NGHIÊN CUSU BIỂU HIỆN PROTEIN PANTON VALENTINE LEUKOCIDIN của VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Y HC THC HNH (864) - S 3/2013 40 NGHIÊN CứU BIểU HIệN PROTEIN PANTON VALENTINE LEUKOCIDIN CủA VI KHUẩN STAPHYLOCOCCUS AUREUS Ân Khắc Huy, Nguyễn Thị Phơng Lan, Diệp Thế Tài, Vin Pasteur Tp. H Chớ Minh TểM TT: t vn : Panton Valentine leukocidin (PVL) l mt trong nhng c t liờn quan n hoi t mụ, lm tng c lc, úng vai trũ quan trng trong kh nng xõm nhim ca cỏc chng vi khun S. aureus. Nghiờn cu biu hin protein PVL l bc u trong vic nghiờn cu vai trũ gõy bnh cng nh tm soỏt phõn b PVL trong cng ng v nhim trựng bnh vin hin nay.Phng phỏp: PCR c dựng trong thu nhn gen mc tiờu lukS-PV mó húa PVL-S. K thut to dũng c s dng to ra vector tỏi t hp pET22b-PVL-S. Biu hin PVL-S c cm ng bng IPTG, c khng nh bng in di SDS-PAGE v lai Western blot vi khỏng th khỏng His. Kt qu: Gen lukS-PV thu c ỳng kớch thc d kin l 375 bp. Vector tỏi t hp sau khi kim tra bng PCR, enzyme ct hn ch v gii trỡnh t cho kt qu gen lukS-PV chốn ỳng chiu v ng khung trong vector pET22b. Protein PVL-S ó c biu hin thnh cụng vi kớch thc 18 kDa khi chuyn vector pET22b-PVL-S vo t bo BL21(DE3). Kt lun: Protein PVL c biu hin thnh cụng, õy l c s cho nhng nghiờn cu tip theo v protein PVL-S trong vic to khỏng th v nghiờn cu quy trỡnh thu sinh khi ln protein ny ang c tip tc trin khai. T khúa: S. aureus, Panton Valentine leukocidin gene, protein. T VN Staphylococcus aureus (S. aureus) l mt trong nhng tỏc nhõn hng u gõy nhim trựng bnh vin v cng ng. Thờm vo ú l kh nng khỏng cỏc loi khỏng sinh ang gia tng gõy khú khn trong cụng tỏc iu tr, nht l cỏc chng S. aureus khỏng methicillin (MRSA). Nguy him hn l nhng chng S. aureus mang gen lukS-PV mó húa protein PVL [1]. S biu hin PVL l nguyờn nhõn ca nhng tn thng liờn quan n hoi t mụ, tng c lc cho S. aureus v gõy gim s lng bch cu trong t bo ch. PVL c cu to t 2 thnh phn l PVL-S v PVL-F c gn xen k nhau to nờn cu trỳc dng vũng cú hot tớnh [2]. Khi xõm nhp vo vt ch, S. aureus s tng hp hai thnh phn PVL-S v PVL-F di dng monomer hũa tan trong nc. u tiờn PVL-S gn lờn mng bch cu, sau ú s dimerizes vi PVL-F, tip tc gn xen k hỡnh thnh mt cu trỳc dng vũng [3], tri qua nhng thay i v hỡnh dng dn n s hỡnh thnh mt l xuyờn qua mng bch cu dn n vic ly gii lm gim s lng bch cu. Sau khi ly gii, nhng ht trong bch cu s c gii phúng, c th l histamine t basophil. Nhng ht ny s kớch thớch cỏc bch cu trung tớnh sn xut enzyme (-glucuronidase v lysozyme), cỏc thnh phn chemotactic (leukotrimen-B4 v IL-8) dn n mt lot cỏc viờm nhim trung gian [4,5,6]. Nhng phn ng trờn s lm hoi t vựng mụ xung quanh v trớ nhim. Kh nng tng c lc ca nhng chng S. aureus cú biu hin PVL cho ti nay vn cha c lm rừ. Trong nghiờn cu ny, chỳng tụi tin hnh to dũng v biu hin protein PVL-S trong h thng E. coli vi mc tiờu phc v cho cỏc nghiờn cu tip theo v PVL trong vic tỡm hiu c ch gõy bnh cng nh vai trũ ca protein ny trờn cỏc chng MRSA . PHNG PHP NGHIấN CU Chng vi sinh vt v plasmid Chng chun S. aureus ATCC 25923 c s dng thu nhn gen lukS-PV. Chng chun E. coli DH5 (F endA1 hsdR17 (rk-/mk-) supE44 thi recA1 gyrA96 lacU169 (80 lacZ M15)) (Promega) dựng lm chng ch to dũng v lu tr plasmid tỏi t hp. Chng E. coli BL21(DE3) (F dcm ompT hsdSB (rB mB-) gal met) (Promega) dựng biu hin protein tỏi t hp. Plasmid pET22b do hóng Novagen cung cp, chu s kim soỏt ca promoter T7 c dựng lm vector biu hin PVL. Thu nhn gen ớch bng phn ng PCR Phn ng PCR thu nhn gen lukS-PV c tin hnh vi cp mi c hiu cho gen lukS-PV, do chỳng tụi t thit k cú mang trỡnh t nhn bit ca enzyme ct hn ch EcoRI u 5 v NotI u 3 nhm khuch i on gen mc tiờu di 375 bp: 5-CGAATTCATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCC3 v 5 CGCGGCCGCATTATGTCCTTTCACTTTTTTC - 3. Chng trỡnh phn ng PCR bao gm 25 chu k, mi chu k gm 1 bc bin tớnh 94 0 C trong 1 phỳt, 1 bc bt cp 55 0 C trong 1 phỳt v mt bc kộo di 72 0 C trong 1 phỳt; cui phn ng l mt bc kộo di trong 10 phỳt 72 0 C. Sn phm PCR sau ú c bo qun 4 0 C v c kim tra bng in di trờn gel agarose 1,5%. Y HỌC THỰC HÀNH (864) - SỐ 3/2013 41 Thiết lập vector tái tổ hợp pET22b-PVL-S có mang gen lukS-PV Sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme cắt hạn chế EcoRI và NotI. Sản phẩm cắt được nối vào vector biểu hiện pET22b bằng enzyme T4 DNA ligase. Vector tái tổ hợp tạo thành được đặt tên là pET22b-PVL-S và được biến nạp vào E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp. Sàng lọc thể biến nạp và giải trình tự DNA PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu và sử dụng enzyme cắt hạn chế BsaI và XbaI để sàng lọc thể biến nạp. Bên cạnh đó, giải trình tự cũng được dùng trong việc khẳng đình sự đồng khung của gen mục tiêu vào plasmid. Qui trình giải trình tự được thực hiện tại Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh. Trình tự thu nhận được so sánh với trình tự lý thuyết bằng phần mềm ClustalX 2.0.12. Biểu hiện protein PVL-S Tiến hành biến nạp plasmid pET22b-PVL-S vào dòng tế bào E. coli BL21(DE3) và sàng lọc bằng kháng sinh ampicillin và PCR khuẩn lạc. Chọn khuẩn lạc dương tính với phản ứng PCR để tiến hành biểu hiện protein dưới sự cảm ứng của IPTG. Hình 1: Kết quả điên di gen lukS-PV (A): M. Thang 100bp; 1. Chứng âm; 2. Sản phẩm PCR thu nhận gen lukS-PV. (B): M. Thang 100bp; 1. Chứng dương; 2. Chứng âm; 3 và 4. Sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định gen lukS-PV (C): M. Thang 100bp; 1. Chứng dương; 2. Sản phẩm PCR gen lukS-PV từ plasmid 4000 bp 1600 bp 1 2 M Hình 2: Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt hạn chế M. Thang 1kb plus; 1. Plasmid pET22b (chứng dương); 2. Plasmid tái tổ hợp Y HỌC THỰC HÀNH (864) - SỐ 3/2013 42 Phân tích protein PVL-S bằng SDS-PAGE và lai Western blot Các mẫu protein thu được sau khi phá tế bào sẽ được xử lý với dung dịch nạp mẫu 2X (SDS 4%, Tris- HCl (pH=6,8) 0,125M, Sucrose 10%, Bromphenol blue 0,04%, Beta-mercapto 10%). Tiến hành điện di SDS-PAGE với nồng độ gel polyacryclamide là 16%. Protein sau khi điện di được chuyển lên màng lai và thực hiện lai Western blot với kháng thể đơn dòng kháng đuôi 6xHis và phát hiện nhờ kháng thể kháng IgG của chuột cộng hợp với HRPO. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thu nhận gen lukS-PV Gen lukS-PV được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, cho sản phẩm có một vạch có kích thước 375 bp (hình 1A) tương ứng với kích thước gen lukS-PV như đã thiết kế theo lý thuyết. Như vậy, cặp mồi đặc hiệu do chúng tôi thiết kế có thể dùng để thu nhận trình tự gen mục tiêu đúng như trình tự lý thuyết. Tạo vector tái tổ hợp pET22b-PVL-S mang gen lukS-PV Sàng lọc khuẩn lạc và tách chiếc plasmid tái tổ hợp sử dụng cho PCR plasmid với cặp mồi đặc hiệu cho gen lukS-PV, cho kết quả tương ứng với kích thước của gen lukS-PV (hình 1C). Sản phẩm cắt mở vòng của plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme BsaI và XbaI (hình 2) cho một vạch có kích thước khoảng 2000 bp tương ứng với gen lukS-PV chèn vào giữa vị trí của 2 enzyme trên. Plasmid pET22b được cắt với cặp enzyme BsaI và XbaI thì đoạn ngắn chỉ dài khoảng 1650 bp do không có gen lukS-PV chèn vào (hình 2, giếng 1). Như vậy, plasmid thu nhận được là plasmid pET22b có gắn gen lukS-PV. Vector tái tổ hợp pET22b-PVL-S được kiểm tra thêm một lần nữa bằng phương pháp giải trình tự DNA. So sánh kết quả giải trình tự với trình tự gen lukS-PV theo thiết kế cho thấy có sự tương đồng 100% (hình 3). Gen lukS-PV được gắn chèn vào vị trí của enzyme EcoRI và NotI có sự đồng khung dịch mã. . - S 3/2013 40 NGHIÊN CứU BIểU HIệN PROTEIN PANTON VALENTINE LEUKOCIDIN CủA VI KHUẩN STAPHYLOCOCCUS AUREUS Ân Khắc Huy, Nguyễn Thị Phơng Lan, Diệp Thế Tài, Vin Pasteur Tp. H Chớ. trong vic to khỏng th v nghiờn cu quy trỡnh thu sinh khi ln protein ny ang c tip tc trin khai. T khúa: S. aureus, Panton Valentine leukocidin gene, protein. T VN Staphylococcus aureus (S. aureus) . : Panton Valentine leukocidin (PVL) l mt trong nhng c t liờn quan n hoi t mụ, lm tng c lc, úng vai trũ quan trng trong kh nng xõm nhim ca cỏc chng vi khun S. aureus. Nghiờn cu biu hin protein