịch này bảo quản 2-8°C dùng trong thời hạn | thang
2.3.1.11 Dung dich dém acetat (pH 5,55 - 5,75)
- Dung dich A: Hoa tan 69,05g natri acetat ngam 3 phan tử nước vào 500ml nước cất
- Dung dich B: Hoa 5,72ml acid acetic vao 100m! nuéc cat
- Tron dung dich A vao dung dịch B theo tỷ lệ 9:1, đo pH 2.3.1.12 Dung dịch nhơm chuẩn 0,1%
- Dung dịch nhơm chuẩn mẹ 0,1%: Hồ 895mg nhơm clorid ngậm 6 phân tử nước vào nước cất, thêm nước cất vừa đủ 100ml
- Pha dung dịch nhơm 2ug/ml từ dung dịch nhơm chuẩn 0,1% trước khi dùng 2.3.1.13 Dung dịch stilbazo 0,035 %
Hồ 35mg stilbazơ vào vừa đủ 100ml nước cất Lọc qua giấy loc Dung dich bao quản trong vịng Í tuần
2.3.2 Phương pháp kiểm tra các thành phần hố học trong vaccin
2.3.2.1 Do pH:
Trang 4026
2.3.2.2 Dinh luong protein trong vaccin
* Neuyén ly
Protein trong vaccin được tủa bằng acid tricloraceic (TCA) rồi định lượng
theo phương pháp Lowry Cac dung dich protein chun 1a dung dịch abumin bị cĩ nồng độ 25, 50, 100, 150 pg/ml[3],[17],[18],[27]
* Tiến hành:
Thêm 1 ml dung dịch TCA 10% vào mỗi 2 ống nghiệm cĩ chứa Iml mẫu
thử Nếu mẫu vaccin cĩ nồng độ protein thấp (khoảng 10ug) thì cho vào mỗi ống
nghiệm 4ml vaccin rồi thêm 0,4ml dung dịch 'TCA 50% Dun cach thuy 80°C déi với vaccmn viêm gan B, 100°C đối với vaccin VÌNNB trong L5 phút Làm nguội Nếu là vaccin viêm gan B thì thêm 0,5ml nhơm hydroxyd, lắc đều Ly tâm 3500 vịng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ phịng Loại nước nổi, thêm 2ml dung dịch TCA 5%, lắc đều Ly tâm 3500 vồng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ phịng Loại nước nổi ,
thêm 2,5ml dung dịch đồng alkalin, lắc đều Để qua đêm ở nhiệt độ phịng Thêm
2,5ml nước cất, 0,5ml thuốc thử Folin 1:1, lắc đều Đun cách thuỷ 37°C trong 30
phút, để nguội Ly tâm 3500 vịng/phút trong 30 phút Do quang phổ bước sĩng
750nm
Song song tiến hành dựng đường chuẩn sự phụ thuộc độ hấp thụ vào nồng độ dung dịch protein chuẩn 25-50-100-150ug/ml Dựa vào đường chuẩn tính ra hàm lượng protein cĩ trong mẫu thử
Song song tiến hành với mẫu trắng là 1ml nước cất
2.3.2.3 Đỉnh lương chất bdo quan thimerosal: * Nguyên lý:
Dựa trên co sd thimerosal phan ttng voi dithizon tạo thành hợp chất cố cực đại hấp thụ ở bước sĩng 480nm Định lượng thimerosal bằng cách đo độ hấp thụ của