Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò

1 Phần MỞ ĐÀU 1.1 Đặt vấn đề Escherichia coli (E colĩ) vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu hệ vi sinh vật đường ruột người động vật Tuy nhiên, có điều kiện thích hợp, số nhóm E coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng người gia súc, đặc biệt gia súc non E coli xem vi khuẩn danh ô nhiễm thực phẩm nước dựa vào số lượng chúng E coli thải qua phân môi trường bên ngồi Neu q trình vệ sinh E coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi, q trình giết mố Từ việc bảo quản chế biến thực phẩm khơng thích hợp ngộ độc thực phẩm E coli hồn tồn xảy E coli chia thành nhiều nhóm STEC, EPEC, ETEC, EAEC Trong đó, nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E coli) mang nhiều gen độc lực gen eae chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc một; gen hly sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stxl, Stx2 sản sinh độc tố shiga gây hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) hội chứng huyết niệu (HUS = hemolytic uraemic syndrome) người, gen Stx2e sản sinh độc tố vero gây bệnh phùng thủng tiêu chảy heo cai sữa Trong đó, nhóm ETEC (Enterotoxigenic E coli ) mang gen It sản sinh độc tố chịu nhiệt (heat labile toxin = LT) gen st sản sinh độc tố chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu chảy người vật ni Nhóm EPEC (Enteropathogenic E colĩ) mang gen eae sản sinh protein intimin, Trước đây, để phát E coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy tmyền thống Phương pháp gặp khó khăn tốn thời gian, dịch bệnh lây lan có kết Hơn nữa, E coli vi khuẩn bình thường đường thường có mặt thực phẩm nên việc phân lập vi khuẩn E coli phân đế tìm nguyên nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn thực phẩm hồn tồn khơng phản ánh khả gây độc chúng Do vậy, việc phát gen gây độc E coli kỹ thuật PCR bước cần thiết góp phần đánh giá nguy gây bệnh vật nuôi người PCR phương pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết thời gian ngắn, kịp thời phát mầm bệnh để góp phần ngăn chặn tác hại dịch bệnh Do đó, đồng ý Bộ mơn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Nông Lâm TP HCM, hướng dẫn PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị Thu Trang, thực đề tài: “ứng dụng kỹ thuật multiplex - PCR để phát gen độc lực vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy thịt bò” 1.2 Mục tiêu - Phát số gen độc lực E coli kỹ thuật multiplex - PCR từ mẫu phân tiêu chảy bò, bê, heo mẫu bề mặt thịt bò 1.3 Mục đích - Góp phần chẩn đốn kiếm sốt bệnh E coli gây cho động vật người.Phần TỎNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn E coli 2.1.1 Định nghĩa - Vi khuẩn Escherichia coli tên đặt theo tên nhà bác sĩ nhi khoa người Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông người phân lập mô tả vi khuẩn vào năm 1885 - Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo hệ thống phân loại Bergey) - E coli trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước khoảng l,5//mx 0,5 ụm, khơng hình thành bào tử có giáp mơ (Trần Thanh Phong, 1996) E co li có mặt thường xuyên chiếm ưu ruột người động vật máu nóng, phần cuối non già Nó vừa vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hóa, vừa vi khuẩn gây nhiều bệnh đường quan khác 2.1.2 Ni cấy đặc điểm sinh hóa - Nhiệt độ ni cấy thích hợp 35 -37°c, pH thích hợp 6,4 - 7,5 (tối ưu 7,2 -7,4) - E coli phục hồi dễ dàng từ mẫu có nguồn gốc khác mơi trường chọn lọc 37°c điều kiện hiếu khí E co li thường phân lập môi trường Mac Conkey (MAC) eosin methylene blue agar (EMB) Trên mơi trường thạch EMB, E coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; môi tmờng thạch Mac Conkey, E coli cho khuẩn lạc đỏ hồng Ngồi ra, ta sử dụng môi trường SMAC (Sorbitol Mac Conkey) để phân biệt nhóm STEC khơng lên men đường sorbitol Trên mơi trường SMAC, nhóm STEC cho khuẩn lạc điển hình màu trắng, nhầy, nhóm E coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng (FDA, 2002) - E coli mọc tốt môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24 hình thành khuẩn lạc dạng s (smooth) màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng - 3mm - Trong mơi trường lỏng, sau 4-5 giờ, E coli làm đục nhẹ mơi trường, đế lâu đục, có mùi thối; sau vài ngày có ván mỏng mặt môi trường - Để phân biệt E co li vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng IMVÍC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate) E coli cho kết + + - - (biotype 1) - + - - (biotype 2) (FAO, 1992) 2.1.3 Yếu tố kháng nguyên Phân loại huyết học dựa vào kháng nguyên thân o (somatic), kháng nguyên H (ílagellar) kháng ngun bề mặt K (capsular) Có 700 loại serotype E coli công nhận dựa vào kháng nguyên o, H, K Theo Jay (2000), E co li có 200 type kháng nguyên công nhận tồn khoảng 30 type kháng nguyên H 2.1.4 Ctf chế chung khả gây tiêu chảy E coli Có ba chế chung khả gây tiêu chảy E coỉv - Sản xuất độc tố: Gồm nhóm ETEC, EAEC, STEC - Tấn cơng - xâm lấn: Gồm nhóm EIEC - Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm nhóm EPEC, EHEC Tuy nhiên, tác động qua lại vật chủ màng nhầy ruột đặc hiệu cho loại (Nataro Kaper, 1998) 2.1.5 Phân loại E coli Dựa đặc điếm gây bệnh (đặc tính độc lực, tác động khác lên màng nhày ruột, hội chứng lâm sàng bệnh khác mặt dịch tễ bệnh), E coli chia thành nhóm sau: > STEC (Shiga toxin - producing E coli) VTEC (Vero toxingenic E colĩ) EHEC (Enterohaemorrhagic E coli) > EPEC (Enteropathogenic E coli) > EAEC (Enteroaggregative E coli) > ETEC (Enterotoxigenic E coli) > Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy: - EIEC (Enteroinvasive E co li) - DAEC (Diffusely adherent E coli) 2.1.5.1 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC a Danh pháp Những hướng khác nghiên cứu đưa danh pháp khác đế đặt tên cho nhóm E co li này: - Tên gọi Verotoxigenic E coli Vero cytotoxin producing E coli (VTEC) Konowalchuk cộng đặt cho nhóm phát nhóm sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997 Tên gọi VTEC sử dụng rộng rãi Anh nhiều tố chức khoa học Châu Âu - Tên gọi Enterohaemorrhagic E coli (EHEC) đặt dòng gây viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) hội chứng huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic syndrome) (Nataro Kaper, 1998) - Tên Shiga to xin - producing E coli (STEC) (trước gọi Shiga like toxin producing E coli - SLTEC) rõ khả sinh độc tố gây độc tế bào giống độc tố Shiga (Caldenvood ctv, 1997) Tên gọi STEC sử dụng nhiều tạp chí khoa học Mỹ STEC VTEC hai thuật ngữ tương đương hai nhóm E co li sản sinh hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào Mặc dù vậy, khơng phải có gen sản sinh độc tố gây bệnh khơng có yếu tố độc lực khác Những dòng E coli mang gen sản sinh độc tố diện ruột gia súc khỏe mạnh với số lượng ít, dòng thiếu vài hay tất yếu tố độc lực khác STEC (Beutin ctv, 1995) Do đó, khơng phải tất STEC có khả gây bệnh (Nataro Kaper, 1998) b Shiga toxin yếu tổ khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh STEC * Shiga toxin Những dòng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay gọi Verotoxins (VT) Shiga - like toxins (Slt) Họ độc tố Stx gồm hai nhóm khơng phản ứng chéo với Stxl Stx2, mã hóa gen stxl Stx2 Cả hai độc tố cấu tạo từ tiểu đơn vị B (được mã hóa stxB) tiểu đơn vị A (được mã hóa stxA) Cả hai gen stxA stxB định vị bacteriophage ơn hòa chèn vào nhiễm sắc thể (NST) STEC Một dòng STEC sản xuất độc tố Stxl, Stx2, hai, chí nhiều dạng Stx2 Ba dạng Stx2 xác định: Stx2, Stx2c, Stx2e (Pierard ctv, 1998) Subtype Stx2e gây bệnh phù thủng heo gây bệnh người Nhưng dòng phân lập từ bệnh nhân HUS (Thomas ctv, 1994) Nhiều người ta thay thuật ngữ Stx VT (ví dụ: Stxl = VT1 = Sltl, Stx2e = VT2e = Slt2e v.v ) (Caldervood ctv, 1997) Hầu hết phương pháp chẩn đoán phân tử có mục tiêu phát gen mã hóa Stx nhóm STEC (Cocolin ctv, 2000) * Những yếu tổ độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh STEC Những yếu tố độc lực khác STEC enterohaemolysin (Ehly) heat stable enterotoxin (EAST1) Gen mã hóa Ehly nằm plasmid 60 - MDa mà plasmid tìm thấy nhiều dòng 0157:H7 diện dòng STEC khơng phải 0157 Ở Đức, gần 90% dòng STEC phân lập từ bệnh nhân có gen mã hóa Ehly (Beutin ctv, 1994) Tuy nhiên, việc sản sinh Ehly yếu tố độc lực khó đánh giá, nghiên cứu tác giả này, E coli có Stx âm tính Ehly dương tính nguyên nhân làm hư hại tế bào vero, Hep-2 Hela in vitro (Beutin ctv, 1989) EAST1 mô tả EAEC tìm thấy nhiều dòng STEC EAST1 mầm bệnh STEC khơng biết, liên quan đến số bệnh tiêu chảy khơng có máu thường xuyên tìm thấy người bị nhiễm STEC (Nataro Kaper, 1998) Yeu tố bám dính STEC đóng vai trò quan trọng cho vi khuẩn định vị tế bào ruột Đó intimin - loại protein có trọng lượng phân tử 94 - 97 kDa Protein intimin mã hóa gen eae (E coli attaching etĩacing) Intimin gây tốn thương dạng bám dính phá hủy (attaching - and - effacing, A/E) ruột già vi khuẩn bám chặt vào tế bào biếu mô (Donnerberg ctv, 1993) Gen eae tìm thấy nhóm EPEC Gen eae số gen nằm vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi vùng gây hư hại tế bào ruột - locus of enterocyte effacement, LEE) Vùng LEE STEC chứa gen mã hóa intimin, gen mã hóa thụ đế vận chuyến intimin Tir (translocated intimin receptor) số gen khác Vùng LEE không điều kiện cần mà điều kiện đủ cho việc hình thành tốn thương A/E Tuy nhiên, khơng phải tất STEC có gen eae, tất EHEC có gen eae (Nataro Kaper, 1998) Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác protein màng vi khuẩn (protein intimin) protein Tir Protein Tir tiết khỏi vi khuẩn, chuyến vị vào màng tế bào vật chủ (Kenny ctv, 1997) Hầu hết ổ dịch STEC gây dòng 0157:H7, nên người ta cho serotype độc dễ lây truyền serotype khác Dấu hiệu sinh hóa cho dòng STEC 0157:H7 khơng thể lên men sorbitol khơng tạo ra/? glucuronidase Vì thế, nhiều quốc gia, chẩn đoán STEC dựa vào việc phát E coli không lên men sorbitol 0157:H7 serotype 0157 liên quan đến việc gây bệnh người gồm 026:H11, O103:H2, 0111:HNM 0113:H21 (WHO, 1994) c Nguồn lây nhiễm STEC tìm thấy phân nhiều lồi động vật trâu, bò, cừu, dê, heo, chó, mèo (Beutin ctv, 1993; Chapman ctv, 1997) ngựa (Chalmers ctv, 1997) chim hải âu (Makino ctv, 2000) Loài động vật quan trọng việc lây nhiễm cho người bò Đường lây nhiễm chủ yếu STEC vào chuỗi thực phẩm việc vấy nhiễm thành phần phân trình giết mổ (Butler, 1996) STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước từ người sang người khác Hầu hết trường hợp bệnh ăn thực phẩm bị nhiễm, đặc biệt thực phẩm có nguồn gốc động vật Trong thịt bò ngun nhân chủ yếu (Keskimaki, 2001) 2.1.5.2 Nhóm EPEC Thuật ngữ enteropathogenic E coli gọi tên Neter ctv (1955) để dòng E coli gây tiêu chảy trẻ em a Đặc điểm Cũng STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc gây hư hại (A/E); EPEC không sản xuất độc tố Shiga b Sự bám dính phá hủy (AE) dòng EPEC Dấu hiệu nhiễm bệnh EPEC hình thành bệnh tích kiểu A/E, quan sát mẫu sinh thiết từ bệnh nhân hay thú bị nhiễm nuôi cấy tế bào (Nataro Kaper, 1998) Dạng tốn thương đặc trưng hư hại vi nhung mao kết dính chặt vi khuẩn màng tế bào biếu mô Tốn thương khác với dạng tốn thương ETEC Vibrio cholerae (ETEC V cholerae bám theo kiểu khơng chặt, khơng gây bào mòn vi nhung mao) Gen cần thiết cho việc tạo tốn thương A/E gen eae mã hóa intimin Protein yếu tố độc lực cần thiết EPEC (Donnerberg ctv,1993) Theo Nataro Kaper (1998), gen eae diện tất chủng EPEC, EHEC, Closfridium rodentium Hafnia alvei, khơng diện dòng E coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột thông thường c Dịch tễ nhiễm EPEC Cũng E co li gây bệnh khác, truyền lây EPEC qua đường miệng, với vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm Điểm đáng ý mặt dịch tễ bệnh EPEC phân bố lứa tuổi Bệnh thường biếu cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng trẻ em Người trưởng thành trẻ em lớn có phần đề kháng hom với bệnh mà nguyên nhân thụ đặc hiệu Tuy nhiên, EPEC gây tiêu chảy người lớn số lượng vi khuẩn đủ cao 2.1.5.3 Nhóm ETEC a Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm định độc lực độc tố ruột (enterotoxin) yếu tố định vị (colonization factor - CF) ❖ Độc tổ ruột enterotoxin Nhóm ETEC sản sinh độc tố Có hai loại: độc tố chịu nhiệt (ST) độc tố chịu nhiệt (LT) (1) Độc tổ chịu nhiệt (heat - labile toxin - LT): Độc tố LT E coli oligopeptide có liên hệ gần gũi mặt cấu trúc chức với độc tố gây bệnh tả người (cholera toxin - CT) Vibrio cholerae tiết LT CT giống nhiều đặc tính cấu trúc, trình tự acid amin (giống khoảng 80%), tương đồng thụ thế, hoạt tính enzyme, kiểu tác động động vật hay ni cấy tế bào LT có hai serogroup LT-I LT-II LT-I LT-II khơng có phản ứng chéo mặt miễn dịch - LT-I: Được tiết dòng E coli gây bệnh người thú LT-I oligopeptide khoảng 86 kDa, cấu tạo tiểu đơn vị A 28 kDa tiểu đơn vị B 11,5 kDa Tiếu đơn vị A chịu trách nhiệm enzym, gồm peptide Ai peptide A liên kết cầu nối disultur Những tiếu đơn vị B xếp thành vòng nhẫn, liên kết chắn với ganglioside GM] liên kết lỏng lẻo với GDlb vài glycoprotein (các thụ LT) Hai loại LT-I có liên hệ gần phản ứng chéo phần với LTp (LTp-I) phân lập từ heo LTh (LTh- I) phân lập từ người Gen mã hóa cho LT elt hay lt-I nằm plasmid mà plasmid chứa gen mã hóa ST / gen mã hóa kháng nguyên yếu tố định vị (colonization factor antigen - CFA) Sau bám vào màng tế bào niêm mạc ruột vật chủ, độc tố LT-I thâm nhập qua màng tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăng mức AMP vòng (cAMP) tế bào cAMP hoạt hóa protein kinase (A kinase) từ dạng khơng hoạt động thành dạng hoạt động Điều dẫn đến phosphoryl kênh chloride hoạt động mức bình thuờng màng tế bào biếu mơ Ket kích thích tế bào mào ruột tiết Cl" cách tích cực, đồng thời ức chế hấp thu NaCl tế bào nhung mao (villus) Đây nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy dội (Nataro Kaper, 1998) - LT - II: LT-II có cấu trúc giống với LT - I CT khoảng 55 - 57% tiểu đơn vị A, nhung không giống với LT-I CT tiếu đơn vị B LT-II làm gia tăng cAMP tế bào qua chế tuơng tự nhu LT-I, nhung LT-II không liên quan đến bệnh nguời thú (2) Độc tổ chịu nhiệt (heat - stable toxin - ST) Nguợc với LT, ST có trọng luợng phân tử nhỏ cầu nối disulíur giải thích cho khả chịu nhiệt độc tố ST đuợc chia thành hai nhóm STa STb Hai nhóm khác cấu trúc chế hoạt động Gen mã hóa cho hai nhóm đuợc tìm thấy chủ yếu plasmid vài gen mã hóa ST đuợc tìm thấy transposon Độc tố STa (hay gọi ST-I) ETEC sản sinh vài vi khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica V cholerae 01 ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 EAEC Một số báo cáo gần cho vài dòng thuộc nhóm ETEC ngồi việc sản sinh STa, sản sinh độc tố EAST1 Trong đó, STb đuợc tìm thấy ETEC - STa: STa peptide gồm - acid amin với trọng luợng phân tử khoảng kDa STa đuợc chia thành hai loại STp (ST porcine STIa) từ E coli phân lập đuợc heo STh (ST human STIb) E coli phân lập nguời Cả hai độc tố đuợc tìm thấy dòng ETEC nguời Thụ STa enzyme xuyên màng guanylate cyclase c (GC-C) STa kết hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng luợng cGMP nội bào Hoạt động cuối dẫn đến gia tăng tiết Cl" / ngăn cản hấp thu NaCl, dẫn đến tăng luợng tiết chất lỏng ruột, gây tiêu chảy - STb: STb chủ yếu tạo dòng ETEC phân lập từ heo, vài chủng ETEC phân lập từ người sản sinh STb Không STa, STb gây tổn thương mặt mô học lớp biểu mô ruột tế bào nhung mao lớp biểu mô ruột teo nhung mao phần Thụ thể STb chưa biết rõ gần người ta cho độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước vào bên tế bào Khơng gây tiết cr STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3) STb khơng làm tăng cAMP hay cGMP nội bào kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào STb kích thích phóng thích PGE2 serotonin, từ người ta cho hệ thần kinh ruột liên quan đến đáp ứng tiết dịch gây độc tố (Hitotsubashi ctv, 1992) ❖ Yếu tố định vị (colonization factor - CF) Cơ chế mà ETEC kết dính cư trú lớp màng nhầy nghiên cứu kỹ Đe gây tiêu chảy, ETEC phải kết dính vào tế bào non nhờ vào lông bề mặt vi khuẩn, gọi yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor antigens) CFA phân loại dựa đặc tính hình thái Có loại gồm loại lơng hình que cứng, lơng hình que mềm dạng bó, lơng có cấu trúc mảnh mềm Có 20 loại CF ETEC người Hầu hết, chúng mã hóa gen nằm plasmid, nơi mã hóa độc tố ST và/hoặc LT (Gaastra Svennerholm, 1996) Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường tạo miễn dịch vượt trội tiểu đơn vị có tính kháng ngun mạnh, b Dịch tễ Dòng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trẻ em bú nước phát triển tiêu chảy khách du lịch Dịch tễ bệnh ETEC định nhiều yếu tố: (1) miễn dịch màng nhầy khác cá nhiễm ETEC, (2) người nhiễm khơng có biếu triệu chứng thải lượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm đạt liều gây nhiễm cao Ba đặc tính tạo nên tình trạng ô nhiễm ETEC môi tmờng vùng có dịch hầu hết trẻ em vùng đương đầu với ETEC thời kì thơi bú Trẻ em tuối đến trường người lớn có nguy tiêu chảy ETEC thấp Dòng ETEC sản sinh ST nguyên nhân hầu hết trường hợp bệnh Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn nước bị ô nhiễm phưong tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black ctv, 1981) Sự nhiễm ETEC, vùng dịch thường tập trung chủ yếu vào tháng nóng ẩm; đó, nhân lên mạnh mẽ ETEC thực phẩm nước Mặc dù nhiễm ETEC xảy chủ yếu trẻ em, người trưởng thành chưa có miễn dịch dễ bị nhiễm Thật vậy, ETEC nguyên nhân gây tiêu chảy du khách trưởng thành từ nước phát triển đến thăm vùng có dịch ETEC Nhiều nghiên cứu cho 20 - 60% số du khách có triệu chứng tiêu chảy 20 - 40% trường hợp ETEC Tiêu chảy du khách thường xảy du khách lần đến thăm nước phát triển Tiêu chảy du khách thường thức ăn nước uống bị ô nhiễm c Khía cạnh lâm sàng Triệu chứng bệnh thường xảy đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14-50 giờ) Bệnh nhân tiêu chảy toàn nước, thường khơng có máu; vài bệnh nhân có tượng sốt ói mửa Tiêu chảy ETEC nhẹ, ngắn tự bớt dần gây tiêu chảy nghiêm trọng giống nhiễm Vibrio cholerae Hầu hết trường họp nhiễm ETEC nguy đến tính mạng xảy trẻ em thơi bú nước phát triển Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảm làm giảm mức độ tiêu chảy, thuốc trị có hiệu khơng sẵn có vùng nguy cao; ngồi đề kháng kháng sinh dòng ETEC vấn đề đáng quan tâm Do cần phải lưu ý sở việc chăm sóc bệnh nhân nhiễm ETEC trì đủ lượng nước có triệu chứng tiêu chảy d Phát chẩn đốn Việc phát nhóm ETEC dựa vào phát độc tố LT và/hoặc ST Có nhiều phương pháp phát ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), DNA-probe, PCR 2.2 Kỹ thuật PCR 2.2.1 Nguyên tắc PCR (polymerase Chain reaction - phản ứng tống họp dây chuyền nhờ polymerase) Kary Mullis cộng phát minh năm 1985 PCR kỹ thuật in vitro cho phép nhân nhanh gen mong muốn lên hàng triệu lần thời gian ngắn (tạo dòng in vitro, khơng cần diện tế bào) Sự khuếch đại primer oligonucleotide Primer phân tử DNA đơn, ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khn (trình tự DNA mẫu xét nghiệm) nhờ DNA polymerase, dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) điều kiện phản ứng thích hợp Các primer gồm có primer “xi” (forward primer) primer “nguợc” (reverse primer) Ket có chuỗi DNA bổ sung với sợi DNA mẫu Những chuỗi tồn duới dạng DNA chuỗi đôi Sự tống hợp đuợc lặp lại theo số chu kỳ định đuợc thiết lập Multiplex - PCR cải tiến kỹ thuật PCR mà nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn cách sử dụng nhiều cặp primer phản ứng Multiplex - PCR đuợc mô tả Chamberlain năm 1988 kế từ multiplex - PCR đuợc ứng dụng nhiều lĩnh vực kiếm tra DNA (Protocol Online) 2.2.2 Các giai đoạn phản ứng PCR Phản ứng PCR chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: > Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation) Hai mạch phân tử DNA tách rời thành hai mạch đơn Phân tử DNA đuợc biến tính nhiệt độ cao nhiệt độ nóng chảy (Tm) phân tử, thuờng 94 -95°c vòng 30 giây đến phút > Giai đoạn 2\ Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing) Nhiệt độ đuợc hạ thấp (thấp Tm primer) cho phép primer bắt cặp với khuôn, thực nghiệm nhiệt độ dao động khoảng 40 - 60°c tuỳ thuộc Tm primer sử dụng kéo dài từ 30 giây dến phút > Giai đoạn 3\ Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension) Nhiệt độ giai đoạn đuợc tăng lên 72°c giúp DNA polymerase hoạt động tổng họp DNA tốt với diện deoxyribonucleotide triphosphate Đoạn DNA nằm hai primer đuợc tổng họp tạo thành chuỗi DNA * Mỗi chu kỳ gồm giai đoạn đuợc lặp lại nhiều lần lần làm tăng đôi luợng DNA mẫu lần truớc Tống DNA khuếch đại đuợc tính theo công thức: Tổng DNA khuếch đại = m*2n Với n: Số chu kỳ; m: số chuỗi mã hóa * Sản phẩm kéo dài chu kỳ có chiều dài khơng xác định DNA polymerase tiếp tục tổng hợp DNA đến khỉ dừng lại bị phá hủy chu kỳ Sản phẩm kéo dài chu kỳ thứ hai không xác định Tuy nhiên, chu kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) tổng hợp có chiều dài xác định Từ chu kỳ thứ trở đi, trình tự đoạn DNA đích khuếch đại Vì số copy cuối trình tự đích tính theo cơng thức: Số copy cuối trình tự đích = (2n - 2n) * X n : Số chu kỳ 2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ X : Số chuỗi mã hóa * Số chu kỳ phản ứng PCR - Trong thực tế, không vượt 40 chu kỳ phản ứng, phản ứng PCR diễn qua hai giai đoạn: + Giai đoạn đầu, số lượng tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu + Giai đoạn sau đó, hiệu khuếch đại giảm hẳn do: ■ Phân hủy cạn kiệt cảc thành phần phản ứng ■ Xuất sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng ■ Các vừa tổng hợp không kết hợp với prỉmer mà lại bắt cặp với Số chu kỳ phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu DNA mẫu ban đầu 10 cần khoảng 25 - 30 chu kỳ, DNA mẫu 102 - 103 số chu kỳ phải 35 -40 T TTTmTTi "li HĨ ĩ ■' Tprmrnnri11 iiTHiT-rni II miĩrm -LL •UXUlujrJ-L* s •• u.111LIu ^ Giai đoạn biến tính (denaturation) nm-nTtm I I I .11 u n I I I I I I T T I I I inrmrmTTi"[ I I r m n I I I I I I I I I I I I I r r r r r r i y i LUiJ ‘ -LLiiJaiuUj y ■ Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing) ^mrnmi Giai đoạn kéo dài '1 - V' - I I _ mi ^ìrTnTiĩrTTV,T'i‘iTriTrrr^- extension) ■ ■■■■■■■ I— f I * (elongation hay T^ Hình 2.1 Nguyên Ịỷ phản ứng PCR 3/ o ©