Các vụ ngộ độc có thể có nhiều nguyên nhân như do: hóa chất, bản thân thực phẩm chứa sẵn một số chất độc, thực phẩm chứa vi sinh vật gây bệnh,…Trong đó, các vụ ngộ độc thực phẩm do nhiễm
Trang 1ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN THỊ THU HUYỀN
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA
VI KHUẨN Staphylococcus aureus GÂY ĐỘC ĐƯỜNG
RUỘT NHÓM B TRONG THỊT LỢN BÁN TẠI THÁI NGUYÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thái Nguyên, năm 2012
Trang 2
MỞ ĐẦU
1 Đặt vấn đề
Vấn đề an toàn thực phẩm đang trở thành một vấn đề quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng ở hầu hết các nước phát triển và ở cả các nước đang phát triển Trong các loại thực phẩm sử dụng hàng ngày thì thịt lợn là loại thực phẩm thông dụng thường xuyên được sử dụng để chế biến các món ăn trong thực đơn hàng ngày của mỗi gia đình Tuy nhiên trong thời gian gần đây
có rất nhiều bệnh dịch liên quan đến thịt lợn mà vì lợi ích trước mắt con người vẫn sử dụng và bỏ qua các tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm đã - đang - và sẽ đe dọa sức khỏe của con người Các vụ ngộ độc có thể có nhiều nguyên nhân như do: hóa chất, bản thân thực phẩm chứa sẵn một số chất độc, thực phẩm chứa vi sinh vật gây bệnh,…Trong đó, các vụ ngộ độc thực phẩm
do nhiễm vi sinh vật gây ra phát triển nhanh chóng với các hậu quả nghiêm trọng
Ngộ độc thực phẩm là một bệnh cấp tính xảy ra khi ăn phải thức ăn bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc có chứa các chất có tính chất độc
hại đối với con người Trong số các vi sinh vật sinh độc tố gây bệnh đó có tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) là một trong những nguyên nhân chính gây
ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng Điều đáng chú ý ở đây là một số độc tố của chúng bền với nhiệt và khó bị phân hủy ở nhiệt độ cao, một trong số đó là độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B (SEB) SEB cũng là tác nhân gây ra ngộ độc thực phẩm thường
gặp nhất ở S aureus Hơn nữa chúng lại có khả năng kháng methiciline,
penicillin, khi gặp điều kiện thuận lợi còn có thể lây lan và gây những căn bệnh nguy hiểm Hiện nay, chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu cho nhiễm độc các độc tố nhóm này, phương pháp phòng ngừa đặc hiệu cũng không có, việc phòng bệnh và điều trị bệnh ngộ độc do tụ cầu gặp rất nhiều khó khăn vì không phát hiện kịp thời tác nhân gây bệnh Vì vậy, việc xác định sự có mặt SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm đóng vai trò hết sức quan trọng
Trang 3Mặt khác, việc giết mổ và bán thịt lợn chủ yếu do tư nhân thực hiện, phương tiện vận chuyển, dụng cụ bán thịt chưa đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y Việc kiểm tra vệ sinh thú y của cán bộ kiểm dịch còn gặp nhiều khó khăn hiện chỉ dừng lại ở mức độ kiểm tra cảm quan thịt được bán tại chợ
Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên
cứu tỷ lệ nhiễm và một số đặc tính của vi khuẩn Staphylococcus aureus gây độc tố đường ruột nhóm B trong thịt lợn ở Thái Nguyên.”
2.Mục tiêu nghiên cứu:
Xác định tỉ lệ nhiễm và đặc tính của độc tố nhóm B ở vi khuẩn
Staphylococcus aureus trên thịt lợn, từ đó làm cơ sở để các nhà dịch tễ học có
những biện pháp nhằm khắc phục tình trạng ngộ độc thực phẩm
3 Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát tình hình giết mổ và xác định tỉ lệ nhiễm Staphylococcus aureus
- Xác định các đặc tính sinh hoá của các chủng Staphylococcus aureus
đã phân lập được
- Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus
phân lập được trên chuột bạch khoẻ
- Phân lập và xác định trình tự gen độc tố đường ruột Enterotoxin nhóm
B của chủng Staphylococcus aureus
- Xác định tính mẫn cảm của các chủng Staphylococcus aureus đã phân
lập được đối với một số loại kháng sinh
Trang 4Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
ngộ độc [34]
Thực phẩm ô nhiễm các vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở cả các nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu kém phát triển [31] Hiện nay, loài người đang phải đối mặt với nguy cơ nhiễm hơn 200 bệnh truyền nhiễm thông qua thực phẩm Các triệu chứng lâm sàng khá đa dạng, từ mức viêm dạ dày, ruột nhẹ cho tới nhiễm trùng, nhiễm độc nặng với nguy cơ tử vong cao, hoặc dẫn tới các biến chứng phức tạp, ảnh hưởng tới đời sống của bệnh nhân Hậu quả và thiệt hại kinh tế do các bệnh lây truyền qua thực phẩm rất lớn và có xu hướng ngày càng tăng Ví dụ, mỗi năm ở Hoa Kỳ
có khoảng 76 triệu ca mắc bệnh các loại do thực phẩm ô nhiễm, 325 nghìn ca nhập viện và 5 nghìn ca tử vong [23] Các chi phí điều trị cho các bệnh nhân khoảng 6,5 tỷ đô la, thiệt hại do nghỉ điều trị khoảng 34,9 tỷ đô la/năm
Các loại mầm bệnh gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm:
Người tiêu dùng có thể mắc bệnh khi sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm các mầm bệnh vi sinh vật, độc tố của vi sinh vật hoặc một số kim loại độc Trong số hơn 200 bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm có khoảng 40 mầm bệnh
vi sinh vật đã được xác định vai trò gây bệnh [15] Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virus, trong đó các loại vi khuẩn gây
ra tới 90% số ca bệnh tử vong ở người
Trang 5Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hóa, việc sản xuất và phân phối một sản phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian địa lý dẫn đến khả năng lan tràn khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm Đồng thời, trong quá trình công nghiệp hóa, thực phẩm được sản xuất hàng loạt đã làm khả năng nhiều người tiêu dùng mắc bệnh tăng cao Số ca mắc các bệnh
do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây [23]
Mặc dù y học hiện nay đã khá phát triển, song các tác nhân gây bệnh trực tiếp từ thực phẩm vẫn còn chưa được phát hiện đầy đủ Tại Hoa Kỳ, chỉ
có 14/76 triệu ca mắc, 60/325 nghìn ca nhập viện và 1,8/5 nghìn ca tử vong
do nhiễm trùng độc thực phẩm là chẩn đoán được chính xác nguyên nhân [23] Trong số các nguyên nhân đã được xác định, có một số mầm bệnh có khả năng gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm cấp tính nguy hiểm với tỉ lệ
tử vong cao như: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholera, Salmonella, Campylobacterer, Yersinia enterocolitica.v.v [15]
Listeria monocytogenes thường gặp ở sữa và các sản phẩm từ sữa, thịt,
cá và rau Vi khuẩn này có thể gây viêm màng não, nhiễm khuẩn đường tiết niệu và tử vong, đặc biệt nguy hiểm với người suy giảm miễn dịch có khả năng lây nhiễm cao như: ung thư, AIDS, nghiện rượu, đái tháo đường
Escherichia coli có mặt trong tất cả các loại thực phẩm chết biến không vệ
sinh, có nhiều chủng với các khả năng gây bệnh khác nhau như chủng gây ỉa chảy (EPEC); chủng sinh độc tố ruột (ETEC) gây ỉa chảy ở trẻ em và khách
du lịch.v.v…[28]
Ở các nước châu Á, tụ cầu vàng (S aureus) là nguyên nhân hàng đầu
gây ra ngộ độc [3]
1.1.2 Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B
Tụ cầu S aureus là một trong những loài vi khuẩn gây bệnh được ghi
nhận sớm nhất vào đầu những năm 1880 Sự liên quan của tụ cầu tới nhiễm trùng, nhiễm độc thức ăn được biết đến từ năm 1914, nhưng mãi tới năm
Trang 61930, Dack và cs mới xác định được nhiễm trùng, nhiễm độc tụ cầu có thể gây ra bởi các độc tố ruột có trong dịch nuôi cấy tụ cầu vàng [5]
Từ giữa những năm 1969 và 1990, tại Anh, 53% trường hợp ngộ độc thực
phẩm do S aureus được ghi nhận là do tiêu thụ các sản phẩm từ thịt (đặc biệt
là ruốc); 22% các trường hợp từ thịt gia cầm, 8% từ các sản phẩm liên quan sữa, 7% từ cá, sò, ốc v.v… và 3,5% từ trứng [30] Tại Pháp, trong số các thực
phẩm nhiễm S aureus được ghi nhận trong hai năm (1999-2000) có các sản
phẩm từ sữa (đặc biệt là pho-mát) (32%), thịt (22%), xúc xích (15%), cá và hải sản (11%), trứng và các sản phẩm từ trứng (11%) hoặc các sản phẩm khác
từ gia cầm (9,5%) [19] Tại Hoa Kỳ, trong số các trường hợp ngộ độc thực
phẩm do S aureus được báo cáo giữa các năm 1975 và 1982 thì 36% là do
tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ sa lát, 11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt: 5,1% đến 1,4%, còn lại là từ các sản phẩm liên quan tới sữa và hải sản [33] Ở
châu Á các vụ nhiễm S aureus chủ yếu ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc và
trong khu vực Đông Nam Á
Ở Trung Quốc trong năm 2008 đã xảy ra 1 vụ ngộ độc S aureus ở trẻ
em vì uống sữa bị nhiễm S aureus Còn ở Nhật cũng đã có 2 vụ ngộ độc
S aureus lớn vào tháng 8 năm 1955 làm ngộ độc hơn 1936 em học sinh tại 5
trường tiểu học ở Tokyo và tháng 6 năm 2006 làm 14780 người bị ngộ độc ở vùng Kansai Nguyên nhân của 2 vụ ngộ độc này đều do họ đã uống sữa có
nhiễm S aureus của tập đoàn Snow
Trong khu vực Đông Nam Á, hai quốc gia có tỷ lệ ngộ độc S aureus
cao là Indonesia và Philippines Việt Nam cũng là một trong những nước có
tỷ lệ nhiễm S aureus cao ở trong khu vực châu Á Như vậy, giữa các nước
khác nhau loại thực phẩm dễ nhiễm tụ cầu nhất cũng khác nhau
Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa dạng, thường gặp nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), xúc xích
Trang 7(96,6%), bánh gato (85%), Patê (83,3%) v.v Đáng chú ý là vi khuẩn S aureus thường được tìm thấy trong các thực phẩm bị nhiễm khuẩn [7]
Tình trạng ngộ độc thực phẩm không chỉ diễn ra ở các thành phố lớn
mà tình trạng nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm còn diễn ra phổ biến ở nhiều địa phương khác trên cả nước [30] Tuy nhiên, cho tới nay tại Việt Nam thực tế chưa có những thống kê cụ thể về số ca mắc hay tử vong do ngộ độc thực phẩm liên quan đến SEB Có nhiều nguyên nhân gây khó khăn cho quá trình thống kê tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do SEB:
- Bệnh nhẹ nên người bệnh không chủ động tìm kiếm sự điều trị tại các
cơ sở chuyên khoa
- Chẩn đoán tại khoa cấp cứu các bệnh viện thường có nhiều bệnh có biểu hiện gần giống bệnh do SEB gây ra, nên chưa kết luận đúng bệnh
- Việc tiến hành các nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột SEB của tụ cầu vàng ở Việt Nam hiện nay còn khá mới mẻ, chủ yếu vẫn dựa vào các phương pháp truyền thống nên tốn nhiều công sức và thời gian kéo dài Do đó, khi bệnh nhân nhiễm độc tụ cầu và các nội độc tố như SEB sẽ gặp nguy hiểm gấp bội vì SEB là một siêu kháng nguyên có độc tính mạnh, tác động nhanh , có thể dẫn tới tử vong ở người
Dựa theo bảng 1.1 dưới đây, chúng ta nhận thấy tình trạng xuất hiện vi
sinh vật S aureus ở các loại thực phẩm diễn ra khá phổ biến trong cả nước Vi
khuẩn có thể gây ngộ độc cấp tính cho nhiều người trong cùng một thời điểm
khi họ cùng tiêu thụ một loại thực phẩm Ngộ độc thực phẩm do S aureus có
thể xảy ra với bất kì đối tượng nào Tuy nhiên, người già, trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém sẽ dễ mắc và biểu hiện triệu chứng nhiễm độc nặng nề hơn [4]
Trang 8Bảng 1.1 Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng
trên toàn quốc từ 2007 – 2012
gian
Số người mắc bệnh
Đặc điểm bệnh nhân
Học sinh và phụ huynh
Việc tìm ra phương pháp phát hiện sớm S aureus và độc tố SEB của nó
gây nhiễm trùng, nhiễm độc trực tiếp trên thực phẩm mang ý nghĩa quan trọng
và cấp thiết, nhằm loại bỏ và có biện pháp xử lý sớm đối với các thực phẩm
Trang 9đang nhiễm độc nhiễm trùng Nhưng trước hết chúng ta cần phải tìm hiểu về đặc tính sinh hoá và nghiên cứu ở mức độ phân tử làm nền tảng Chính vì vậy, việc tiến hành đề tài này sẽ là một nhu cầu thực tiễn và cấp bách
1.2 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
1.2.1 Lịch sử phát hiện
Staphylococcus aureus do Robert Koch phát hiện năm 1878 sau khi
thực hiện phân lập từ mủ ung nhọt
Năm 1880 Louis Paster cũng đã tiến hành phân lập và nghiên cứu về
Staphylococcus aureus
Ngày 09/04/1880 bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học, trong đó ông
sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và trình bày tương đối đầy
đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ lâm sàng
Đến năm 1881 Ogston đã thành công trong việc gây bệnh thực nghiệm,
đây là tiền đề cho những nghiên cứu về S aureus sau này
Đến năm 1884 Rosenbach đã thực hiện một loạt các nghiên cứu tỉ mỉ
hơn về vi khuẩn này Và ông đã đặt tên cho vi khuẩn này là Staphylococcus aureus
Năm 1926 Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa sự hiện diện hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó Tuy nhiên mãi đến năm 1948 phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi
1.2.2 Đặc điểm phân loại
Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài Staphylococcus aureus
Tên khoa học: Staphylococcus aureus [12]
Trang 10Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm
chính: tụ cầu có coagulase và tụ cầu không có coagulase S aureus gây bệnh
ngộ độc thực phẩm là tụ cầu có coagulase Nhờ enzyme này mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng nên còn được gọi là tụ cầu vàng
Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của vách tế bào vi khuẩn Nhưng dựa vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn
Phân loại tụ cầu dựa trên phage (phage type): tụ cầu được phân vào các
nhóm I, II, III, IV Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại S aureus [5]
Trang 11Ngoài ra, cầu khuẩn S aureus không có khả năng tạo bào tử như các vi khuẩn Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum, và Bacillus cereus cũng thường được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn [33]
1.2.3.2 Tính chất nuôi cấy
Tụ cầu S aureus sống hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, dễ mọc trên các
môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp 30-37o
C, pH 7,2-7,6 [2]
- Môi trường nước thịt: Sau 5-6h nuôi cấy ở điều kiện 37oC vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, sau 24h độ đục tăng, lắng cặn nhiều, không tạo
màng trên mặt môi trường
- Môi trường thạch thường: Sau 24h nuôi cấy ở điều kiện 37oC, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc dạng S, màu trắng, vàng thẫm hoặc vàng
chanh
- Môi trường thạch máu: Vi khuẩn mọc tốt, sau 24h/37oC hình thành
những khuẩn lạc dạng S, màu trắng, có thể gây dung huyết
- Môi trường thạch Chapman Stone: Chapman Stone agar là môi
trường chọn lọc để phân lập vi khuẩn tụ cầu Sau 24h/30oC, tụ cầu khuẩn
S aureus lên men đường mannit (mannitol) làm giảm pH môi trường (tỷ lệ pH= 7,2 giảm xuống pH =6,8), tạo thành những khuẩn lạc dạng S, màu vàng
- Chuyển hoá đường: Tụ cầu khuẩn có khả năng lên men đường
glucoza, lactoza, levuloza, mannoza, mannit, saccaroza, không lên men đường galactoza
Trang 12mủ (pyrogenic); dung huyết tố (hemolysin hay staphylolysin); fribrinolysin
(staphylokinase); coagulase; hyaluronidase; β – lactamase và độc tố ruột
(enterotoxin) – trong đó có SEB [5] Ngoài ra, tụ cầu có hệ enzyme phong phú góp phần làm tăng độc lực của chúng đối với các tế bào vật chủ
Hình 1.2 Các độc tố quyết định của S aureus
Độc tố ruột được sản xuất bởi phần lớn các chủng tụ cầu vàng, nhưng không phải là tất cả mọi chủng Các độc tố này là những protein tương đối bền với nhiệt, nên không bị phá hủy bởi sự đun nấu, có trọng lượng phân tử từ 28000-30000 Dalton và bao gồm 6 loại (type) được ký hiệu từ A tới E [5] Ono và cs (2008), đã phát hiện ra 2 loại độc tố mới là SES và SET cũng nằm
trong nhóm những độc tố ruột do S aureus tạo ra [25] Về miễn dịch, các loại
này được phân biệt khá rõ ràng, mặc dù giữa chúng có những kháng nguyên chéo Về cơ chế gây bệnh, độc tố ruột kích thích miễn dịch ở cơ thể vật chủ tạo ra một lượng lớn interleukin I và II Các enterotoxin có thể được xác định
bằng các kỹ thuật miễn dịch [3] Trong các dạng độc tố ruột do S aureus sinh
ra thì các độc tố SEA, B, C và D là những độc tố thường gặp nhất trong các
vụ ngộ độc thực phẩm do độc tố của tụ cầu Ngoài ra SEB còn là một trong
Trang 13những nhóm độc tố do vi sinh vật sản sinh ra được liệt kê trong danh mục vũ khí sinh học dùng để tấn công khủng bố sinh học và chiến tranh sinh học [18]
- Cơ chế gây bệnh
Việc tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong quá trình phòng chống bệnh Bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là
sự bám dính (adherence) của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ
Các bề mặt này bao gồm da, niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu) và các tổ chức sâu hơn (tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô) Giống như các vi khuẩn Gram dương khác là
Streptococcus và Mycobacteria, S aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ
các adhensin có bản chất polypeptide Một khi đã bám dính vào bề mặt tế bào
vật chủ, tác nhân gây bệnh như S aureus mới có khả năng khởi động các quá
trình hóa sinh đặc hiệu gây bệnh như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm nhập và
hoạt hóa các chuỗi tín hiệu của tế bào vật chủ S aureus sẽ tiếp tục tiến sâu vào trong cơ thể vật chủ để tiếp tục chu trình xâm nhập (invasion) S aureus
xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzyme như: hyaluronidase; hemolysine, leukocidin; exfoliatine v.v, phá hủy các thành phần cấu tạo tế bào vật chủ [35, 36]
Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn đường ruột nhạy cảm kháng sinh bị tiêu diệt, tạo điều kiện thuận lợi cho tụ cầu vàng tăng trưởng về số lượng Ngoài nguyên nhan là do tụ cầu, một số trường hợp có thêm vai trò của vi khuẩn
Clostridium difficile [5] Ước tính khoảng 0,1 mg S aureus đã đủ gây ngộ độc
thực phẩm ở người Tuy nhiên, lượng này cũng có thể thay đổi tùy thuộc độ nhạy cảm với tác nhân ở mỗi bệnh nhân [33]
- Triệu chứng ngộ độc thức ăn do nhiễm tụ cầu vàng S aureus
Trang 14Ngộ độc thức ăn do tụ cầu S aureus và độc tố của nó thường có các
triệu chứng cấp tính Thời gian ủ bệnh của tụ cầu vàng ngắn hơn (chỉ 1-6 giờ) thời gian ủ bệnh của nhóm vi khuẩn đường ruột gây ngộ độc thức ăn khác (trung bình 2-3 giờ) Bệnh nhân ngộ độc thức ăn do tụ cầu xuất hiện các triệu chứng nôn ói, đau quặn bụng và tiêu chảy dữ dội, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước Triệu chứng tiêu chảy do tụ cầu cũng không kèm theo
máu và ít mất nước hơn so với tả và E coli Bệnh nhân không sốt hay phát
ban, đây là đặc điểm để phân biệt giữa ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng với các nhóm vi khuẩn khác; thần kinh người bệnh bình thường Phần lớn trường hợp bệnh tự khỏi và hồi phục trong vòng 8-24 giờ sau khởi phát nhưng trường hợp nặng có thể bị tụt huyết áp và gây tử vong Bệnh nhân ngoài ra có thể bị sốc do mất nhiều nước và chất điện giải Khác với ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn thông thường không gây sốt hoặc sốt nhẹ, bệnh nhân mắc ngộ độc do
độc tố SEB của S aureus sẽ bị sốt cao [4]
1.2.4 Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
Hiện nay người ta đã thành công trong giải trình tự gen của các chủng
tụ cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476, N315, Mu50, RF122 v.v [11],[17], [20],[ 12], [22] Ví dụ: Steven và cs đã
thành công trong việc giải trình tự bộ gen dài 2809422 bp của chủng S aureus
COL Kết quả giải trình tự đã được đăng ký trên Genbank với mã số: CP000046.1 cho hệ gen nhân và CP000045 cho hệ gen plasmid Theo đó, trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít các cặp G - C, điều này gây ra mối quan ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng tới các tác nhân gây bệnh Gram dương khác [29]
Trong số các chủng S aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ
giống enterotoxigenic được ước tính khoảng 25% [13] Tại Pháp, trong số 61 chủng phân lập từ pho-mát và sữa tươi có 15,9% chủng là giống
enterotoxigenic Ở Pháp, trong 332 chủng S aureus được phân lập từ nhiều
loại thức ăn có 57% chủng chứa các gen SEG,SEB, SEI và SEJ xuất hiện với
tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen SEA và SEE, trước đây vốn được xem là
chiếm ưu thế [4, 27]
Trang 151.3 Nội độc tố đường ruột staphylococcal enterotoxin B
1.3.1 Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B
SEB là 1 trong các nội độc tố được sinh ra bởi vi khuẩn S aureus
Thông thường khi bị lây nhiễm vào cơ thể, SEB sẽ tác động chủ yếu lên các
hệ thống vận chuyển ion và nước của ruột, do đó được gọi là enterotoxin (độc
tố ruột) [14]
Độc tố ruột SEB bền với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong
các vụ ngộ độc thực phẩm do S aureus [14] Độc tố ruột SEB được hình thành khi tụ cầu S aureus sống trong điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ môi
trường gia tăng đột ngột, thiếu oxy, sự mất cân bằng trong áp suất thẩm thấu v.v [4]
Đóng vai trò là một trong những nội độc tố quyết định của vi khuẩn S aureus nên SEB được nghiên cứu khá chi tiết Trình tự amino acid của SEB
đã được xác định từ năm 1970 [21] Giống như các cấu trúc protein ngoại bào
khác của S.aureus thường được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy hay trong
thực phẩm bị ô nhiễm, protein SEB bao gồm một trình tự tín hiệu (signal peptide) gồm 27 amino acid ở đầu N’ Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEB tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vị trí nhất định SEB dạng hoạt động trong môi trường ngoài tế bào gồm 239 amino acid trong 1 chuỗi polypeptit đơn, có khối lượng phân tử khoảng 28,336 KDa Ở dạng hoạt động protein SEB có cấu trúc gồm:
7 cấu trúc xoắn α, 14 phiến gấp nếp β và một cầu nối disulphit nối cystein ở vị trí 120 và 140 [41] Theo Bruce A G và cs (2009), protein SEB có 2 vùng cấu trúc đặc biệt phức tạp được đóng gói nhỏ gọn chặt chẽ nên cho phép SEB chống lại sự tác động của các proteases, gồm trypsin, chymotrypsin và papain
có trong ruột [14]
Staphylococcal enterotoxin B có cấu trúc và đặc tính sinh học gần giống với các độc tố ruột khác là A, C, D, E, F, G ,S, T cùng do vi khuẩn
S aureus tạo ra Đặc biệt, trình tự amino acid của SEB có mối tương
đồng cao với trình tự amino acid độc tố ruột C1 cũng có 239 amino acid [16]
Trang 16SEB chỉ thiếu các vị trí bám của kẽm so với các siêu kháng nguyên staphylococcal enterotoxin A, C2 và D chỉ có một vị trí bám trên phân tử MHC nhóm II Phân tích chi tiết vị trí bám trên TCR của các kháng nguyên
SEA, SEB và SEC sẽ chỉ ra sự khác biệt dẫn tới hiệu quả bám lên vùng Vβ
[14]
Năm 1986, Christopher và cs đã xác định thành công trình tự gen SEB
của chủng vi khuẩn S aureus S6 Theo đó, trình tự của 1 gen SEB hoàn thiện
được tính từ codon mở đầu ATG ở vị trí nucleotide 244, sau đó là vùng khung đọc mở gồm 798 nucleotide, và kết thúc tại codon TGA tại vị trí nucleotide
thứ 1042 [16] Đoạn gen SEB phân lập ở các chủng từ những vùng địa lý khác nhau đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu chi tiết Trình tự gen SEB
của các chủng khác nhau như PM36 (AB479118, ATCC14458, AY518386), COL (CP000046, AF410775) v.v đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen (NCBI) [24], [17], [32]
1.3.2 Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B
Staphylococcal enterotoxin B (SEB) là trung gian kích thích các lympho T ở hệ miễn dịch của các vật chủ Các độc tố liên kết trực tiếp đến phức hợp protein (MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích, sau đó kích thích gia tăng số lượng lớn các lympho T SEB được coi là một "siêu kháng nguyên” của vi khuẩn vì có thể tạo thành một “cầu nối” giữa MHC lớp II của các tế bào trình diện kháng nguyên và vùng Vβ của các thụ thể tế bào T như CD 4,
CD 8; từ đó, kích thích hoạt hóa các tế bào T biểu hiện các đoạn gen Vβ mà
không cần thiết phải có một quá trình chế biến và trình diện thông thường Điều này gây ra sự sản sinh một số lượng lớn của cytokine, interleukin 2 (IL-2), các yếu tố hoại tử khối u β (TNF-β), và các interferon Nếu ăn thực phẩm
có SEB bệnh nhân có các triệu chứng như chán ăn, buồn nôn, nôn, và tiêu chảy Các triệu chứng này xuất hiện là do các cytokine trong các tế bào T của lông ruột được sinh ra ồ ạt [14]
Siêu kháng nguyên bám trực tiếp vào phức hợp MHC lớp II của tế bào trình diện kháng nguyên bên ngoài vị trí bám thông thường của kháng nguyên
Trang 171/5 các tế bào T trong cơ thể bị kích thích sản xuất cytokin một cách ồ ạt gây lên hiện tượng sốc độc tính trong cơ thể
SEB dễ dàng hòa tan trong nước, tính chất hóa học tương đối ổn định SEB có khả năng chịu tác động cơ học ở mức vừa phải và có thể chịu được nhiệt độ sôi trong vài phút Nếu được bảo quản trong môi trường đông lạnh khô, SEB có thể được lưu trữ trong hơn một năm [14]
Trang 18Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
Các chủng Staphylococcus aureus gây ngộ độc thực phẩm có trong thịt lợn
tươi
2.2 Vật liệu nghiên cứu
- Các mẫu thịt lợn tươi lấy tại các chợ trung tâm thành phố Thái Nguyên
- Môi trường được sử dụng là những môi trường chế biến sẵn ở dạng tổng hợp, khi dùng pha theo công thức hướng dẫn
+ Môi trường thạch Chapman: Dùng để phân lập vi khuẩn S aureus
+ Môi trường thạch máu: dùng để thử khả năng dung huyết của vi
khuẩn S aureus
+ Huyết tương thỏ để thử phản ứng coagulase của vi khuẩn S aureus
+ Chuột bạch khỏe khối lượng tỷ lệ 18 – 20 g/con
+ Nước muối sinh lý 0,9 %: Dùng để pha loãng mẫu
- Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: tủ lạnh, nồi hấp ướt, tủ ấm, buồng cấy
vô trùng, pipetman, ống durham, bình tam giác các loại, đĩa petri, cân, que cấy, bông cồn, giá đựng, ống nghiệm đựng mẫu, túi nilon, cối, chày sứ và các dụng cụ thí nghiệm khác
- Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Pulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ sinh học môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học
- Khoanh giấy kháng sinh
2.3 Cặp mồi sử dụng
Trang 19Cặp mồi đặc hiệu được sử dụng cho phản ứng PCR nhân các đoạn gen đích được thiết kế dựa trên trình tự chuẩn của đoạn gen SEB trên ngân hàng gen quốc tế NCBI (phụ lục 2.1 kèm theo)
Bảng 2.1 Cặp mồi sử dụng nghiên cứu
2.4 Phương pháp nghiên cứu
Để thực hiện đề tài này chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu thường quy định trong phòng thí nghiệm được chuẩn hoá theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn quốc tế (ISO)
2.4.1 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm
Chúng tôi sử dụng phương pháp lấy mẫu được tiêu chuẩn hoá theo TCVN [9]
- Thu thập mẫu thịt theo phương pháp ngẫu nhiên từ các quầy bán thịt ở các chợ trong Thành phố Thái Nguyên
- Với mẫu thịt: Lau dao bằng cồn 700, sau đó dùng dao cắt lấy 200gram thịt/mẫu; cho mẫu vào túi nilon vô trùng và ghi nhãn có các thông tin cần thiết
100-2.4.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn S aureus trong 1gam thịt
lợn tươi trên thạch Chapman
Theo TCVN [10]
- Đồng nhất và pha loãng mẫu: Cân 1g thịt tươi (không lấy mỡ) nghiền nát trong cối sứ, nghiền tiếp bằng máy xay thịt, cho vào bình tam giác bổ sung 9ml dung dịch nước muối sinh lí, được độ pha loãng 10-1 Ly tâm
Trang 20- Đếm số khuẩn lạc S aureus (khuẩn lạc có dạng S, trơn nhẵn, bề mặt
vồng, rìa gọn, tròn, màu vàng) Chỉ những đĩa thạch sau khi cấy 37o
C/24h (với 0,1ml dịch nuôi cấy) có ít nhất 30 khuẩn lạc và không quá 300 khuẩn lạc mới được chấp nhận Tính kết quả theo Quinn.P.J et al (1994) [26]
2.4.3 Phương pháp xác định một số đặc tính hoá sinh của S aureus
2.4.3.1 Xác định khả năng dung huyết trên thạch máu
Sử dụng que cấy cấy ria khuẩn lạc S aureus đã phân lập được trên thạch máu Quan sát khả năng dung huyết của từng chủng
2.4.3.2 Xác định khả năng làm đông tụ huyết tương thỏ (phản ứng coagulase)
Cho một lượng khuẩn lạc S aureus vào dung dịch huyết tương thỏ Nuôi
ở 37 độ C quan sát sau 2h, 4h, 6h, 8h, 12h, 24h [8]
2.4.3.3 Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập được
* Môi trường BHI (Brain Heart Infusion)
Cách pha: Cân 27 gram môi trường BHI vào 1000 ml nước cất
Lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn
C trong 24h
Trang 21Sau đó tiến hành tiêm phúc mạc chuột bạch với liều lượng 0,5ml canh trùng/con Theo dõi 7 ngày sau khi tiêm Khi chuột chết, tiến hành mổ khám bệnh tích và phân lập vi khuẩn và nuôi cấy lại trên môi trường Chapman
Đối với chuột bạch đối chứng: Tiêm phúc mạc với liều lượng 0,5ml/con dung dịch BHI nguyên chất Theo dõi 7 ngày nếu chuột chết, tiến hành mổ và khám bệnh tích và nuôi cấy lại trên môi trường Chapman
2.4.4 Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và
hóa dược của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus
* Nguyên lý chung
Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có độ mẫn cảm khác nhau đối với kháng sinh trị liệu, biểu hiện ở sự khác nhau về đường kính (ф) vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh trên môi trường nuôi cấy
* Mục đích
Tìm hiểu tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh sẽ giúp ích rất nhiều cho phương hướng điều trị, lựa chọn kháng sinh đặc hiệu, góp phần đánh giá thực trạng tính kháng thuốc của vi khuẩn
- Đặt khoanh giấy kháng sinh, khoảng cách đều 2cm, mỗi đĩa thạch đặt
tỷ lệ 6-8 khoanh Bồi dưỡng đĩa thạch ở 370C/24h, đọc kết quả dựa trên đường kính vòng vô khuẩn
+ Rất mẫn cảm: ф > 20 mm
+ Mẫn cảm trung bình: ф tỷ lệ 15-20mm
+ Mẫn cảm yếu: ф tỷ lệ 10-14 mm
Trang 22+ Kháng thuốc: ф < 10mm [26]
2.4.5 Phương pháp tách DNA tổng số
Nguyên lý:
Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm,
mà quan trọng nhất là protein Sự tách chiết DNA dựa theo nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước) Mục đích là thu được các phân tử nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase và RNase) Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận nucleic acid dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn
Tiến hành:
- Ly tâm dịch khuẩn nuôi qua đêm với tốc độ 8000v/p trong 7 phút, thu cặn loại bỏ dịch
- Bổ sung 1540 μl extraction buffer vào mỗi mẫu
- Bổ sung 5 μl protease K vào mỗi mẫu, đem lắc ở 37oC trong 90 phút
- Bổ sung 60 μl SDS 20%, ủ ở 65oC trong 120 phút, có đảo trộn
- Bổ sung 600 μl CI (Chloroform isoamylalcohol), spin down, ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4oC, sau đó thu pha trên ra ống eppendorf mới
- Lặp lại bước trên
- Kết tủa DNA bằng 350 μl Isopropanol ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ
- Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4oC, thu tủa
Trang 23- Rửa tủa bằng 500 μl Ethanol 70%, ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở
có khác là dùng nhiệt độ cao (95oC) để biến tính chuỗi DNA sợi kép, kết hợp
với Taq DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp
cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động Kỹ thuật PCR nhân bản lượng lớn DNA chỉ với một lượng nhỏ DNA ban đầu
Tiến hành:
- Sau khi đo nồng độ DNA khuôn , tính và tạo các nồng độ DNA của các mẫu như nhau để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích DNA khuôn được giống nhau, và đạt khoảng 50ng trong tổng thể tích là 25µl/ 1 phản ứng
- Tính lượng thể tích các thành phần khác trong phản ứng , trộn đều các thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn DNA
- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy Phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Trang 24dNTPs (10mM) 2,5
Taq DNA polymerase (2.5u/µl ) 0,25
Trang 25- Cân đoạn gel vừa cắt được và xác định thể tích đoạn gel này theo quy ước 1mg trọng lượng sẽ tương đương với 1µl thể tích
- Bổ sung dịch kết gắn DNA vào ống Eppendorf chứa đoạn gel vừa cắt, theo tỉ lệ: Vmẫu:VGB = 1: 3
đến khi gel tan hoàn toàn
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết DNA và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút Loại bỏ dịch chảy qua cột
- Tiếp tục bổ sung đệm rửa 500µl WB (Washing Buffer), ly tâm 13000 v/p trong 1 phút Loại bỏ dịch chảy qua cột Ly tâm thêm 1 lần nữa trong vòng 1 phút để loại đệm WB
- Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5ml Bổ sung 25 µl nước khử ion khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút để thu DNA
2.4.8 Phương pháp đọc trình tự DNA trên máy đọc tự động và phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng
Trình tự nucleotid của gen SEB được xác định bằng phương pháp xác định trình tự gen tự động trên máy ABI PRISMR
3100 Avant Genetic Analyzer Tại phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về Công nghệ gen - Viện
Công nghệ Sinh học
+Phân tích kết quả:
- Kiểm tra kết quả thu được bằng phần mềm máy tính BioEdit 7.0
- Khai thác dữ liệu từ genbank để so sánh
- Xử lý và phân tích các trình tự đoạn gen seb có kích thước khoảng 336
bp của vi khuẩn S arerus bằng chương trình phân tích chuỗi BioEdit
2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu
Trang 26Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê sinh học theo phương pháp của Chu Văn Mẫn (2002) [1] áp dụng trên phần mềm Office - Microsoft Excel và hệ thống SAS 2000
- Số trung bình:
+ X =
n
X X
X1 2 n
=
n X
X X
S x
+ Với n 30
n n
X X
Trang 27Trong đó: S X : Độ lệch tiêu chuẩn
X : Giá trị các biến số
m X : Sai số của số trung bình
X : Số trung bình
2.4.10 Quy định kỹ thuật đối với chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt lợn tươi
Quy định kỹ thuật áp dụng đối với chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt lợn tươi được áp dụng theo TCVN 7046:2002
Bảng 2.2: Tiêu chuẩn vi sinh vật của thịt tươi (TCVN 7046: 2002)
Trang 28CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Khảo sát tình hình giết mổ và xác định chỉ tiêu S aureus trong thịt
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn
trên địa bàn thành phố Thái Nguyên
Tỷ lệ quầy đạt yêu cầu kiểm dịch thú y
Số lượng lợn giết thịt trung bình (con/ngày)
X ± m X
Khối lượng thịt tiêu thụ trung bình (tấn/ngày)