Mục tiêu của đề tài: Xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn S. suis gây bệnh viêm phổi và viêm khớp ở lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên. Nghiên cứu chế tạo Autovaccine thử nghiệm phòng viêm phổi và viêm khớp cho lợn từ các chủng S. suis phân lập được và thử nghiệm các phác đồ điều trị bệnh viêm phổi và viêm khớp cho lợn do S. suis gây ra có hiệu quả cao, góp phần thúc đẩy chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên phát triển
ĐẠI HỌC THÁI NGUN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM NGUYỄN MẠNH CƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH Ở LỢN TẠI TỈNH THÁI NGUN VÀ CHẾ TẠO AUTOVACCINE PHỊNG BỆNH Ngành: Ký sinh trùng và Vi sinh vật học thú y Mã số : 9.64.01.04 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y THÁI NGUN 2019 Luận án được hồn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM ĐẠI HỌC THÁI NGUN Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Tơ Long Thành 2. TS. Nguyễn Văn Quang Người phản biện 1: Người phản biện 2: Người phản biện 3: Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm học liệu Đại học Thái Ngun Thư viện Trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN TỚI LUẬN ÁN Nguyễn Mạnh Cường, Tơ Long Thành, Nguyễn Văn Quang, Đỗ Hồng Anh (2018), "Kết quả xác định một số đặc tính sinh học của các chủng Streptococcus suis gây bệnh lợn tại tỉnh Thái Ngun", Tạp chí KHKT Thú y, 25(6), tr. 36 42 Nguyễn Mạnh Cường, Tơ Long Thành, Nguyễn Văn Quang, Nguyễn Quang Tuyên, Đỗ Hồng Anh (2019), "Phân lập, xác định serotype và độc lực của các chủng Streptococcus suis gây bệnh lợn tại tỉnh Thái Nguyên", Tạp chí KHKT Thú y, 26(2), tr. 67 73 Nguyễn Mạnh Cường, Tô Long Thành, Nguyễn Văn Quang, Nguyễn Quang Tuyên, Đỗ Hồng Anh (2018), "Kết thử nghiệm vaccine phịng viêm phổi, viêm khớp cho lợn ni tại tỉnh Thái Ngun", Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển Nơng thơn, Số tháng 11, tr. 130 135 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chăn ni lợn ở tỉnh Thái Ngun trong những năm qua phát triển nhanh về số lượng và được cải tiến nhiều về chất lượng, đáp ứng với nhu cầu tiêu dùng nội tỉnh và hướng tới xuất khẩu, góp phần giải quyết việc làm và tăng thu nhập cho người chăn ni trên địa bàn nên chiếm vị thế quan trọng trong phát triển kinh tế của tỉnh và đã trở thành ngành mũi nhọn được quan tâm phát triển Chăn ni lợn Thái Ngun chủ yếu là các trại quy mơ nhỏ nên gặp rất nhiều khó khăn đặc biệt là khâu kiểm sốt dịch bệnh nên ảnh hưởng lớn hiệu quả chăn ni. Ngồi các bệnh truyền nhiễm gây cho đàn lợn như lở mồm long móng, dịch tả, tai xanh… thì viêm phổi, viêm khớp ở lợn do vi khuẩn Streptococcus suis (S. suis) cũng xảy ra khá phổ biến và gây tổn thất về kinh tế cho người chăn nuôi. Bệnh do S. suis ở lợn với các biểu hiện bệnh lý như bại huyết, viêm phổi, viêm khớp, viêm não… dẫn đến tử vong, đặc biệt là ở giai đoạn lợn con sau cai sữa, làm ảnh hưởng tới tăng trọng, chất lượng con giống và tăng tỷ lệ loại thải Vi khuẩn S. suis đóng vai trị quan trọng trong gây bệnh hơ hấp viêm khớp lợn Nghiên cứu Nguyễn Thị Nội vả Nguyễn Ngọc Nhiên (1993) về hệ vi khuẩn đường hô hấp của 162 lợn mắc ho thở truyền nhiễm cho thấy Streptococcus chiếm tỷ lệ 74,0% Kết điều tra Đỗ Ngọc Thúy cs (2009b) từ những lợn khỏe ni tại trại, lợn được đưa tới lị mổ, lợn có triệu chứng viêm phổi, tai xanh hoặc viêm khớp, viêm não đều đã phân lập được vi khuẩn S. suis với các tỷ lệ khác nhau.Trong số các chủng vi khuẩn S suis phân lập phát thấy serotype gây bệnh quan trọng và phổ biến là 2, 7 và 9. Khơng chỉ gây thiệt hại trên đàn lợn, vi khuẩn S. suis cịn gây bệnh nguy hiểm cho người. Ở Việt Nam đã ghi nhận nhiều ca mắc và tử vong do mắc liên cầu khuẩn. Theo thống kê của Cục Y tế dự phịng (Bộ Y tế) trong năm 2017 cả nước ghi nhận 171 ca mắc bệnh liên cầu lợn, trong đó 14 người tử vong. Đặc biệt, trong tháng 6/2018 trên địa bàn tỉnh Thái Ngun có 3 ca mắc bệnh liên cầu khuẩn S. suis (Phương Nam, 2018). Những người bị mắc bệnh đều xác nhận là có tiếp xúc với lợn bệnh trong chăn ni, giết mổ, ăn thịt hoặc tiết canh lợn nhiễm liên cầu khuẩn. Xuất phát từ tình hình thực tế sản xuất và an tồn thực phẩm hiện nay, nhằm có hiểu biết đầy đủ hơn về vi khuẩn S. suis gây viêm phổi và viêm khớp ở lợn, làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu các biện pháp phịng, trị bệnh hiệu quả là một u cầu cấp thiết, góp phần nâng cao hiệu quả, tăng thu nhập cho người chăn ni lợn và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng, vì vậy chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Streptococcus suis gây bệnh lợn tại tỉnh Thái Nguyên và chế tạo Autovaccine phòng bệnh”. 2. Mục tiêu của đề tài Xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn S. suis gây bệnh viêm phổi và viêm khớp ở lợn ni tại tỉnh Thái Ngun Nghiên cứu chế tạo Autovaccine thử nghiệm phịng viêm phổi và viêm khớp cho lợn từ các chủng S. suis phân lập được và thử nghiệm các phác đồ điều trị bệnh viêm phổi và viêm khớp cho lợn do S. suis gây ra có hiệu quả cao, góp phần thúc đẩy chăn ni lợn trên địa bàn tỉnh Thái Ngun phát triển 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Là một cơng trình nghiên cứu có hệ thống về đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn S. suis ở lợn ni tại Thái Ngun. Nghiên cứu chế tạo Autovaccine từ các chủng S. suis phân lập được để phịng viêm phổi, viêm khớp cho lợn ni tại Thái Ngun có hiệu quả và đề xuất được phác đồ điều trị viêm phổi, viêm khớp cho lợn do S. suis cho hiệu quả cao Bổ sung và làm phong phú thêm dữ liệu khoa học, sử dụng làm tài liệu tham khảo trong giảng dạy và nghiên cứu về vi khuẩn S. suis gây bệnh ở lợn. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Sử dụng Autovaccine thử nghiệm tiêm phịng cho lợn ni tại tỉnh Thái Ngun đã góp phần giảm tỷ lệ lợn mắc viêm phổi, viêm khớp do vi khuẩn S. suis gây ra Áp dụng phác đồ điều trị bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn cho hiệu quả cao, góp phần tăng thu nhập cho người chăn ni và phát triển bền vững ngành chăn ni lợn tại tỉnh Thái Ngun Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để xây dựng các biện pháp phịng, trị bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn đạt hiệu quả 4. Những đóng góp mới của đề tài: Là cơng trình nghiên cứu có hệ thống đầy đủ vi khuẩn S. suis gây bệnh ở lợn tại tỉnh Thái Ngun Chế tạo thành cơng Autovaccine từ các chủng S. suis phân lập có hiệu quả trong phịng viêm phổi, viêm khớp cho lợn và xác định phác đồ điều trị lợn mắc viêm phổi, viêm khớp đạt hiệu quả cao được ứng dụng vào thực tiễn sản xuất chăn nuôi lợn tại Thái Nguyên Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn S. suis gây bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn phân lập được Autovaccine S. suis phịng bệnh viêm phổi, viêm khớp lợn 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu Các trang trại, gia trại chăn ni lợn tại các huyện, thành thuộc tỉnh Thái Ngun có lợn nghi mắc bệnh liên cầu khuẩn S. suis Phịng Vi trùng, Trung tâm Chẩn đốn thú y trung ương, Cục Thú y. Viện Khoa học Sự sống, Đại học Thái Ngun 2.1.3. Thời gian nghiên cứu Từ năm 2015 đến năm 2018 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu tình hình viêm phổi, viêm khớp ở lợn ni tại Thái Ngun Xác đị nh t ỷ l ệ l ợn m ắc và chết do viêm phổi, viêm khớp qua các năm t ại m ột s ố huy ện, thành tỉ nh Thái Nguyên từ năm 20152017 Xác định tỷ lệ mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp ở lợn nuôi tại Thái Nguyên theo mùa vụ và lứa tuổi từ năm 20152017 2.2.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng S. suis phân lập được Phân lập vi khuẩn S. suis từ lợn ni tại tỉnh Thái Ngun mắc viêm phổi, viêm khớp Xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được Xác định khả năng mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được Xác định serotype của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập 2.3.3. Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Autovaccine vô hoạt keo phèn từ các chủng S. suis phân lập Chọn chủng vi khuẩn S. suis dùng chế tạo thử nghiệm Autovaccine Nghiên cứu chế tạo Autovaccine từ các chủng S. suis lựa chọn Xác định đáp ứng miễn dịch lợn với Autovaccine thử nghiệm 2.2.4. Nghiên cứu biện pháp phòng trị viêm khớp, viêm phổi lợn do S. suis Thử nghiệm Autovaccine phòng viêm phổi, viêm khớp cho lợn được chế tạo từ các chủng vi khuẩn S. suis phân lập Thử nghiệm phác đồ điều trị viêm phổi, viêm khớp lợn do S suis gây ra. 2.3. Ngun vật liệu nghiên cứu Mẫu bệnh phẩm là phổi, dịch nhày họng, dịch khớp, dịch não tủy của lợn ốm hoặc chết có các triệu chứng, bệnh tích nghi mắc viêm phổi hoặc bệnh nghi do vi khuẩn S. suis như sốt, bỏ ăn, khó thở, ho, sưng khớp, thần kinh Chuột bạch khoẻ mạnh (18 20 gam/con); Lợn từ 56 tuần tuổi, khỏe mạnh chưa tiêm Autovaccine phịng viêm phổi, viêm khớp chế từ vi khuẩn S. suis Các loại mơi trường, hóa chất sử dụng theo quy trình nghiên cứu của Bộ mơn Vi trùng Viện Thú y và Trung tâm chẩn đốn thú y trung ương, Cục Thú y. Bộ Kit sinh hóa API 20 Strep dùng để xác định các đặc tính sinh hố và định danh vi khu ẩn S. suis (BioMérieux, Marcy l’Etoile, France). Giấy thử kháng sinh do hãng Oxoid (Anh) sản xuất Các loại hoá chất và sinh phẩm dùng cho các phản ứng ngưng kết, huyết thanh học và kỹ thuật PCR, phản ứng IHA Các loại thuốc kháng sinh như CefanewLA, Marflo45%, MarphamoxLA thuốc trợ sức GlucoKCNamin Công ty thuốc thú y Marphavet sản xuất. Chủng giống vi khuẩn S. suis chuẩn và các huyết thanh chuẩn tương ứng do Trung tâm chẩn đốn thú y trung ương, Cục Thú y cung cấp, dùng tham chiếu với các chủng vi khuẩn phân lập được trong phản ứng PCR và huyết thanh học Các dụng cụ thí nghiệm thơng dụng, buồng cấy vơ trùng, nồi hấp, máy ly tâm, máy lắc giàn, máy dùng cho phản ứng PCR dùng cho các nghiên cứu về vi trùng thuộc Trung tâm Chẩn đốn thú y trung ương, Cục Thú y và Viện Khoa học Sự sống, Đại học Thái Ngun. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mơ tả và dịch tễ học thực nghiệm của Nguyễn Như Thanh (2001) 2.4.2. Phương pháp lấy mẫu Bệnh phẩm là dịch nhày họng, dịch ổ khớp: Dùng tăm bơng vơ trùng ngốy sâu vào trong họng, ngáy vào dịch ổ khớp viêm của lợn ốm sau đó cho vào ống đựng tăm bơng, bảo quản 4 0C và chuyển về phịng thí nghiệm trong vịng 4 6 giờ Bệnh phẩm là phổi của những lợn ốm hoặc chết có triệu chứng, bệnh tích nghi mắc bệnh do vi khuẩn S. suis được cho riêng rẽ vào các túi nylon vơ trùng, bảo quản lạnh ở 4 0C và đưa ngay về phịng thí nghiệm để tiến hành ni cấy và phân lập vi khuẩn 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp ni cấy, phân lập và giám định vi khuẩn được thực hiện theo phương pháp thường quy Bộ mơn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia và Phịng Vi trùng, Trung tâm chẩn đốn thú y trung ương, Cục Thú y Phương pháp PCR để xác định các serotype gây bệnh của vi khuẩn S. suis và các gen mã hố một số yếu tố độc lực và theo Wisselink H.J. và cs. (2002b), Silva L.M. và cs. (2006), Đỗ Ngọc Thúy và Lê Thị Minh Hằng (2009a) Phương pháp tính LD50 theo Reed L.J. & Muench H. (1938). Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được trên động vật thí nghiệm của Sawade (1985). Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được theo Bauer A.W. (1966) Xây dựng phác đồ điều trị lợn mắc viêm phổi, viêm khớp căn cứ vào kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn S. suis để lựa chọn loại thuốc kháng sinh mẫn cảm cao, đang được phép lưu hành tại Việt Nam Phương pháp chế tạo Autovaccine thử nghiệm từ các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được theo quy trình của Bộ mơn Vi trùng, Viện Thú y Kiểm nghiệm vô trùng, an toàn hiệu lực của Autovaccine thử nghiệm theo TCVN 8684:2011 và QCVN 01:187 2018. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể lợn đã được tiêm Autovaccine bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) theo quy trình đánh giá vaccine của OIE (2018) 2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thu được trong q trình thực hiện đề tài được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trong chăn ni của Nguyễn Văn Thiện (2002), phần mềm Minitab (Version 14.0), Excel 2013. Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tình hình lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp từ năm 2015 2017 tại tỉnh Thái Nguyên 3.1.1. Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp từ năm 20152017 Bảng 3.1: Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp từ năm 20152017 Năm Viê Viê m m khớ phổi p Số Lợn Lợn Lợn Lợn Lợn lợn mắc chết mắc chết mắc điều Tỷ Tỷ tra Số Số Số lệ lệ (con) con (%) (%) 3.850 496 12,88 56 11,29 366 4.120 565 13,71 68 12,03 434 3.170 518 16,34 80 15,44 440 2015 2016 2017 Tính 11.140 1.579 14,17 204 12,91 1.240 chung Viêm phổi và viêm khớp Lợn chết 21 28 36 Tỷ lệ (%) 5,73 6,45 8,18 85 6,85 578 5,18 Tỷ lệ Số (%) 9,50 10,53 13,88 11,13 Tỷ Tỷ Số lệ lệ (%) (%) 153 3,97 2,61 207 5,02 2,89 218 6,87 3,66 Số 18 3,11 3.2.6. Kết quả xác định gen mã hóa yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được Kết quả nghiên cứu cho thấy trong số các gen mã hóa các yếu tố độc lực các chủng S. suis mang gen arcA chiếm tỷ lệ cao nhất (75,5%), tiếp sau là gen mrp (71,1%), gen sly (62,2%) và gen epf (57,7%). Có 5 kiểu tổ hợp gen mã hóa các yếu tố độc lực được xác định là: arcA/sly, arcA/mrp, arcA/epf, arcA/mrp/sly và arcA/mrp/sly/epf trong số 45 chủng S. suis nghiên cứu Kết quả nghiên cứu của chúng tơi tương đồng với nghiên cứu của một số tác giả như Đỗ Ngọc Thúy và cs. (2009) từ những lợn khỏe và lợn có triệu chứng viêm phổi, tai xanh hoặc viêm khớp, viêm não đã phân lập được vi khuẩn S. suis với các tỷ lệ khác nhau. Trong 211 chủng S. suis được nghiên cứu đã xác định được 18 loại serotype, phổ biến là serotype 2, 7, 9 và có 7 kiểu tổ hợp gen độc lực. Nghiên cứu Cù Hữu Phú cs (2013) cho thấy chủng thuộc serotype 2 có nhiều kiểu tổ hợp gen nhất, được phân bố rải rác trong 5 kiểu tổ hợp gen là arcA, arcA/sly; arcA/mrp; arcA/mrp/sly; arcA/mrp/sly/epf. Kết quả phản ứng PCR xác định gen mã hóa độc lực của các chủng S. suis phân lập được được trình bày ở hình 3.2 Ghi chú: M: 100 bp maker Giếng 1: Gen arcA Giếng 2: Gen mrp Giếng 3: Gen sly Giếng 4: Gen epf Hình 1: Kết quả phản ứng PCR xác định gen mã hóa độc lực của các chủng S. suis phân lập được 3.2.7. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng S. suis lựa chọn sau các đời cấy truyền Từ các đối tượng lợn như lợn con theo mẹ, lợn con sau cai sữa, lợn thịt, lợn nái hậu bị và nái nuôi con chúng tôi đã lựa chọn ra được 9 chủng S. suis đại diện cho các serotype gây bệnh lợn, gồm: 3 chủng thuộc serotype 2 (S.TN21, S.TN22, S.TN23); chủng thuộc serotype 7 (S.TN74, S.TN75, S.TN76) và 3 chủng thuộc serotype 9 (S.TN97, S.TN98, S.TN99) được phân bố 8 huyện/thành trong tỉnh Thái Ngun. Các chủng S. suis lựa chọn, sau 5 đời cấy truyền được kiểm tra đều thấy ổn định về đặc tính sinh vật, hóa học và phù hợp với các tiêu chí đánh giá theo Quy trình chẩn đốn bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra trên lợn (TCVN 84002:2010). Đây là những đặc tính quan trọng của một giống cấp I trong q trình nhân giống cấp III để sản xuất vaccine, bởi có thể đảm bảo và giữ ngun được các đặc tính sinh vật học của chúng qua các lơ giống khác nhau 3.2.8. Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng vi khuẩn S. suis lựa chọn sau các đời cấy truyền Qua bảng 3.7 cho thấy sau 5 đời cấy truyền các chủng vi khuẩn S. suis thuộc serotype 2 đều gây chết 100% số chuột thí nghiệm trong thời gian sau tiêm 24 giờ, trong đó có 66,67% chủng gây chết chuột từ 1224 giờ và 33,33% chủng từ 1824 giờ. Các chủng S. suis serotype 9 cũng gây chết 100% số chuột thí nghiệm trong khoảng thời từ 1224 giờ, trong đó có 33,33% chủng gây chết chuột từ 1224 giờ và 66,67% chủng từ 1824 giờ. Trong khi đó, chỉ có 33,33% chủng thuộc serotype 7 được kiểm tra gây chết 100% số chuột thí nghiệm sau tiêm từ 2436 giờ và 66,67% chủng gây chết 50% chuột trong vịng trước 3648 giờ sau khi tiêm. Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng S. suis trên chuột bạch sau 5 đời cấy truyền Ky hiêu ́ ̣ chung ̉ STN21 STN22 STN23 STN74 STN75 STN76 STN97 STN98 STN99 Thuộc serotype 2 7 9 Phân lập Kết quả Sô chuôt ́ ̣ lại VK Liêu tiêm ̀ Số chuột Thời gian tiêm Tỷ lệ (ml/ con) chết chết (con) (%) (con) (giờ) 0,5 2/2 18 24 100 0,5 2/2 12 24 100 0,5 2/2 12 24 100 0,5 1/2