Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò

coli mang nhiều gen độc lực như gen eae chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc một; gen hly sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stxl, Stx2 sản sinh

Phần 1

MỞ ĐÀU1.1 Đặt vấn đề

Escherichia coli (E colĩ) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một số nhóm E coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non E coli được xem là vi khuẩn chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng của chúng E coli thải qua phân ra môi trường bên ngoài Neu quá trình vệ sinh kém thì E coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi, nhất là trong quá trình giết mố Từ đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E coli

hoàn toàn có thế xảy ra

E coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC Trong đó,

nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E coli) mang nhiều gen độc lực như gen eae chịu trách

nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc một; gen hly sản sinh độc tố gây

dung giải hồng cầu; gen stxl, Stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội chứng viêm kết tràng xuất

huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS = hemolytic uraemic

syndrome) ở người, gen Stx2e sản sinh độc tố vero gây bệnh phùng thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa Trong khi đó, nhóm ETEC (Enterotoxigenic E coli ) mang gen It sản sinh độc tố một kém chịu nhiệt (heat labile toxin = LT) và gen st sản sinh độc tố một chịu nhiệt (heat stable

toxin = ST) gây tiêu chảy trên người và vật nuôi Nhóm EPEC (Enteropathogenic E colĩ)

mang gen eae sản sinh protein intimin,

Trước đây, để phát hiện E coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy tmyền thống.

Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây lan rồi thì mới có kết quả

Hơn nữa, E coli là vi khuẩn bình thường ở đường một và cũng thường có mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E coli trong phân đế tìm nguyên nhân gây bệnh hay

xác định số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toàn không phản ánh được khả năng gây

độc của chúng Do vậy, việc phát hiện các gen gây độc của E coli bằng kỹ thuật PCR là bước

cần thiết góp phần đánh giá nguy cơ gây bệnh trên vật nuôi và con người PCR là phương

pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết quả trong thời gian ngắn, kịp thời phát hiện mầm bệnh để gópphần ngăn chặn tác hại của dịch bệnh

Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Nông Lâm

TP HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị Thu Trang,chúng tôi đã thực hiện đề tài:

“ứng dụng kỹ thuật multiplex - PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn

Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò”

1.2 Mục tiêu

- Phát hiện một số gen độc lực của E coli bằng kỹ thuật multiplex - PCR từ mẫu

phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò

1.3 Mục đích

- Góp phần chẩn đoán và kiếm soát bệnh do E coli gây ra cho động vật và

người.Phần 2 TỎNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn E coli

2.1.1 Định nghĩa

- Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi khoa người

Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông là người đầu tiên phân lập và mô tả vi khuẩn nàyvào năm 1885

- Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo hệ thống

phân loại của Bergey)

- E coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước khoảng l,5//mx 0,5 ụm, không hình thành bào tử và có giáp mô (Trần Thanh Phong, 1996) E co li có

mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong ruột của người và động vật máu nóng, ở phần cuốicủa một non và một già Nó vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực ở đường tiêu hóa, vừa là vikhuẩn gây ra rất nhiều bệnh đường một và ở các cơ quan khác

2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa

- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 35 -37°c, pH thích hợp 6,4 - 7,5 (tối ưu là 7,2

-7,4)

- E coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau trên môi trường chọn lọc ở 37°c trong điều kiện hiếu khí E co li thường được phân lập bằng môi

trường Mac Conkey (MAC) hoặc eosin methylene blue agar (EMB) Trên môi trường thạch

EMB, E coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên môi tmờng thạch Mac Conkey, E coli cho

khuẩn lạc đỏ hồng Ngoài ra, ta có thế sử dụng môi trường SMAC (Sorbitol Mac Conkey) đểphân biệt nhóm STEC không lên men đường sorbitol Trên môi trường SMAC, nhóm STEC

cho khuẩn lạc điển hình màu trắng, hơi nhầy, còn các nhóm E coli lên men sorbitol cho khuẩn

lạc màu hồng (FDA, 2002)

- E coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24 giờ

hình thành những khuẩn lạc dạng s (smooth) màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích

thước khoảng 2 - 3mm

- Trong môi trường lỏng, sau 4-5 giờ, E coli làm đục nhẹ môi trường, càng đế lâu

càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thế có ván mỏng trên mặt môi trường

- Để phân biệt E co li và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng IMVÍC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate) E coli cho kết quả là + + - - (biotype

1) hoặc - + - - (biotype 2) (FAO, 1992)

2.1.3 Yếu tố kháng nguyên

Phân loại huyết thanh học dựa vào kháng nguyên thân o (somatic), kháng nguyên H

(ílagellar) và kháng nguyên bề mặt K (capsular) Có trên 700 loại serotype của E coli đã được công nhận dựa vào những kháng nguyên o, H, K Theo Jay (2000), E co li có trên 200 type

kháng nguyên đã được công nhận và tồn tại khoảng 30 type kháng nguyên H

2.1.4 Ctf chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E coli

Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E coỉv.

- Sản xuất độc tố: Gồm các nhóm như ETEC, EAEC, STEC

- Tấn công - xâm lấn: Gồm nhóm EIEC

- Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm các nhóm như EPEC, EHEC

Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thế vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc hiệu chomỗi loại (Nataro và Kaper, 1998)

2.1.5 Phân loại E coli

Dựa trên đặc điếm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng nhày

của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh), E coli được

chia thành 5 nhóm sau:

> STEC (Shiga toxin - producing E coli) hoặc VTEC (Vero toxingenic E colĩ)

và EHEC (Enterohaemorrhagic E coli)

> EPEC (Enteropathogenic E coli)

> EAEC (Enteroaggregative E coli)

> ETEC (Enterotoxigenic E coli)

> Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:

- EIEC (Enteroinvasive E co li)

- DAEC (Diffusely adherent E coli)

2.1.5.1 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC

a Danh pháp

Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp khác nhau đế

đặt tên cho nhóm E co li này:

- Tên gọi Verotoxigenic E coli hoặc Vero cytotoxin producing E coli (VTEC)

được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhóm này sản xuất độc tố gâyđộc cho dòng tế bào vero vào năm 1997 Tên gọi VTEC được sử dụng rộng rãi ở Anh và nhiều

tố chức khoa học ở Châu Âu

- Tên gọi Enterohaemorrhagic E coli (EHEC) được đặt là do dòng này gây viêm

kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS: haemolyticuraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998)

Tên Shiga to xin producing E coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like toxin producing E coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố Shiga

-(Caldenvood và ctv, 1997) Tên gọi STEC được sử dụng nhiều trong các tạp chí khoa học ởMỹ

STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau và cả hai đều chỉ ra rằng nhóm E.

co li sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào Mặc dù vậy, không phải có gen sản sinh độc tố là có thế gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác Những dòng E coli mang

gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe mạnh với một số lượng rất ít, nhưngnhững dòng này thiếu một vài hay tất cả những yếu tố độc lực khác nhau của STEC (Beutin vàctv, 1995) Do đó, không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998)

b Shiga toxin và những yếu tổ khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC

* Shiga toxin

Những dòng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay còn được gọi là Verotoxins(VT) hoặc Shiga - like toxins (Slt)

Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stxl và Stx2,

được mã hóa bởi gen stxl và Stx2 Cả hai độc tố này được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B (được mã hóa bởi stxB) và 1 tiểu đơn vị A (được mã hóa bởi stxA) Cả hai gen stxA và stxB được định vị

trên bacteriophage ôn hòa được chèn vào trong nhiễm sắc thể (NST) của STEC Một dòngSTEC chỉ sản xuất độc tố Stxl, hoặc Stx2, hoặc cả hai, hoặc thậm chí nhiều dạng Stx2 Badạng Stx2 được xác định: Stx2, Stx2c, và Stx2e (Pierard và ctv, 1998) Subtype Stx2e gâybệnh phù thủng ở heo hơn là gây bệnh ở người Nhưng thỉnh thoảng những dòng này cũng cóthế được phân lập từ bệnh nhân HUS (Thomas và ctv, 1994) Nhiều khi người ta có thể thaythế giữa thuật ngữ Stx và VT (ví dụ: Stxl = VT1 = Sltl, Stx2e = VT2e = Slt2e v.v )(Caldervood và ctv, 1997) Hầu hết những phương pháp chẩn đoán phân tử đều có mục tiêuphát hiện gen mã hóa Stx của nhóm STEC (Cocolin và ctv, 2000)

* Những yếu tổ độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC

Những yếu tố độc lực khác của STEC là enterohaemolysin (Ehly) và có thế là heat stable enterotoxin (EAST1) Gen mã hóa Ehly nằm trên plasmid 60 - MDa mà plasmid nàyđược tìm thấy ở nhiều dòng 0157:H7 và cũng hiện diện ở các dòng STEC không phải 0157 ỞĐức, gần 90% dòng STEC được phân lập từ bệnh nhân có gen mã hóa Ehly (Beutin và ctv,1994) Tuy nhiên, việc sản sinh Ehly như là một yếu tố độc lực thì khó đánh giá, vì trong các

-nghiên cứu của tác giả này, E coli có Stx âm tính và Ehly dương tính là nguyên nhân làm hư

hại tế bào vero, Hep-2 hoặc Hela in vitro (Beutin và ctv, 1989) EAST1 đầu tiên được mô tảtrong EAEC cũng được tìm thấy trong nhiều dòng STEC EAST1 trong mầm bệnh của STECthì không được biết, nhưng nó có thế liên quan đến một số bệnh tiêu chảy không có máuthường xuyên được tìm thấy ở những người bị nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998)

Yeu tố bám dính của STEC đóng vai trò quan trọng cho vi khuẩn định vị ở tế bào ruột

Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng phân tử 94 - 97 kDa Protein intimin được mã

hóa bởi gen eae (E coli attaching và etĩacing) Intimin gây tốn thương dạng bám dính và phá

hủy (attaching - and - effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biếu mô

(Donnerberg và ctv, 1993) Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC Gen eae là một

trong số các gen nằm trong vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột - locus

of enterocyte effacement, LEE) Vùng LEE của STEC chứa những gen mã hóa intimin, gen

mã hóa thụ thế đế vận chuyến intimin là Tir (translocated intimin receptor) và một số genkhác Vùng LEE không chỉ là điều kiện cần mà là điều kiện đủ cho việc hình thành tốn thương

A/E Tuy nhiên, không phải tất cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae

(Nataro và Kaper, 1998) Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein màng ngoài vikhuẩn (protein intimin) và protein Tir Protein Tir được tiết ra khỏi vi khuẩn, chuyến vị vàomàng của tế bào vật chủ (Kenny và ctv, 1997)

Hầu hết các ổ dịch do STEC gây ra bởi những dòng 0157:H7, nên người ta cho rằng cóthế serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype khác Dấu hiệu sinh hóa duynhất cho những dòng STEC 0157:H7 là không thể lên men sorbitol hoặc không tạo ra/? -

glucuronidase Vì thế, ở nhiều quốc gia, chẩn đoán STEC chỉ dựa vào việc phát hiện E coli

không lên men sorbitol 0157:H7 và các serotype không phải 0157 liên quan đến việc gây bệnh ở người gồm 026:H11, O103:H2, 0111:H NM và 0113:H21 (WHO, 1994).

c Nguồn lây nhiễm

STEC có thể được tìm thấy trong phân nhiều loài động vật như trâu, bò, cừu, dê, heo,chó, mèo (Beutin và ctv, 1993; Chapman và ctv, 1997) và ngựa (Chalmers và ctv, 1997) vàngay cả chim hải âu (Makino và ctv, 2000) Loài động vật quan trọng nhất trong việc lâynhiễm cho người là bò Đường lây nhiễm chủ yếu của STEC vào chuỗi thực phẩm là việc vấynhiễm những thành phần trong một và phân trong quá trình giết mổ (Butler, 1996).

STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước và từ người này sang ngườikhác Hầu hết các trường hợp bệnh là do ăn thực phẩm đã bị nhiễm, đặc biệt là thực phẩm cónguồn gốc động vật Trong đó thịt bò là nguyên nhân chủ yếu (Keskimaki, 2001)

2.1.5.2 Nhóm EPEC

Thuật ngữ enteropathogenic E coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv (1955) để chỉ những dòng E coli gây tiêu chảy ở trẻ em.

a Đặc điểm

Cũng như STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi khuẩn bám

dính vào niêm mạc một và gây hư hại (A/E); nhưng EPEC không sản xuất độc tố Shiga

b Sự bám dính và phá hủy (AE) của những dòng EPEC

Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thể quansát được trên mẫu sinh thiết một từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm và trong nuôi cấy tế bào(Nataro và Kaper, 1998) Dạng tốn thương này được đặc trưng bởi sự hư hại của các vi nhungmao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biếu mô Tốn thương này khác với dạng

tốn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và V cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung mao) Gen cần thiết cho việc tạo tốn thương A/E là gen eae mã

hóa intimin Protein này là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993) Theo

Nataro và Kaper (1998), gen eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Closfridium rodentium và Hafnia alvei, nhưng không hiện diện ở những dòng E coli thuộc hệ vi khuẩn

đường ruột thông thường

c Dịch tễ của sự nhiễm EPEC

Cũng như những E co li gây bệnh khác, sự truyền lây của EPEC qua đường miệng,

với sự vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm

Điểm đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ của bệnh do EPEC là sự phân bố lứa tuổi Bệnhthường biếu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng ở trẻ em Người trưởng thành và trẻ emlớn có phần đề kháng hom với bệnh mà nguyên nhân có thế là do mất các thụ thế đặc hiệu.Tuy nhiên, EPEC cũng có thế gây tiêu chảy ở người lớn nếu số lượng vi khuẩn đủ cao

2.1.5.3 Nhóm ETEC

a Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là độc tố ruột (enterotoxin) và

yếu tố định vị (colonization factor - CF)

Độc tổ ruột enterotoxin

❖ Độc tổ ruột enterotoxin

Nhóm ETEC sản sinh độc tố một Có hai loại: độc tố một chịu nhiệt (ST) và độc tốmột kém chịu nhiệt (LT)

(1) Độc tổ kém chịu nhiệt (heat - labile toxin - LT):

Độc tố LT của E coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin - CT) do Vibrio cholerae tiết ra LT và CT

giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tươngđồng về thụ thế, hoạt tính enzyme, và kiểu tác động của nó trên động vật hay trong nuôi cấy tếbào LT có hai serogroup chính là LT-I và LT-II LT-I và LT-II không có phản ứng chéo vềmặt miễn dịch

- LT-I: Được tiết bởi những dòng E coli gây bệnh trên người và thú LT-I là một

oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5kDa Tiếu đơn vị A chịu trách nhiệm như một enzym, gồm peptide Ai và peptide A2 liên kếtnhau bởi cầu nối disultur Những tiếu đơn vị B sắp xếp thành vòng nhẫn, liên kết chắc chắnvới ganglioside GM] và liên kết lỏng lẻo với GDlb và vài glycoprotein một (các thụ thế củaLT) Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và phản ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp-I)đầu tiên được phân lập từ heo và LTh (LTh- I) được phân lập từ người Gen mã hóa cho LT là

elt hay lt-I nằm trên plasmid mà plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và / hoặc gen mã

hóa những kháng nguyên của yếu tố định vị (colonization factor antigen - CFA)

Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-I thâm nhập quamàng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăng mức AMP vòng(cAMP) trong tế bào cAMP hoạt hóa protein kinase (A kinase) từ dạng không hoạt độngthành dạng hoạt động Điều này dẫn đến sự phosphoryl những kênh chloride hoạt động trênmức bình thuờng ở màng tế bào biếu mô Ket quả là kích thích những tế bào mào ruột tiết raCl" một cách tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu NaCl bởi những tế bào nhung mao (villus).Đây chính là nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy dữ dội (Nataro và Kaper, 1998)

- LT - II: LT-II có cấu trúc giống với LT - I và CT khoảng 55 - 57% ở tiểu đơn vị A,nhung không giống với LT-I và CT ở tiếu đơn vị B LT-II cũng làm gia tăng cAMP trong tếbào qua cơ chế tuơng tự nhu LT-I, nhung LT-II không liên quan đến bệnh trên nguời và thú

(2) Độc tổ chịu nhiệt (heat - stable toxin - ST)

Nguợc với LT, ST có trọng luợng phân tử nhỏ và những cầu nối disulíur của nó giảithích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này ST đuợc chia thành hai nhóm là STa và STb Hainhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động Gen mã hóa cho cả hai nhóm đuợc tìmthấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng đuợc tìm thấy trên transposon Độc tố

STa (hay còn gọi là ST-I) do ETEC sản sinh và một vài vi khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica và V cholerae không phải 01 ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu

nhiệt EAST1 của EAEC Một số báo cáo gần đây cho rằng một vài dòng thuộc nhóm ETECngoài việc sản sinh ra STa, còn có thể sản sinh độc tố EAST1 Trong khi đó, STb chỉ đuợc tìmthấy ở ETEC

- STa: STa là một peptide gồm 1 8 - 1 9 acid amin với trọng luợng phân tử khoảng 2

kDa STa đuợc chia thành hai loại là STp (ST porcine hoặc STIa) từ E coli phân lập đuợc trên heo và STh (ST human hoặc STIb) của E coli phân lập trên nguời Cả hai độc tố có thế đuợc

tìm thấy ở các dòng ETEC trên nguời

Thụ thế chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase c (GC-C) STa kết

hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng luợng cGMP nội bào Hoạt độngnày cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl" và / hoặc ngăn cản sự hấp thu NaCl, dẫn đến tăngluợng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu chảy

- STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ heo, vàichủng ETEC được phân lập từ người cũng sản sinh STb Không như STa, STb gây ra nhữngtổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của lớp biểu môruột và teo nhung mao một phần Thụ thể của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người tacho rằng độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào bên trong tế bào.Không gây ra sự tiết cr nhưng STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3) STb khônglàm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoạibào STb còn kích thích phóng thích PGE2 và serotonin, từ đó người ta cho rằng hệ thần kinhruột cũng có thế liên quan đến đáp ứng tiết dịch gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi và ctv,1992)

Yếu tố định vị (colonization factor - CF)

❖ Độc tổ ruột enterotoxin

Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy một đã được nghiên cứu kỹ

Đe gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào một non nhờ vào lông trên bề mặtcủa vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor antigens)

CFA có thế được phân loại dựa trên đặc tính hình thái Có 3 loại chính gồm loại lônghình que cứng, lông hình que mềm dạng bó, lông có cấu trúc mảnh mềm Có ít nhất 20 loại CFtrong ETEC ở người Hầu hết, chúng được mã hóa bởi gen nằm trên plasmid, cũng là nơi mãhóa độc tố ST và/hoặc LT (Gaastra và Svennerholm, 1996) Tiểu đơn vị cấu trúc lông thườngtạo miễn dịch vượt trội do đó tiểu đơn vị có tính kháng nguyên rất mạnh,

b Dịch tễ

Dòng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trên trẻ em thôi

bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở khách du lịch Dịch tễ của bệnh do ETECđược quyết định bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dịch tại màng nhầy khác nhau của từng cá thế đốivới sự nhiễm ETEC, (2) những người nhiễm không có biếu hiện triệu chứng vẫn bài thải mộtlượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm chỉ đạt được khi liều gây nhiễm khá cao Ba đặctính này tạo nên tình trạng ô nhiễm ETEC trong môi tmờng ở những vùng có dịch và hầu hếttrẻ em trong vùng này sẽ đương đầu với ETEC trong thời kì thôi bú Trẻ em đã ở tuối đếntrường và người lớn có nguy cơ tiêu chảy do ETEC rất thấp Dòng ETEC sản sinh ST lànguyên nhân của hầu hết các trường hợp bệnh

Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn và nước bị ô nhiễm là nhữngphưong tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black và ctv, 1981) Sự nhiễm ETEC, ở những vùngdịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng nóng và ẩm; khi đó, sự nhân lên mạnh mẽ củaETEC trong thực phẩm và nước

Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những người trưởng thànhchưa có miễn dịch cũng dễ bị nhiễm Thật vậy, ETEC là nguyên nhân chính gây tiêu chảy trên

du khách trưởng thành từ những nước đã phát triển đến thăm những vùng có dịch ETEC.Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60% số du khách này có triệu chứng tiêu chảy và 20 - 40%các trường hợp là do ETEC Tiêu chảy trên du khách thường xảy ra ở những du khách lần đầutiên đến thăm những nước đang phát triển Tiêu chảy trên du khách thường là do thức ăn vànước uống bị ô nhiễm

c Khía cạnh lâm sàng

Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14-50 giờ).Bệnh nhân tiêu chảy toàn nước, thường không có máu; một vài bệnh nhân có hiện tượng sốt và

ói mửa Tiêu chảy do ETEC có thế nhẹ, ngắn và tự bớt dần nhưng cũng có thế gây ra tiêu chảy

nghiêm trọng giống như nhiễm Vibrio cholerae.

Hầu hết các trường họp nhiễm ETEC nguy hiếm đến tính mạng xảy ra trên trẻ em thôi

bú ở những nước đang phát triển Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảm cũng làm giảmmức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trị có hiệu quả thì không sẵn có ở những vùng nguy cơcao; ngoài ra sự đề kháng kháng sinh của dòng ETEC cũng là vấn đề đáng quan tâm Do đócần phải lưu ý rằng cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhân nhiễm ETEC là duy trì đủ lượng nướctrong cơ thế nếu có triệu chứng tiêu chảy

d Phát hiện và chẩn đoán

Việc phát hiện nhóm ETEC dựa vào sự phát hiện độc tố LT và/hoặc ST Có nhiềuphương pháp phát hiện ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linked immunosorbent assay(ELISA), DNA-probe, PCR

2.2 Kỹ thuật PCR

2.2.1 Nguyên tắc

PCR (polymerase Chain reaction - phản ứng tống họp dây chuyền nhờ polymerase) doKary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 PCR là kỹ thuật in vitro cho phép nhân nhanhmột gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn (tạo dòng in vitro, không cần

sự hiện diện của tế bào)

Sự khuếch đại những primer oligonucleotide Primer là những phân tử DNA đơn,ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn (trình tự DNA mẫu xétnghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) trong điều kiệnphản ứng thích hợp Các primer này gồm có primer “xuôi” (forward primer) và primer

“nguợc” (reverse primer) Ket quả là sẽ có những chuỗi DNA mới bổ sung với sợi DNA mẫu.Những chuỗi này sẽ tồn tại duới dạng DNA chuỗi đôi Sự tống hợp này sẽ đuợc lặp lại theomột số chu kỳ nhất định đã đuợc thiết lập

Multiplex - PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồngthời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp primer trong một phản ứng.Multiplex - PCR đầu tiên đuợc mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kế từ đó multiplex - PCRđuợc ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiếm tra DNA (Protocol Online)

2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm ba giaiđoạn:

> Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)

Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn Phân tử DNA đuợc biến

tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thuờng là ở 94 -95°c trong vòng

30 giây đến 1 phút

> Giai đoạn 2\ Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)

Nhiệt độ đuợc hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp với

khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 - 60°c tuỳ thuộc Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút.

> Giai đoạn 3\ Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)

Nhiệt độ giai đoạn này đuợc tăng lên 72°c giúp DNA polymerase hoạt động tổng họp

DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate Đoạn DNA nằm giữahai primer đuợc tổng họp tạo thành chuỗi DNA

* Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ đuợc lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng đôiluợng DNA mẫu của lần truớc Tống DNA khuếch đại đuợc tính theo công thức: Tổng DNAkhuếch đại = m*2n Với n: Số chu kỳ; m: số bản sao của chuỗi mã hóa

* Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài không xác định vì DNApolymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khỉ nó dừng lại hoặc bị phá hủy bởi chu kỳ tiếptheo Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng không xác định Tuy nhiên, ở chu kỳ thứ 3, đoạnDNA mong muốn (DNA đích) được tổng hợp có chiều dài xác định Từ chu kỳ thứ 4 trở đi,trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại Vì thế số copy cuối cùng của trình tự đích được tínhtheo công thức:

Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2n - 2n) * X

n : Số chu kỳ

2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2

X : Số bản sao của chuỗi mã hóa

* Số chu kỳ của phản ứng PCR

- Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong 1 phản ứng, vì phản ứng PCR diễn

ra qua hai giai đoạn:

+ Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫuban đầu

+ Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:

■ Phân hủy và cạn kiệt cảc thành phần của phản ứng

■ Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng

■ Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với prỉmer mà lại bắt cặp vớinhau

Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu DNA mẫu ban đầu là 105 thìcần khoảng 25 - 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 102 - 103 thì số chu kỳ phải là 35

Hình 2.1 Nguyên Ịỷ của phản ứng PCR

- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.

- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đon, có trình tự bố sung vớitrình thự base của hai đầu mạch khuôn đế khởi đầu quá trình tống họp DNA Việc chọn primer

là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR Các primer đuợc chọn phải đặc trung cho trình tựDNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen, không có sự bắt cặp bổsung giữa primer xuôi và primer nguợc và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp

bổ sung trong cùng một primer Chiều dài các primer tối thiếu cho hầu hết các ứng dụng PCR

là 18 nucleotide (thuờng là 1 8 - 2 4 nucleotide) Trình tụ nằm giữa hai primer xuôi và nguợckhông quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối uu trên những trình tự nhỏ hơn lkb

- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, đuợc chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquatỉcus ở suối nuớc nóng Taq DNA polymerase không bị phá hủy

ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng họp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng duới sự hiện diện của

Mg2+ Taq DNA polymerase tổng họp DNA theo huớng 5’—>3’ và hoạt động tốt nhất ở

ảnh huởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR Ngoài ra nồng độ MgCl2 cóthế ảnh huởng đến quá trình bắt cặp của primer, nhiệt độ đế biến tính DNA thành dây đơn,hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả Nồng độ Mg2+ phải đuợc xác định chotừng phản ứng qua nhiều thử nghiệm Nồng độ MgƠ2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùngthuờng biến thiên từ 0,5 - 5mM (Hồ Huỳnh Thùy Duơng, 1998).

2.2.4 Phân tích kết quả PCR

Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA đuợc khuếch đại) sẽ đuợc phát hiện bằngphuơng pháp điện di

Nguyên tắc của phuơng pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA DNA

là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điệntruờng, chúng sẽ di chuyển về điện cực duơng của điện truờng Sự di chuyển của phân tử trongbản gel duới tác động của một điện truờng phụ thuộc vào khối luợng của các phân tử (tức là sốnucleotide), nồng độ các thành phần của gel và điện thế

Điện di đuợc thực hiện theo phuơng nằm ngang hoặc đứng Các DNA trong gelagarose đuợc hiện ra duới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide Chất này có khả năng gắn

xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang duới tác dụng của tia uv (buớc sóng Ả

=300 nm) thành vạch màu đỏ da cam

Đe uớc luợng kích thuớc DNA bằng gel agarose, nguời ta sử dụng một yếu tố đánhdấu “trọng luợng phân tử” (molecular weight make - MWM) là một tập họp nhiều trình tựDNA có kích thuớc đã biết (DNA ladder)

2.2.5 Những ứng dụng của PCR

2.2.5.1 PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ

PCR có khả năng sử dụng một phân tử DNA đơn như là khuôn mẫu cho phản ứngkhuếch đại Việc khuếch đại thành công DNA được ly trích từ tế bào gốc chỉ chứa một copyđơn của bộ gen ở người đã chứng minh được điều này

Khía cạnh này của PCR đã được chứng minh là rất quan trọng trong các phân tíchpháp lý, cho phép kỹ thuật genetic hngeprinting được sử dụng chỉ với một sợi tóc và thậm chívới những vết máu, khiến cho những tên tội phạm khó có thể lọt lưới pháp luật PCR cũngđược sử dụng để khuếch đại DNA từ xương của những nạn nhân bị giết (trong một vài trườnghọp xác định danh tánh của họ) trong khi các phần thân xác còn lại đã bị phân rã, do đó khôngthế sử dụng các phương pháp phân tích thông thường

Tính nhạy cảm của PCR mở ra những khả năng mới trong khảo cố và cố sinh vật học,bằng cách làm cho các trình tự nucleotide được thu nhận từ các dấu vết DNA hiện diện trongcác nguyên liệu được bảo tồn hay nguyên liệu hóa thạch Phương pháp PCR cũng được sửdụng để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của người cổ xưa thông qua khuếch đại và phân tíchcác trình tự di truyền từ các dấu vết DNA được giữ trong xương hay được bảo tồn trong cácxác ướp.

2.2.5.2 PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng

Phương pháp PCR cho phép các thông tin giải trình tự được thu nhận một cách nhanhchóng, thông qua việc khuếch đại vùng liên quan trên genome dựa trên các kết quả phân tíchtrực tiếp từ các sản phẩm của PCR Khả năng nhận biết đột biến một cách nhanh chóng khôngchỉ quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng mà nó cũng làm gia tăng các nghiên cứu các bệnh ditruyền

PCR cũng được ứng dụng trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh Ví dụ: Khuếch đạiDNA của các vi khuẩn, virus trong các mẫu bệnh phẩm trước khi các triệu chứng bệnh bắt đầuxuất hiện nhiều ngày, nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng Từ đó ta có thế đề ra cách chữa trịthích họp và ngăn chặn được thiệt hại

2.2.5.3 PCR được dùng để khuếch đại RNA

PCR không chỉ khuếch đại các khuôn mẫu DNA, các khuôn mẫu RNA cũng đượckhuếch đại nếu ban đầu chúng được biến đối thành DNA tái tố họp (cDNA) nhờ enzymereverse transcriptase

Một ứng dụng có ích của RT - PCR là xác định số lượng tương đối của một mRNAtrong các mô khác nhau hay trong cùng một mô nhưng tại các thời điếm khác nhau Số lượngcủa một mRNA trong tế bào chính là sự phản ảnh về khả năng hoạt động của gen cha mẹ Vìthế, sự xác định số lượng của mRNA tạo ra những thay đối trong sự biểu hiện gen để chúng cóthể được kiểm soát

2.2.5A PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau

Sự khuếch đại ngẫu nhiên (random ampliíication) với các primer ngắn là kỹ thuật hữudụng trong phát sinh chủng loại, khu vùng nghiên cứu liên quan đến sự tiến hóa và suy vongcủa các loài hay các nhóm sinh vật khác Hai sinh vật có quan hệ thân tộc sẽ có nhiều bandgiống nhau hơn hai sinh vật có quan hệ thân tộc kém (Brown, 1994)

2.2.6 Các hạn chế của phương pháp PCR

Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời với thao tác đơn giản, người ta có khuynhhướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề Tuy nhiên, ta không thế quênrằng phương pháp có nhiều hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệmcũng như khi phân tích kết quả Có thế kế ba vấn đề lớn khi sử dụng phương pháp PCR:

2.2.6.1 Trong thực nghiệm, kích thước các đoạn cần khuếch đại là giói hạn đầu tiên

Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với nhữngđoạn DNA lớn hơn 3 kb Việc sử dụng PCR đối với các DNA có độ dài dưới 1,5 kb cho kếtquả tốt Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thựcnghiệm

2.2.6.2 Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đổi với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao đổi vói phương pháp này

Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán vì hậu quả rất nghiêmtrọng Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao táctrước Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau những lần khuếchđại trong một khoảng không gian kín trong phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã đượckhuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết

bị dung cụ rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó Có thế khắc phục một phần vấn đềnày bằng một số biện pháp sau:

- Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tíchcác sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điếm cách xa nhau

- Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng cho cácthao tác khác Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm vào đầumicropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng

- Dùng tia tử ngoại đế loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đạitruớc

- Tất cả các thành phần phản ứng đều đuợc chia thành những luợng nhỏ, tínhtoán sao cho 1, 2 lần thao tác

2.2.6.3 Các sai sót gây ra do Taq polymerase

Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10~4, nghĩa là cứ 10000 nucleotide thìenzyme gắn sai 1 nucleotide) Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kíchthuớc hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhung có ý nghĩa lớn nếu cần xác địnhchính xác trình tự nucleotide của DNA Ta không thế loại bỏ hoàn toàn các sai khác này màchỉ có thế giảm bớt; ví dụ nhu đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng,xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh truớc khi

đi đến trình tự chính thức, Phần 3

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

- Xác định các gen độc lực được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí NghiệmHóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

3.2 Nội dung

- Thu thập mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò

- Nuôi cấy, phân lập E coli trên môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC.

- Chọn khuẩn lạc điển hình của E coli / nhóm E coli.

- Giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch NA

- Ly trích DNA của E coli phân lập được.

- Thực hiện phản ứng multiplex - PCR đế phát hiện gen gây độc của E coli.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Lấy mẫu

- Mẩu phân tiêu chảy

Được lấy từ trực tràng bằng tăm bông rồi cho vào môi trường vận chuyến Carry Blair.Bảo quản ở 4 - 8°c cho đến khi tiến hành xét nghiệm (mẫu được giữ tối đa 24 giờ)

- Mẩu bề mặt thịt

Dùng gạc y tế tẩm nước muối sinh lý quét đều lên bề mặt thịt, cho vào chai có sẵn 50

ml nước peptone đệm Sau đó đậy chặt chai, cho vào túi ny lông buộc kỹ Bảo quản 4 - 8°c,chuyển về phòng thí nghiệm

- Số lượng mẫu: số lượng mẫu khảo sát được tính là số mẫu đã phân lập được vi

khuẩn E coli từ các mẫu đã lấy.

3.3.2 Nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E coli

3.3.2.1 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Mac Conkey (MAC), Sorbitol- SMAC,thạch dinh dưỡng (NA), peptone đệm, Cefixime-Tellurite-SMAC (CT- SMAC), hóa chất thửIMVÍC

3.3.2.2 Nuôi cấy và phân lập

(1) Mầu phân tiêu chảy được cấy trực tiếp trên đĩa thạch MAC và SMAC để có

những khuẩn lạc rời rạc sau 24 giờ ở 37°c Mau bề mặt thịt được làm đồng đều trong 125 ml

peptone đệm phosphate có bố sung kháng sinh cetixime với nồng độ 0,0125 mg/1,

vancomycin với nồng độ 8 mg/1 (FDA, 2002) ủ 24 giờ ở 37°c, cấy sang môi trường

CT-SMAC Vi khuẩn E coli nhóm STEC phát triển tạo khuẩn lạc không màu hoặc xám với tâm đục, E coli khác cho khuẩn lạc hồng giống như trên môi trường MAC.

(2) Chọn khuẩn lạc điển hình của E co li

- Quan sát các loại khuẩn lạc hiện diện trên bề mặt thạch MAC, SMAC, CT- SMAC

- Mỗi nhóm khuẩn lạc chọn 6 - 1 0 khuẩn lạc rời rạc đại diện E coli của mẫu khảo

sát Các nhóm khuẩn lạc như sau:

s 6 - 1 0 khuẩn lạc hồng MAC (Ký hiệu HM) s 6 - 1 0

khuẩn lạc trắng SMAC (Ký hiệu TS)

■S 6 - 1 0 khuẩn lạc đỏ hồng SMAC (Ký hiệu HS).

6 - 1 0 khuẩn lạc trắng CT - SMAC (Ký hiệu TC)

(3) Tăng sinh, giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên môi trường thạch dinh dưỡng

(NA)

- Mỗi khuẩn lạc được chọn cấy chuyển vào ống thạch NA Phần khuẩn lạc còn lại củamỗi nhóm được thu gom chung vào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml nước cất khử ion vôtrùng đế ly trích DNA nhóm khuẩn lạc (DNA tống)

(4) Thử sinh hóa

- Sau khi nuôi cấy, mỗi khuẩn lạc rời rạc trên được thử phản ứng IMVÍC để xác định

E co li.

3.2.2.3 Ly trích DNA khuẩn lạc

Sau khi đã thu nhóm khuẩn lạc trong ống eppendorf và giữ gốc từng khuẩn lạc riêng

lẻ Mỗi gốc được cấy sang đĩa NA Sau 24 giờ ở 37°c, thu 6 - 1 0 khuẩn lạc cho vào eppendorf

chứa sẵn 0,4 - 0,5ml H20 cất khử ion vô trùng Tiếp theo, chúng tôi tiến hành ly trích DNA đạidiện nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ

Dựa theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với phương pháp ly trích DNA từ E coli của Cema và ctv (2003) và Botteldoom và ctv (2003) để tiến hành ly trích DNA từ vi khuẩn E coli phân lập được bằng phương pháp nhiệt như sau: đun sôi 10 phút rồi chuyển vào tủ -70°c

để trong 10 phút, rã đông rồi ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút Thu phần nổi làm DNAkhuôn mẫu (DNA xét nghiệm)

- Quy trình phân lập vi khuẩn E coli như sau:

Phân

Mầu

Thịt Peptone (vancomycin, cehxime)(37°c/24h)

Multiplex-So' đồ 3.1 Phân lập, xác định E coli và phát hiện gen độc lực

3.3.3 Xác định các gen stxl, Síx2, eae, hly, Stx2e, sta, stb, lt-I của E coli phân lập được

bằng multiplex - PCR

Việc phát hiện các gen độc lực của E coli được thực hiện bằng 2 phản ứng multiplex

-PCR với máy luân nhiệt (thermal cycler):

s Multiplex - PCR1: Phát hiện các gen eae, hly, stxl, Stx2.

S Multiplex - PCR2: Phát hiện các gen Stx2e, sta, stb, lt-I.

- Trong quá trình thực hiện phản ứng multiplex - PCR, mẫu đối chứng dương (EDL933hoặc H44) được thực hiện đồng thời với mẫu khảo sát

S EDL933 là đối chúng dương với các gcn eae, hly, stxl,stx2.

S H44 là đối chứng dương với các gen Stx2e, stb, lt-I.

Hai mẫu đối chứng dương này được cung cấp từ Trường đại học Thú y Toulouse (Pháp)

Multiplex - PCR1

❖ Độc tổ ruột enterotoxin

Gen độc lực

Primer Trình tự đoạn primer (5’-> 3’)

Kích cỡ đoạn DNA khuếch đại (bp)

GGC ACT GT CT G AAACT GCTCCTCGCC AGTT AT CT G AC ATT CT G

255

eaeA

Eae-FEae-R

GACCCGGCACAAGCATAAGC

MyA

HlyA-FHlyA-R

GCATCATCAAGCGTACGTTCC

* Trình tự các primer sử dụng trong multiplex - PCR1

(Dần liệu củaPaton & Paton, 1998a) * Các thành phần của phản ứng multiplex - PCR1:

PCRbuffer IX: Tris-HCl (pH 8,8 ở 25°C) 750 mM, (NH4)2S04200 mM, 0,1 % Tween 20; MgCl2 2mM; dNTP 200 //M; mỗi loại primer

250 mM Taq - polymerase AB gene 0.5UI; DNA khuôn mẫu 1 n 1; nước cất 2 lần khử ion vừa đủ 50 n 1.

* Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex - PCR1 (Paton và Paton, 1998a):

3.3.4 Điện di trên gel aragose và đọc kết quả điện di

Sau phản ứng multiplex - PCR, 6 ỊJ,\ sản phẩm PCR cùng với

1,2 ụ, \ loading dye được điện di trên gel agarose 1,4% trong TBE 0,5X Ladder cũng được điện

di đồng thời Thời gian điện di là 30 - 35 phút ở 100V, 250mA

lt-I

LT-FLT-R

TTAATAGCACCCGTACAAGCAGG CTT G

stb

STb-FSTb-R ATCGC ATTT CTT CTT GC AT c

GGGCGCCAAAGCATGCTCC

172

Vt2e

Vt2e-FVt2e-R CCTT AACT AAAAGG AAT AT A

CTGGTGGTGTATGATTAATA

230(Dần liệu của Blanco và ctv, 1997)

25 chu kỳ