CÁC kỹ THUẬT xét NGHIỆM cơ bản tìm nấm gây BỆNH

• Khi quan sát mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu nuôi cấy nấm dưới kính hiển vi, cần phân biệt nấm gây bệnh thật sự và nấm tạp nhiễm.. • Khi không tìm thấy nấm trong mẫu bệnh phẩm, không thể loại t

GVHD: CÔ GIA KHÁNH

CÁC KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM CƠ

BẢN TÌM NẤM GÂY BỆNH

I NGUYÊN TẮC

• Nếu phòng xét nghiệm có đủ điều kiện, nên kết hợp xét nghiệm trực tiếp và nuôi cấy nấm để có thể chẩn đoán xác định nấm gây bệnh.

• Nên quan sát mẫu bệnh phẩm cả đại thể lẩn vi thể

• Khi quan sát mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu nuôi cấy nấm dưới kính hiển vi, cần phân biệt nấm gây bệnh thật sự và nấm tạp nhiễm.

• Khi không tìm thấy nấm trong mẫu bệnh phẩm, không thể loại trừ khả năng nhiểm nấm mà cần phải xét nghiệm bệnh phẩm nhiều ngày liên tiếp và kết hợp với nuôi cấy nấm để

có thể có kết luận xác định.

4

II DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG

1 Dụng cụ:

- Kính hiển vi , dầu soi kính, Lam kính, Lamen

- Đèn cồn, que cấy kim hoặc que cấy cắt,

- Dao cạo, dao mổ, nhíp, kẹp, Kìm, băng dính, bơm, kim tiêm, tăm bông, pince … để lấy mẫu

- khăn gạc, kéo, bông, khay pipette, hộp petri

- Găng tay, khẩu trang

2 Hóa chất: Tùy kỹ thuật hoặc phương pháp mà có chuẩn bị dung dịch hóa chất phù hợp.

- Nước muối sinh lý 8,5% hoặc 0,9%

- Dung dịch KOH 10%, 20%, 30% tùy ý

- Mực tàu hoặc Parker đen N051

- Dung dịch nhuộm: Gram, xanh Methylen, giêm sa

- Phẩm xanh Lactophenol Coton Blue (LPCB)

6

II DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG

3 Môi Trường:

3.1 Thạch Sabouraud (Sabouraud dextrose agar):

Dùng để duy trì các lứa cấy và cấy trích biệt sơ khởi các mẫu thử Khi cần, thêm Chloramphenicol (50mg)

hoặc Cycloheximide (Actidione) 500mg hoặc cả hai vào môi trường để ngăn tạp nhiểm

7

II DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG

3 Môi Trường:

3.2 Thạch tim óc hầm (Brain Heart Infusion = BHI)

Môi trường có máu hoặc không có máu dùng để nuôi cấy nấm gây bệnh ở nhiệt độ phòng nhưng thường nhất là dùng để trích biệt và duy trì các lứa cấy nấm men, ủ ở 35-

370C

8

II DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG

3 Môi Trường:

3.3 Thạch bột bắp (Corn Meal Agar)

Dùng để phân biệt và định danh các loại nấm men, đặc biệt là Candida albicans

Ghi chú: để phân biệt Trichophyton rubrum và

Trichophyton mentagrophytes dựa vào sự thành lập

sắc tố (Trichophyton rubrumsinh sắc tố đỏ), người ta dùng môi trường này nhưng thay thế 1% Tween

80 bằng 1% Glucose

9

II DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG

3 Môi Trường:

3.4 Môi trường Chromogenic

Dùng để phân lập các loại nấm men và nhận dạng

trực tiếp candida albicans Nếu là candida albicans thì khuẩn lạc có màu xanh ngọc

10

II DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG

3 Môi Trường:

3.5 Môi trường Czapek dox agar:

Dùng để định danh các loại nấm sợi như Aspergillus, Penicillium…

11

II DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG

Dichloran 18% Glycerol (DG-18) Agar Potato Dextrose Agar with Chloramphenicol

• Những điều cần chú ý khi lấy bệnh phẩm

- Một số loại bệnh phẩm phải được y Bác sĩ chuyên khoa lấy

như mẫu sinh thiết, dịch não tuỷ, dịch cổ tử cung…

- Một số bệnh phẩm do kỹ thuật viên lấy: Bệnh phẩm ngoài da, tóc, móng, mủ, máu…

- Bệnh phẩm do bệnh nhân tự lấy: Phân, nước tiểu, khí hư,

Một số loại bệnh phẩm thường chẩn đoán nấm

● Bệnh phẩm ngoài da: Dùng cồn 700 hoặc cồn iod sát khuẩn vùng da nghi nhiễm nấm, dùng lưỡi dao mỏng

cạo bờ của tổn thương cho các vẩy da rơi lên tiêu bản hoặc vào đĩa petri vô khuẩn

14

● Bệnh phẩm tóc: Chọn những sợi tóc mất bóng, xốp,

mất màu, dễ gẫy hoặc sợi tóc có những hạt đen hay

trắng bám chặt vào sợi tóc Tóc được cắt thành từng

đoạn ngắn khoảng 1cm

● Bệnh phẩm móng: Dùng cồn 700 hoặc cồn iod lau

sạch móng bị nhiễm nấm, dùng dao vô khuẩn cạo móng hoặc cạo chỗ móng bị sùi vào tiêu bản hoặc đĩa petri vô khuẩn

15

Một số loại bệnh phẩm thường chẩn đoán nấm

● Bệnh phẩm đờm: Sau khi bệnh nhân ngủ dậy, xúc

miệng sạch rồi khạc đờm vào dụng cụ vô khuẩn có

miệng rộng và đậy nắp

● Bệnh phẩm là các chất dịch, mủ, nước tiểu: Có thể

dùng que tăm bông vô khuẩn để lấy mủ, dịch hoặc lấy nước tiểu giữa dòng vào dụng cụ vô khuẩn

● Bệnh phẩm dịch não tuỷ, dịch màng phổi, mụn

bọc, máu: Dùng bơm kim tiêm vô khuẩn chọc hút

dịch hoặc máu

● Cấy tìm nấm: lấy 5ml máu tĩnh mạch, cho vào chai

có 50ml BHI hay Trypticase Soy, ủ ở 370C

16

Một số loại bệnh phẩm thường chẩn đoán nấm

● Mẫu sinh thiết: Được chia làm 2 phần:

– Một phần cho vào dung dịch NaCl 0,85% để

làm xét nghiệm tìm vi nấm

– Một phần cho vào dung dịch cố định

(formalin), để làm tiêu bản giải phẫu bệnh lý.

● Phân: Lấy mẫu phân vào lọ miệng rộng vô trùng

với ít nước muối sinh lý đánh tan ra Lấy 1 – 2 giọt lên lam kính, soi tươi dưới kính hiển vi.

17

Một số loại bệnh phẩm thường chẩn đoán nấm

IV KHẢO SÁT TRỰC TIẾP

Cần quan sát trực tiếp mẫu bệnh phẩm bằng mắt

thưởng hoặc bằng kính lúp trước khi tiến hành xét

nghiệm để phát hiện những chổ có đóng váng vàng ,

mũ, máu hoặc chất hoại tử (nếu có), nên lấy các chất

này đẻ soi trực tiếp và nuôi cấy

Trường hợp nghi do mycetoma, cắt nhỏ bệnh phẩm soi dưới kính hiển vi tìm hạt trước khi xử lý bệnh phẩm

18

- Dùng các loại bệnh phẩm lỏng: đàm, huyết trắng,

mủ, phết họng,…

- Pha loãng bệnh phẩm trong NaCl 0.85% vô trùng

- Nhỏ 1 giọt bệnh phẩm đã pha loãng len lam

- Đậy lamen rồi soi ở vật kính 10X, 40X

- có thể thấy hình ảnh nấm sợi hoặc nấm men trong tiêu bản

20

1 Khảo Sát với dung dịch nước muối sinh lý:

IV KHẢO SÁT TRỰC TIẾP

- KOH làm mềm tổ chức, căng giãn và làm trong tế bào, làm tan các hạt dầu mỡ trong bệnh phẩm.

- Để mẩu bệnh phẩm đã xử lý vào giọt KOH

- Đậy lamen

- Để yên lam kính trong 15 – 30’ hoặc hơ nhanh lam kính trên đèn cồn khoảng 30’’ và để khoảng 5 – 10’

- Khảo sát dưới kính hiển vi vật kính 10X, 40X

- Có thể thấy hình ảnh nấm sợi hoặc nấm men trong tiêu bản

22

IV KHẢO SÁT TRỰC TIẾP

2 Khảo sát với dung dịch NaOH hoặc KOH 10%, 20 %, hay 30% (tùy trường hợp).

23

- Dùng để quan sát vi thể các lứa nuôi cấy nấm

- Trong dung dịch LPCB (Lactophenol Coton Blue): Acid lactic giữ nguyên cấu trúc nấm, phenol giết nấm, xanh cotton nhộm màu nấm

- Lấy một mảnh nhỏ khuẩn lạc nấm từ môi trường

nuôi cấy bằng que cấy cắt

- Đặt mảnh khuẩn lạc nấm lên lam kính

IV KHẢO SÁT TRỰC TIẾP

3 Khảo sát với dung dịch LPCB

(Lactophenol

Cotton Blue) hoặc xanh cotton:

Microsporum audouinii

Trichophyton rubrum

Aspergillus sp

- Mực tàu cung cấp nền màu đen để làm nổi bật hình ảnh tế bào nấm men trong suốt hoặc có nang, đặc biệt dùng để chẩn đoán nấm Cryptococcus neoformans.

- Nhỏ một giọt mực tàu lên lam kính

- Nhỏ một giọt bệnh phẩm (thường là dịch não tủy, chất xuất tiết) hoặc lứa cấy lên giọt mực tàu

- Dùng que cấy vô trùng trộn mực tàu và bệnh phẩm

- Đậy lamen

28

1 Nhuộm mực tàu

- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi

- Nếu mẫu nghiệm dương tính với Cryptococcus neoformans, sẽ cho hình ảnh tế bào nấm men có nảy chồi hoặc không, được bao bọc bởi một nang trong suốt, nổi lên trên nền đen của mực

- Cần phân biệt tế bào nấm Cryptococcus

neoformans với hình ảnh bạch cầu: rìa cạnh của

quầng quanh bạch cầu không đều đặn và tế bào bắt

màu nhợt nhạt

29

1 Nhuộm mực tàu

Nấm Cryptococcus neoformans quan sát với mực tàu

- Thường dùng cho các bệnh phẩm lỏng hoặc ướt

- Nhộm Gram thường cho kết quả kém khi xét

nghiệm nấm Có thể gây nhằm lẫn cho kỹ thuật viên

thiếu kinh nghiệm

- Thường dùng để chẩn đoán Canidida,Sporothrix, Malessezia (không nên dùng cho các loại nấm lưỡng

- Tẩy màu bằng Aceton 5 – 10 giây

- Phủ dung dịch Safranin O 5-10 giây

32

2 Nhuộm Gram:

- Rửa lại bằng nước cất

- Để khô, khảo sát mẫu tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính dầu

- kết quả cho thấy hình ảnh vi nấm bắt màu Gram

(+), không thấy rõ cấu trúc bên trong của nấm Nhuộm Gram thường cho thấy sợi của Nocardia và Actinomyces

mà các triệu chứng lâm sàng thường thấy giống bệnh

cảnh một bệnh nấm

33

2 Nhuộm Gram:

Nhuộm Gram của nấm Candida_albicans

- Chủ yếu nhuộm bệnh phẩm máu ngoại biên, tủy

sương để tìm vi nấm ký sinh nội tế bào như Histoplama capsulatum

- Phết bệnh phẩm lên lam kính

- Cố định

- Phủ giêm sa 10% lên lam chờ 5-10

- Rửa lại bằng nước, để khô

- Soi ở vật kính dầu

35

3 Nhuộm giêm sa:

- Rửa và hong khô

- khảo sát tiêu bản với vật kính dầu

- kết quả cho thấy Nocardia bắt màu đỏ

37

Ngoài các phương pháp nhuộm trên, có thể áp dụng các phương pháp nhuộm PAS, Calcofluor white, xanh toluidine…để tìm nấm gây bệnh.

4 Nhuộm kháng acid:

38

V NUÔI CẤY NẤM

• Đối với các bệnh phẩm có chứa nhiều Keratin (da, tóc, móng) cắt nhỏ đặt trực tiếp lên môi trường.

• Đối với các bệnh phẩm là chất tiết, chất lỏng (mũ, dịch não tủy, dịch cơ thể, nước tiểu) tùy theo yêu cầu nuôi cấy và tùy theo bệnh phẩm

mà sử dụng trực tiếp hoặc quay ly tâm lấy cặn Hoặc là hào bệnh phẩm với NaCl 0,85% rồi

dùng tăm bông hoặc que cấy ria cấy lên môi

trường.

1 Chuẩn bị

2 Cầm ống chủng bằng tay trái, đáy nằm trong lòng bàn tay.

3 Tay phải đốt que cấy

4 Tay phải mở ống chủng, hơ nóng miệng ống trên đèn cồn

5 Làm nguội que cấy bằng cách ấn đầu que cấy vào mặt

thạch ống chủng (chỗ không có khuẩn lạc).

6 Lấy một ít bệnh phẩm.

7 Ria hoặc cấy điểm lên mặt thạch tùy loại bệnh phẩm lỏng

hoặc rắn.

8 Đốt que cấy đậy ống nghiệm.

9 Ủ ấm (nhiệt độ tùy loại nấm)

41

Nuôi cấy nấm trên môi trường thạch nghiêng

• Thực hiện 5 bước đầu tiên như cấy trên môi trường thạch nghiêng.

• Tay trái cầm hộp thạch, hé mở nắp bằng ngón cái và ngón trỏ

• Ria hoặc cấy điểm lên mặt thạch tùy loại bệnh phẩm lỏng hoặc rắn, đậy nắp hộp

Sau khi nuôi cấy ta sẽ theo dõi nhằm mục

đích định loại hoặc nghiên cứu.

cần thuần khiết khuẩn lạc nấm; quan sát hàng ngày hình ảnh đại thể và vi thể của khuẩn lạc

nấm

43

44

Candida albicans trong Sabouraud agar46

Microsporum audouinii trong môi trường SAB

48

NẤM ASPERGILLUS

49

môi trường Sabouraud môi trường Czapek

Nấm Sporothrix trong môi trường tim óc hầm

50

Sporothrix schenckii phát triển trên

môi trường thạch Sabouraud

51

Trichophyton trong môi trường BHI

Trichophyton trên môi trường thạch mycobiotic

(Sabouraud Cycloheximide Chloramphenicol agar)

Trichophyton rubrum trong SAB 1- 10 day

* Phương pháp băng keo (băng keo scotch)

- Cắt sẵn một mảnh băng keo dài 1,5 cm

- Nhỏ 1 giọt LPCB hoặc xanh coton lên lam

- vô trùng que cấy, để nguội

- Đính mảnh băng keo vào đầu que cấy.

- Đưa đầu que cấy có băng keo vào ống/đĩa thạch, áp

nhẹ phía mặt dính của miếng băng keo lên bề mặt khuẩn lạc, lấy ra và áp dán miếng băng keo lên lam kính đã nhỏ sẵn giọt dung dịch LPCB/ xanh coton Đậy lamen, soi dưới kính hiển vi.

56

QUAN SÁT VI THỂ KHUẨN LẠC NẤM

57

Ngoài các Phương pháp phát hiện vi nấm như trên

ta còn một số kỹ thuật xét nghiệm tìm vi nấm khác như + Xét nghiệm sinh hóa

+ Phương pháp miễn dịch và sinh học phân tử

+ Tiêm vào thú nuôi phòng thí nghiệm.

58

Để Định danh Candida albicans ta có thể tiến

hành các thử nghiệm Test ống mầm, cấy trên môi

trường thạch bột bắp, môi trường CHROMagar